皮肤病理学的Orf病毒(马来西亚隔离)在小鼠体内实验接种在不同的站点,没有地塞米松管理

文摘

Orf副痘病毒属感染的临床表现常致命的山羊和绵羊尤其是当他们受到压力或受到不利的环境影响。这项研究调查了两个Orf的致病性病毒分离株(ORFV UPM1/14和UPM2/14)和主机响应在老鼠模型中通过使用不同的接种网站/没有接触过地塞米松。与地塞米松治疗作为免疫抑制剂可能模仿影响动物的应激状态。五组小鼠皮内注射0.2毫升的组织培养感染剂量50 (TCID₅₀)UPM1/14(组1)和UPM2/14(组2)背(1组;2组),耳朵耳廓(组1 b;组2 b)和唇连合(组1 c;组2 c)。剂0.2毫升UPM1/14管理动物用地塞米松治疗(n = 5;5毫克/公斤/天,腹腔内)和nondexamethasone (n = 5)组在背,耳朵耳廓,唇连合。无显著差异(p > 0.05)意味着病变中可观察到的分数在不同接种的群体之间的网站或dexamethasone-treated和参与团体。然而,有显著性差异(p < 0.05),平均地层厚度影响皮肤与UPM2/14隔离在接种后耳朵耳廓和唇连合。组织病理学检查发现角化病、棘皮症和气球样变性影响皮肤的老鼠。Orf病毒DNA的皮肤样本中,检测出的目标F1L以及B2L特异性基因聚合酶链反应(PCR)测定。 Intradermal inoculation with UPM1/14 or UPM2/14 isolate produced a mild skin lesion in mice, and there was no significant difference in orf disease manifestation despite variation of inoculation sites. Similarly, short-term dexamethasone administration gave no adverse effects on pathogenicity of orf virus isolates.

1。介绍

Orf病毒(ORFV)属于属副痘病毒属痘病毒科(PPV) (1]。的病因代理人传染性臁疮(CE),严重影响家畜和野生exanthematic皮炎小反刍动物(2]。子也报告了骆驼,骆驼科,鹿科家族的成员,和各种其它反刍动物。狗、猫、松鼠也可以感染羊痘疮病毒(3,4]。基于seroprevalence最近的一项研究,评价IgM抗体小反刍动物种群显示了更高的发病率比绵羊山羊(5]。疾病有人畜共患潜在尤其是那些与动物密切接触如兽医、农民、动物服务员,和游客(6- - - - - -8]。

Orf病毒通常收益访问宿主的组织损伤、断裂,皮肤擦伤和复制在再生表皮角化细胞9]。病毒复制导致水肿和肉芽肿性炎症的皮肤细胞(3]。羊痘疮是临床上公认的出现丘疹,囊泡、脓疱,快速增长的痂局限于嘴唇和枪口受影响的动物(10]。通常不是致命的传染性臁疮,病变通常2到4周内解决;然而,死亡可能结果如果继发细菌感染等并发症或蝇蛆病发展(11]。

患病率在羊群从CE可以达到70%的疾病是第一次发生6,12]。除了破坏国家和动物和动物产品国际贸易,CE的病变也会影响动物的优化的生产力和减少肉的市场价值,皮革,羊毛(8,13]。

动物免疫功能不全的、广泛的和复发并可能发生病变。这无疑将导致经济损失小牲畜的农民。虽然总临床体征可以作为一个很好的参考诊断疾病,然而,金本位是进行病毒分离和分子检测同样对许多其他病毒([14]Balakrishnan et al ., 2017)。

根据Cargnelutti et al。10),临床病变被成功复制伴随着病毒隔离ORFV接种的老鼠。最近,隔离的山羊的ORFV在马来西亚提供进一步的信息之间的关系与其他ORFV隔离从世界的其他地方6]。同时感染大鼠模型中最近的一项研究表明,不同的接种网站并使用地塞米松诱导的免疫抑制观察演示不同病理反应大鼠(15]。除了病毒在体外的细胞病理效应,有老鼠模型中缺乏信息对其致病性。

地塞米松抑制促炎介质产生的抗原递呈细胞的表达和临床广泛用于治疗各种炎症性疾病,如过敏、哮喘、自身免疫性疾病、败血症(16,17]。地塞米松的影响特别是糖皮质激素是多向性的直接基因激活和调节机制涉及通过绑定glucocorticoid-responsive基因组元素和间接影响通过与转录因子的相互作用和信号分子的调制;因此它是一个众所周知的现象,免疫抑制剂加剧疾病反响在自然和实验条件(18,19]。

