文摘

亚甲蓝(MB)在光动力治疗的意义与良好的微生物。以前,我们报道的抗真菌潜力MB白色念珠菌。本研究试图确定额外的MB对另一个普遍的人类病原体的抗菌效果,结核分枝杆菌(MTB)。我们探索,MB是有效地抑制增长分枝杆菌在15.62μg / ml尽管抑菌方式类似于其抑制真菌的性质。我们发现更多的细胞表面表型(菌落形态和细胞沉降率)只有在受损分枝杆菌。机械的见解表明MB导致能源依赖膜扰动白念珠菌和分枝杆菌。我们还证实,MB导致增强活性氧生成两个生物体可以逆转补充抗氧化剂;然而,DNA损伤只能观察到分枝杆菌。我们提供了证据,尽管生物膜的形成是打乱了在这两种生物,细胞只坚持人类上皮细胞抑制分枝杆菌。最后,rt - pcr结果显示良好的相关性与生化分析。在一起,除了完善MB在光动力治疗的作用,本研究提供了独特的见解抗菌行为模式在两个重要的人类病原体,假丝酵母和分枝杆菌,可以外推到提高我们理解寻找新的治疗选择。

1。介绍

在这种抗生素的时代,许多有效的药物已经开发或正在开发的治疗各种各样的传染病。但是真正的挑战是克服耐药性的平行进化,这也是新兴以相似的速度(1,2]。日积月累,细菌和真菌感染都是负责世界上死亡率的主要原因。在细菌感染、结核病(TB)是一种传染病在人类频繁,造成的结核分枝杆菌(MTB)和一个残酷的杀手细菌负责全球每年数百万人死亡(2]。同样,在真菌感染中,由于其机会主义性质,白色念珠菌是其中一个主要真菌病原体,免疫功能不全的疾病如艾滋病、糖尿病、器官移植、烧伤(3,4结核分枝杆菌,合并感染等生物(2]。目前化疗的长度和复杂性对结核病和真菌感染远非令人满意由于成本高,毒性,出现多药耐药性(MDR)结核分枝杆菌菌株白念珠菌这是当前治疗政权造成威胁。因此,需要效率的替代疗法抑制微生物的生长是必不可少的。

亚甲蓝(MB)被广泛用作染料在各种生物科学应用程序5,6]。MB已被用于诊断程序和治疗多种疾病,包括高铁血红蛋白症,氰化物,一氧化碳中毒,被认为是无毒(7]。此外,由于其光吸收性质,MB已广泛应用在光动力治疗8]。以前我们演示了MB的抗真菌潜力白念珠菌(9]。本研究揭示了额外的MB的目标白念珠菌不仅揭示了更深的见解anticandidal机制也提供足够的线索来解读其潜在抗结核分枝杆菌的代理模型,分枝杆菌smegmatis。我们探索MB是一种有效的抗菌剂白念珠菌和分枝杆菌与一些常见(膜破坏,氧化应激和生物膜抑制)和不同的(DNA损伤,细胞表面表型和细胞粘附)机制的行动。

2。材料和方法

2.1。媒体和生长条件

所有媒体化学品YPD(酵母提取物蛋白胨葡萄糖)白念珠菌和油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(OADC)分枝杆菌,四唑盐3 -4,5-dimethylthiazol-2-yl2,5-diphenyltetrazolium溴化(MTT),从Himedia购买,孟买。麦德布鲁克7 h9肉汤是购自BD生物科学(美国)。Calcofluor白色(CFW),焦碳酸二乙酯(DEPC) 4-morpholinepropanesulfonic酸(拖把),tri-reagent, DNase,溴化乙锭(EtBr)从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。新鲜的白念珠菌(SC5314)培养YPD媒体(2%葡萄糖、蛋白胨2%和1%酵母提取物)一夜之间在每个实验前30°C。同样的,分枝杆菌smegmatis,mc²155年,作为家长野生型菌株用于所有的实验。细菌维持7日h10琼脂补充10% (v / v)油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(OADC;BD Difco)和生长在麦德布鲁克7 h9 (BD生物科学)汤补充0.05%渐变- 80(σ),10%白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(ADC;BD Difco), 0.2%甘油(费舍尔科学)在100毫升玻璃瓶(Schott杜兰)和孵化37°C到OD_600年等于1.0。股票文化日志阶段细胞保持在30%甘油和存储−80°C。

2.2。最低抑制浓度(MIC)

麦克风的分枝杆菌是由刃天青微量滴定测定(瑞玛)板的方法10]。简单地说,100年μL麦德7 h9汤是放在每个好96 -好微量滴定板后的MB剩下的媒体,随后连续稀释1:2。100年μL细胞悬液(生理盐水的外径_600年0.1)被添加到每个盘子里。盘子在37°C 48小时孵化。48小时后30μl 0.02%的刃天青钠盐的解决方案是添加到每个好,又为进一步孵化2小时在37°C。

2.3。Static-Cidal化验

static-cidal试验,3分析文化准备和复制白念珠菌和m . smegmatis0.1 OD_600年被播种到新媒体补充MB的MIC值和孵化30°C和37°C,分别。第二天,100μl相同的文化被接种到新鲜的媒体没有MB和孵化24小时和OD_600年用分光光度计测量。

2.4。菌落形态

为白念珠菌镀、菌落形态是由细胞YPD琼脂板上存在subinhibitory MB(25的浓度μg / mL)由生长曲线实验(数据没有显示)和孵化30°C 2天。Postincubation,图片单独的殖民地被40 x放大。为m . smegmatis、菌落形态是决定如前所述11,12]。MB7H10平皿上镀,细胞补充10% OADC (BD Difco)和孵化37°C 2到4天subinhibitory MB的浓度(3.9μg / mL)由生长曲线实验(数据未显示)。Postincubation、图像的各个殖民地在10倍放大。

2.5。相对沉降

细胞沉降测量spectrophotometrically如前所述[13]。简单地说,一夜之间的文化白念珠菌接种到0.1 OD吗_600年控制和MB细胞治疗和允许发展到OD_600年达到1.0。的OD_600年从每个治疗和治疗文化测量每分钟到30分钟。为m . smegmatis、细胞沉降试验进行描述的其他地方(11,12]。文化在OD_600年1.0 - -1.4的控制和细胞治疗subinhibitory浓度(3.9 MBμ在媒体麦德g / mL)补充与OD ADC进行调整_590年1.0和保持泰然自若的在37°C。3点和22 h,上部1毫升OD被拔掉_590年测量。沉积被记录的差异测量增长率从零时间点单位时间间隔30分钟和计算图中描述的传说。

2.6。Propidium碘吸收

Propidium碘(π)膜防渗染料和被广泛用于区分细胞受损或nonintact等离子体膜从健康细胞12,14]。评估MB的质膜的影响白念珠菌(约1×10³cfu /毫升)和m . smegmatis,细胞对数生长期和暴露在MB (25μ和3.9克/毫升μg / ml, resp)。3小时30°C和温和的颤抖。随后,细胞收获和孵化50μ在黑暗中g / mlπ为15分钟;10μl细胞悬液被转移到载玻片,盖玻片覆盖,荧光显微镜下检查40 x (Coslab荧光显微镜)。

2.7。ROS估计

细胞被沾DCFDA检测活性氧簇(ROS)的存在所述其他地方(15]。白念珠菌细胞生长在YPD一夜之间在存在MB 30°C。染色后0.1μg / mL DCFDA 15分钟,染色细胞收集和清洗三次与PBS 5分钟。细胞ROS的存在的可视化检测荧光(Coslab荧光显微镜)放大40 x。为m . smegmatis细胞生长在麦德布鲁克7 h9汤没有(控制)和MB的存在,让它生长,直到它到达0.8 - -0.9 OD。细胞在13000 rpm收获15分钟和resuspended 1毫升的媒体和种植1 h在37°C(饥饿应激)用颤抖的。细胞被收获,用PBS 7.4 pH值,resuspended相同的缓冲,这样每个1毫升的PBS pH值8.5缓冲区包含3×10⁷细胞。DCFDA添加10毫米的最终浓度的细胞悬液和孵化37°C的30分钟持续的震动。洗后PBS缓冲液的pH值为7.4和再悬浮在同一缓冲区,这些细胞被观察到荧光显微镜激发和发射值在488 nm,狭缝5和540 nm,割开10 nm,分别在40 x。3毫米H₂O₂作为积极控制和抗坏血酸(AA)在2.5毫米作为抗氧化剂12]。