在这项研究中,我们审查orf疾病病变的发展及其严重性后感染ORFV隔离在天真的主机和地塞米松治疗。两个马来西亚的致病性ORFV隔离在一个小鼠模型评估了使用不同的接种网站和地塞米松的/没有管理。这项研究提供了有价值的信息在马来西亚菌株的致病性ORFV未来研究其自然宿主。

2。材料和方法

2.1。样品处理和病毒滴定法()

痂样本感染山羊是均质10%磷酸缓冲盐(PBS)。暂停然后离心机在250 xg 1000 rpm 10分钟,上层的收集。抗生素被添加到上层清液浓度的青霉素10000单位/毫升和10000年μg / mL链霉素(HyClone^®)[6)存储在−80°C为进一步使用。上层清液中的病毒受到通过组织培养感染剂量滴定(TCID50)连续十稀释50% (来)是和100 ul每个稀释添加到支流24-well LT(羊睾丸)单层细胞培养板。板是孵化与病毒悬在37°C前1小时,用无菌PBS的新鲜DMEM媒体含有1%的边后卫。板是孵化在37°C和观察日常的证据细胞病变效应(CPE)细胞。1周后孵化,井显示视觉证据记录和TCID CPE的稀释₅₀据估计,使用方法之前被里德和Muench (1938)。

2.2。动物管理

前不久Balb / c小鼠重9克11克被用于这项研究。毕业典礼前的所有程序,老鼠被证实是免费的从Orf病毒和测试为阴性anti-orf病毒抗体使用酶联免疫吸附试验(ELISA)。老鼠随意。

2.3。伦理批准

所有试验程序进行根据实验动物保健和使用指南批准机构动物保健和使用委员会IACUC,马来西亚Putra大学(Ref:芬欧蓝/ IACUC / FYP.2015 / FPV.052)。人道的端点选择减少或终止疼痛或痛苦通过安乐死的动物。

2.4。实验设计

2.4.1。xperiment 1

总共35(35)小鼠使用。五作为对照组小鼠皮内注射0.2毫升无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)背,耳朵耳廓,唇连合。这些都是常见的病变发生在网站CE模仿orf疾病在其自然宿主。剩下的30老鼠分成两组老鼠每15日,组1 (UPM1/14接种)和组2 (UPM2/14接种)。每组5只老鼠皮内注射0.2毫升TCID₅₀UPM1/14和UPM2/14背(1组;2组),耳朵耳廓(组1 b;组2 b)和唇连合(组1 c;组2 c)。14天老鼠监控和安乐死后通过使用氯胺酮和甲苯噻嗪在50毫克/公斤+ 5毫克/公斤。图1总结了动物接种和分组的流程图。

2.4.2。xperiment 2

地塞米松的作用政府的致病性UPM1/14 ORFV隔离是评估。十五(15)小鼠用于本研究;5小鼠作为对照组注射0.2毫升无菌PBS背部皮内,耳朵耳廓,唇连合。剩下的10个老鼠分成两组,每组5老鼠;地塞米松组和non-Dexamethasone组。两组小鼠注射0.2毫升TCID₅₀UPM1/14孤立的背皮内,耳朵耳廓,唇连合。地塞米松组小鼠注射地塞米松(5毫克/公斤/天)腹腔内3天前病毒接种病毒后,持续了5天的挑战(图2)。所有的老鼠都观察了6天,安乐死使用氯胺酮和甲苯噻嗪在50毫克/公斤+ 5毫克/公斤剂量。

2.5。临床评分

所有的动物都是监控每天发展的orf病毒病的病变特征(充血、囊泡、脓疱和痂)和临床体征包括折边毛外套,响应性和眼放电进行评估。每一个指标得分为0(缺席),1(轻微),2(中度),和3(严重);表1显示得分协议的详细描述的用于评估相关的临床症状。

2.6。组织病理学检查

皮肤组织受感染老鼠收集在10%缓冲福尔马林,分段处理,嵌入式,。苏木精和伊红())过程对展示的一般形态的皮肤进行了所有的样品处理。幻灯片是在×100年、200年和400年的放大和图像被使用Moticam Pro 285如前所报道(5,15]。衬里上皮细胞的形态变化相应的皮肤被观察和记录。基底层层的厚度测量,计算所有样本芬欧蓝1/14和2/14和结果列表。