2.8。DAPI染色

细胞与DAPI染色检测DNA损伤所描述的其他地方(12,14]。对数生长期的细胞接种,一夜之间长大的MB在30°C假丝酵母和37°C分枝杆菌0.1和DNA损伤被染色μg / mL DAPI 15分钟。染色细胞收集和清洗两次1% BSA在PBS 5分钟后冲洗5分钟,0.1% BSA在PBS。细胞被可视化为100 x白念珠菌和40 xm . smegmatis与Coslab荧光显微镜。

2.9。生物膜和生物量估算

假丝酵母生物膜检查在硅板放置在96孔板的聚苯乙烯表面CFW染色(可视化)和生物量估算12-well板块。一夜文化准备和1×10的细胞悬液⁷细胞毫升⁻¹PBS和100年了吗μL在每个接种。盘子被孵化的37°C 90分钟坚持细胞表面。井与PBS轻轻洗2 - 3次90分钟后去除nonadhered细胞。生物膜是由200年暂停μL YPD介质浓度随着subinhibitory MB (25μg / ml)和一个控制没有MB粘附细胞的聚苯乙烯96 -孔板和板孵化24小时37°C。孵化后,井被清洗,除去任何浮游细胞和沾CFW可视化光学显微镜下生物膜的形成。生物量估算,preweighed硅表干后又重了生物膜的形成和权重计算的差异13,16]。

m . smegmatisbiofilm-forming潜在的定性、定量分析使用其它地方描述的微量滴定板方法(11,12]。简单地说,m . smegmatis一夜之间,文化被种植在麦德布鲁克37°C媒体,其次是转移100人μl在每个媒体的96孔板有或没有添加的药物。达成OD的文化_600年0.1被稀释(1:100)使用麦德媒体和100年μl每个稀释的文化是用移液器吸取到每个乘96孔的微量滴定板和孵化37°C 48 h。井用水冲洗,50μl 5毫克/毫升的麻省理工是补充道。盘子在孵化37°C 5小时,紧随其后的是洗PBS和100年的两倍μl DMSO溶液。的OD_570年使用分光光度计测量。定性分析,m . smegmatis生物膜形成麦德布鲁克7 h9培养基中没有(控制)和MB(3.9的存在μ在OD g / ml)_600年1.0和培养48 h在37°C 12-well板包含盖玻片。preweight的盖玻片与蒸馏水冲洗和干重的测定生物膜形成后,通过计算不同。1% CFW被添加到每个盖玻片,在室温下培养10分钟。然后盖玻片被冲洗PBS和可视化荧光显微镜下40 x。

2.10。细胞粘附

对聚苯乙烯板,细胞粘附试验相同的程序(如biofilm-forming定量分析中提到的)之后,除了主要治疗和参与细胞生长到OD_600年1.0和洗后nonadhered细胞,他们直接与肝癌和量化。另一方面,坚持也估计在人类口腔上皮细胞如前所述11- - - - - -13]。短暂,细胞成长为24小时37°C和resuspended 2毫升无菌PBS (pH值6.8)和洗两次离心(3000×g, 5分钟白念珠菌和10000×g, 15分钟分枝杆菌)。作者自愿捐赠的上皮细胞通过软刮用无菌棉签颊粘膜,轻轻搅拌,并与PBS洗两次。依从性分析是由混合1毫升每个悬挂在试管和孵化的MB在37°C下温和搅拌2 h。孵化后,两滴0.4%台盼蓝溶液和carbol洋红(3 - 5μl)分枝杆菌只有被添加到每个管和混合物轻轻摇动。彩色悬浮液在光学显微镜下检查x和100 x 40倍的放大,分别。

2.11。RNA隔离和rt - pcr

对RNA隔离13,17),这些细胞被稀释到50毫升新鲜的汤在OD_600年0.1 (10⁶细胞毫升⁻¹)缺席(控制)和MB和成长直到OD_600年1.0。RNA隔离是由试剂盒法和逆转录酶聚合酶链反应(RT)执行所述RevertAid H - kit(表达载体)。简单地说,5μg孤立的RNA DNase治疗37°C 30分钟和反应是通过添加1终止μl(25毫米EDTA和孵化65°C 60分钟。RNA随后影射与低聚糖(dT) 18互补脱氧核糖核酸合成的42°C 60分钟。逆转录反应被终止在70°C加热5分钟。合成cDNA产品(2μl)直接用于PCR扩增反应(50μl)使用基因特定的正向和反向引物(表1)。放大产品凝胶电泳和乐队的密度(感兴趣的基因)测量并量化了正常化的既定的肌动蛋白基因(ACT1)表示白念珠菌和16 s基因分枝杆菌。

2.12。统计分析

所有的实验进行了一式三份( )。结果报告为平均值±标准偏差(SD)和利用学生的分析以及中 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。MB抑制真菌的和Mycobacteriostatic自然

在我们之前的研究中,我们已经表明在体外抗真菌活性在100 MBμ克/毫升(9]。在这里,我们在另一个频繁的人类病原体,扩展我们的观察分枝杆菌。我们发现15.625 MB的抗细菌活性μg / ml足够足以阻碍增长m . smegmatis(图1(一))。有趣的是,MB显示其抗细菌效果,以低得多的MIC值相比,其抗真菌麦克风是观察到100年μ克/毫升。进一步,我们有检查是否cidal MB的抗菌效果或静态性质对生物进行测试。我们发现的抗菌性质MB假丝酵母以及分枝杆菌在本质上是静态的(图1 (b))。

3.2。MB导致受损细胞表面表型分枝杆菌但不是白念珠菌

膜MB的破坏性影响白念珠菌正如前面演示(9促使我们更仔细地检查各种细胞表面表型。为此,菌落形态的治疗和治疗(MB)白念珠菌细胞被观察到。图2(a)描述了在菌落形态没有明显的差异即使在MB的存在除了殖民地大小是控制细胞相比较小。细胞表面表型没有影响白念珠菌变得进一步明显,当我们使用一个基于光谱光度测量的试验来测量细胞的沉积率。再次,沉积的细胞生长在MB没有显示出相当大的差异的存在对控制(图2(b))。有趣的是,菌落形态m . smegmatis出现与明确的边界平滑控制细胞在细胞治疗的MB殖民地出现粗糙和干燥和未定义的边界(图2(c))。同样,存在的细胞沉降率增强MB分枝杆菌细胞(图2(d))。一些研究表明,这种改变在细胞表面属性可以是由于表面抗原的存在,也就是说,glycopeptidolipids也称为糖脂(18,19在分枝杆菌分别sp。。因此,它将会是很有趣的研究结核分枝杆菌糖脂水平以应对MB。因为包括独特的细胞被膜组件由于存在复杂的脂质,呈现其耐药性和致病性20.由于MB),改变细胞表面表型是至关重要的,因为他们可能会导致修改的细胞壁组件,反过来又影响细胞的相互作用以及其他相关属性。进一步的研究是需要找到观察表型缺陷的原因。

3.3。MB诱导膜扰动是依赖于能源的

接下来,我们研究是否MB的膜产生破坏性影响,观察从先前的研究14)是能源的依赖。众所周知,ATP提供能量的易位分子超过了膜。叠氮化钠是一种已知的ATP拦截器,减少大量的ATP减少针对细胞色素c氧化酶和绑定的网站之间的氧血红素铁和幼崽a3地区(21- - - - - -23]。确认膜破坏性的行动MB的能源依赖,π与叠氮化钠治疗细胞吸收试验进行的MB。π是一个已知的荧光染料通过膜只有在中断等情况,损坏,或有任何压力和结合核酸14]。我们观察到,白念珠菌和m . smegmatis没有接受治疗,细胞通过叠氮化钠,π吸收效率和显示荧光在MB描绘受伤膜的存在。然而,在细胞治疗与叠氮化钠没有细胞沾π(图3)。这一结果不仅证实了我们之前的假设膜中断白念珠菌由MB还建立了膜破坏MB是能源的依赖。此外,这一观点也适用分枝杆菌当类似的实验。因此,这些发现表明,能源是必不可少的膜MB的破坏性影响白念珠菌和分枝杆菌。