2.7。DNA提取和聚合酶链反应

皮肤组织受感染老鼠收集DNA提取利用Vivantis GF-1,商业标准DNA提取工具。病毒悬浮液从每个样品准备和DNA提取利用协议之前所描述的阿卜杜拉et al。6,20.]。DNA提取存储在−20°C到进一步使用。

标准PCR进行针对病毒的免疫原性蛋白,即B2L基因和F1L基因(阿卜杜拉et al ., 2015;(14,21])。这些基因编码结构和价值ORFV的复制过程。(描述的PCR过程之前20.)通过使用底漆集:B2L和F1L (B2L正向引物:5-ATG TGG 20 TTC TCT ATC-3移行细胞癌;甘氨胆酸B2L反向引物:5-TTA ATT答TGG CTT三大;F1L正向引物:5-ATG手枪CCA CCC棉酚ATC AC-3;和F1L反向引物:5-TCA CAC手枪GGC (CGT广汽CAG-3)。PCR过程完成根据制造商的指令(Novagen Toyobo,日本)。热循环是程序根据下列条件:95°C 2分钟作为初始活化步骤,其次是35周期为20年代94°C;50°C 30年代,20年代70°C,和最后一个周期为2分钟72°C。PCR扩增子在琼脂糖凝胶电泳,运行100 V 50分钟。这种凝胶是彩色的红色的安全核酸染色方法和DNA乐队在凝胶文档系统查看。

2.8。统计分析

收集的数据对损伤分数,临床症状评分和总结了地层厚度均值±S。E和使用IBM SPSS统计20进行统计分析。单向方差分析/克鲁斯卡尔-沃利斯H测试,在P < 0.05,执行。

3所示。结果

3.1。病毒的增长和滴定度

ORFV是生长在肝细胞和每天监测发展的细胞病变效应。病毒滴定度取决于(TCID₅₀10)^8.1公司芬欧汇川集团/毫升和10 1/14^7.2公司芬欧汇川集团/毫升2/14。不同开发阶段的CPE病毒接种后如图所示3。

3.2。临床症状

痂形成观察小鼠接种接种网站的背和唇连合5天后接种。所有的老鼠表现出临床症状,如减少了响应能力,折边外套,头发和眼部的放电。图4显示了一个代表典型的病变三接种感染小鼠的网站。

3.3。意思是病变评分

最高平均损伤测量 观察公司芬欧汇川集团的耳朵耳廓1/14之后,背侧病变的意味着什么 其2/14,至少测量 是观察到公司芬欧汇川集团的唇连合2/14。一般来说,平均病变评分观察接种的公司芬欧汇川集团的网站公司芬欧汇川集团1/14和2/14组没有显著差异(p > 0.05)(表2)。同样,总的意思是损伤分数之间的两个接种组没有显著差异(p > 0.05)(表3)。在此基础上观察,两种隔离可能有类似的致病性。图5显示每组的分布意味着病变评分的老鼠。

平均损伤测量折边的头发外套,警觉性被发现的 和 分别为dexamethasone-treated组,而零测量记录non-dexamethasone-treated组(表中的两个指标4);然而,临床体征的平均评分dexamethasone-treated组显著高于参与组的,但这种差异没有统计学意义(p < 0.05)。

然而,没有显著性差异(p > 0.05)在总意味着病变dexamethasone-treated和参与组织(表之间的分数5)。

3.4。组织病理学损伤

一般而言,角化病、棘皮症和气球样变性经常被观察到在所有实验小组。观察血管充血和血管炎在耳朵耳廓和唇连合,分别。炎症细胞如淋巴细胞和中性粒细胞和朗格汉斯细胞(图也观察到在某些皮肤部分6)。

最高平均地层厚度 在第二组实验的唇连合;这是紧随其后的是背 同一组2的实验;至少意味着地层厚度 被发现的耳朵耳廓组1的实验。一般来说,这表明,意味着地层厚度较高(p < 0.05)在耳朵的皮肤和公司芬欧汇川集团的唇连合2/14接种组和类似(p > 0.05)接种组(表背的6)。没有统计显著差异,尽管这种变化的观察测量。

组织病理学部分被感染的组织从小鼠有/没有地塞米松呈现在图7。早些时候报道,没有区别病变两组之间的分数。因此,这些老鼠的组织病理学病变观察到相似的群体接种ORFV UPM1/14和病变观察包括棘皮症、气球样变性,血管炎。

3.5。检测ORFV特定基因的PCR扩增

所有组的皮肤组织样本的接种后不同站点ORFV隔离显示积极的PCR扩增DNA乐队在1062个基点(代表F1L基因)和1199个基点(代表B2L基因)的大小(图8)。

4所示。讨论

一般来说,小鼠接种ORFV芬欧蓝公司芬欧汇川集团1/14或2/14隔离了orf疾病相关的开发和形成痂在背部和唇连合的老鼠从5天postvirus接种。有趣的是,组织病理学检查显示,病变发展的类型的老鼠没有完全类似于通常观察到其自然宿主的病变与山羊和绵羊。建立红斑的病变发展和进步形成斑点,丘疹,囊泡,脓疱,痂。类似的病变进展所观察和描述的其他研究Cargnelutti et al ., 201110,和阿巴斯和莫卧儿王朝,2014年(22),报道红斑的形成,斑点,痂,很少观察丘疹和囊泡的老鼠。Huda et al。23)观察到水泡和地壳发育完全的病毒接种后4天,持续了更长一段比本研究中观察到。相信这些变化发生由于感染病毒的毒株的差异研究或由于免疫实验室老鼠的应变的变化。的发生和重演orf和许多其他病毒性疾病尤其是试验装置可以受到多个因素的影响,比如年龄,品种,和动物用作病毒感染模型(4,24]。

皮肤损伤的严重程度观察各种接种地点相近。组织病理学显示没有区别的意思是病变评分三个接种网站之一。山羊和绵羊,Orf病变通常观察到唇连合,通常暴露于带刺的“粮仓”,可能会产生擦伤在放牧,使病毒穿透皮肤和复制6,13]。虽然没有总平均病变评分,差异有显著性差异的地层厚度这两个芬欧蓝ORFV诱导接种后隔离耳朵耳廓和唇连合。背、耳朵耳廓和唇的公共网站,病变明显是连合山羊和其它小反刍动物。因此,皮肤病理学评估通过使用这些接种地点很重要,适合测定病毒致病性和宿主细胞反应在动物感染模型的精确测量。根据其他研究,这种方法是可行的和非常常见的测量直接宿主应对许多病毒和微生物菌剂(25,26]。在前面的研究中使用大鼠模型,观察到一个更高的皮肤病变评分是老鼠的接种ORFV芬欧蓝(1/1415]。区别不是小鼠模型,观察到的现象可以归因于不同的动物物种。由于ORFV epitheliotropic病毒复制在新的人口增殖角化细胞,在进入敏感细胞,orf病毒会导致表皮增生导致增加地层厚度(27]。地层厚度将反映病毒复制的程度和组织的严重程度有关。地层厚度更可靠的估计,因为病变评分是很主观的。因此,芬欧蓝2/14分离致病似乎比其1/14。需要进行进一步的研究来确定这些病毒分离株的毒力相关的因素。像其他病毒引起的疾病,有必要重新考虑可能影响致病性的差异因素,免疫反应和免疫18,28]。是相当有趣的决定的能力orf病毒在细胞株生长的原始主机可能影响体外细胞生长。准备适当的细胞系对病毒增长和其他可能的应用程序可以很容易地进行其他研究中描述(29日,30.]。组织病理学损伤在这项研究中观察到如角化病、棘皮症,和气球样变性与以前的报告一致Kinley et al ., (31日]ORFV感染山羊和老鼠15]。棘皮症在几乎所有的样本观察ORFV编码病毒血管内皮生长因子(VEGF),导致内皮细胞增殖,血管渗透性,和血管生成,从而增强上皮增生(32]。然而,嗜酸性包涵体中,并未观察到在目前的研究中获得的皮肤部分。根据Barraviera [33),嗜酸性包涵体明显的感染细胞的细胞质,但可能不是一个一致的功能orf病毒引起的病变。

众所周知,地塞米松抑制细胞免疫和体液反应动物;他们的行为通过抑制基因编码几个细胞因子,白介素1 (IL - 1)、IL 2, 3, 4, 5, 6, 8, tnf,最重要的是- 2。减少细胞因子的生产将减少T细胞增殖(34- - - - - -36]。他们也通常导致B细胞和受体- 2 - 2的表达少量。这将减少B细胞克隆扩张和抗体合成(35]。另一方面,免疫抑制诱导地塞米松政府之前和之后ORFV接种并不影响病变的严重程度中观察到的老鼠。这与我们最近的研究在大鼠模型中,在感染的老鼠dexamethasone-treated任何人芬欧蓝ORFV隔离显示病变分数和棘层厚度高于non-dexamethasone-treated老鼠。两项研究之间的差异可以归因于不同的反应的老鼠以来地塞米松地塞米松政府的持续时间短。长期管理展示了地塞米松抑制T细胞增殖以及细胞因子的生产从CD4 + T细胞激活37]。CD4 + T细胞已被证明在ORFV间隙发挥关键作用[38]。ORFV病变通常局限或本地化的某些部分动物尸体,体液免疫细胞对病毒的详细作用间隙和疾病恢复应定义为其他传染病28,39]。

方法采用开放的两个隔离病毒在这项研究(UPM1/14和UPM2/14)在两个不同的治疗组是评估可能的差异在两个分离株的致病性地塞米松的影响下进行后续研究。使用地塞米松诱导免疫抑制不仅局限于研究等寄生虫病的病毒也有关,更高的幼虫负担一直在观察(40- - - - - -42]。这项研究表明,政府地塞米松从3天到14接种后没有改变课程和持续时间的orf病毒引发的病变的发展。首先,它发现用地塞米松治疗并没有减轻orf病毒感染小鼠的临床体征,如改变折边的皮毛,减肥,缓慢的呼吸。dexamethasone-treated和dexamethasone-untreated orf病毒感染BALB / c小鼠呈现相同的持续时间和相似的临床症状的严重性。连续每天用地塞米松治疗也没有明显影响的病毒从被感染的老鼠中恢复过来。因此,目前的数据表明,美国政府的地塞米松后2 - 7天orf病毒感染不影响病变的发展既不影响严重性病毒诱导的小鼠模型。徐et al。16和范Woensel et al。43)表明,地塞米松的日常管理(0.6 mg·公斤⁻¹·天⁻¹细支气管炎患者)产生了有益的影响由呼吸道合胞病毒感染引起的。另一个最近的研究表示,表明低剂量的甾体化合物(1 - 2毫克公斤⁻¹·天⁻¹)一个更长期可能受益的动物,同时减少潜在的系统性副作用(16,17]。目前的结果表明,日常管理5毫克公斤⁻¹地塞米松在感染后3 - 7天没有抑制急性病变发展的orf病毒感染的老鼠。两个马来西亚生产的orf病毒隔离类似病变基础上得分在我们最近的研究报道(20.]。因此ORFV UPM1/14隔离选择和评估的致病性与政府一起地塞米松作为模仿的动物在应激状态(16,26]。在这项研究中,发现ORFV实验感染小鼠的皮肤样品通过PCR扩增定位在两个重要基因B2L F1L。本同意以前的工作由阿卜杜拉et al ., (6),他们报道的相关性F1L和B2L基因鉴定和分子特性的山羊的羊痘疮病毒。PCR技术是众所周知的生产快速ORFV证实试验。该方法推荐给合适的探测和识别病原体通过使用特定的基因;因此,成功确认PCR阳性病例的同意(21,44,45]都在独立研究证实CE病毒检测主要通过基因orf病毒复制所必需的。一个放大基因产物可以用作重要的遗传物质进行进一步的遗传分析和基因表达研究[46- - - - - -49尤其是对其基因功能。这种方法采用了研究疱疹病毒等病毒,细菌和真菌(Balakrishnan et al ., 201750])。

5。结论

马来西亚ORFV隔离的皮内接种Balb / c小鼠实验生产总值和小鼠的组织病理学损伤。变化的接种致病性没有显著影响公司芬欧汇川集团ORFV隔离的老鼠。有趣的是,地塞米松政府病毒接种之前和之后没有显著影响疾病的发展,进步,ORFV-associated损伤小鼠。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

确认

这项工作由科技部支持的格兰特,技术和创新科学基金(MOSTI),生物技术集群02-01-04-SF2459(批准号5450820),格兰特Inisiatif Putra Siswazah(IPS)马来西亚Putra大学(批准号9488100)。

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