3.4。MB诱发氧化应激

以前,我们已经表明,MB的抗真菌作用可能是由于氧化还原状态的改变白念珠菌(9]。此外,MB被用于触发细胞氧化还原代谢在人类派生内皮细胞(24]。因此,我们扩展我们的观察和MB对证实了这种效应假丝酵母和分枝杆菌通过展示ROS生成的增加。DCFDA是一个氧化剂敏感探头显示绿色荧光ROS生成。我们探索MB治疗细胞显示增强的荧光相比,未经处理的细胞类似于细胞暴露于过氧化氢。此外,活性氧的形成是恢复存在的抗氧化剂(AA) MB治疗细胞(图4)。在感染期间,人类病原体必须克服不同host-mediated压力,尤其是与巨噬细胞的抗菌性。巨噬细胞产生抗菌活性氧和氮物种(ROS和RNS)通过NADPH氧化酶(NOX2 / gp9)和诱导一氧化氮合酶(25]。因此,MB导致氧化应激在两个测试人类病原体可以进一步用于治疗目的。

3.5。MB诱发DNA损伤分枝杆菌但不是白念珠菌

ROS生成导致氧化损伤是众所周知的对DNA损伤的原因26]。此外,增强活性氧生成从这个研究证明在病原体需要探索的DNA损伤反应MB。访问ROS生成是否会导致DNA损伤假丝酵母和分枝杆菌现场试验使用EtBr执行,一个已知DNA损伤剂,在没有生长缺陷的浓度假丝酵母细胞。我们观察到,白念珠菌没有显示出灵敏度不管MB(图的存在5(一个))。然而,当执行类似的实验分枝杆菌细胞,我们观察到灵敏度和MB在EtBr的存在(图5(一个))。进一步确认这个初步数据,DAPI染色法是一种荧光染料,优先执行绑定之间的现场损坏DNA小沟。我们的研究结果表明白念珠菌没有区别的DAPI染色MB治疗中可观察到细胞相比,未经处理的细胞(图5 (b))。有趣的是,我们发现分枝杆菌细胞治疗MB显示蓝色荧光与未经处理的控制没有荧光可与DNA损伤(图5 (b))。尽管DNA损伤的机制还没有完全阐明结核分枝杆菌在完善,DNA修复机制是必要的持久性主机(27,28]。这些观察证实,MB可以专门针对DNA修复反应机制分枝杆菌但不是白念珠菌尽管增强活性氧的生成病原体。

3.6。MB抑制生物膜的形成

微生物生物膜是一个防御性的强项;在其附近他们从抗生素治疗是安全的,可以创建一个不屈不挠的感染源。之前报道的数据(9]表明形态形成的抑制开关通过MB治疗强迫我们学习毒性因子,生物膜的形成。生物膜的形成是由三个独立的研究方法,即定量的生物膜通过MTT试验描述代谢活动,可视化的CFW染色的细胞,和干燥质量评估。所有三种方法表明,生物膜的形成在MB的存在显著地抑制病原体(数字6(一)和6 (b))。因此,MB的生物膜的形成是一个强有力的抑制剂白念珠菌和m . smegmatis。

3.7。MB抑制细胞粘附分枝杆菌但不是白念珠菌

初步的生物膜的形成,细胞表面高度有效。因此,微生物细胞需要遵循之前形成了成熟的生物膜,从而使细胞毒性依从性管理的另一个因素(11,29日]。首先,我们研究了细胞的依从性白念珠菌微量滴定聚苯乙烯表面和人体上皮细胞的MB。最少、细胞粘附抑制时观察到聚苯乙烯表面微量滴定(图7(一)上半部分)。有趣的是,尽管明显影响菌丝的形成的影响,我们发现MB没有显示出对胶粘剂性能的影响白念珠菌和真菌细胞可能坚持人类上皮细胞(图7(一)较低的面板)。当进行了类似的实验分枝杆菌水平,大大减少坚持微量滴定聚苯乙烯表面和人类上皮细胞观察当处理MB(图7 (b))。因为改变在细胞属性也与生物膜的形成和依从性和复合菌群作为一个已知的事实问题外的部分非结核分枝杆菌(特种加工)与糖脂(30.,31日),因此糖脂成分的变化可能会改变生物膜的形成或分枝杆菌的依从性。这些观察结果使我们相信,MB只在细胞粘附的有效抑制剂分枝杆菌而不是白念珠菌。

3.8。差异表达基因在MB

本研究报告的表型中断通过rt - pcr验证。霉菌酸是一个主要组成部分mycomembrane和分枝杆菌的标志有至关重要的作用在膜的渗透性32]。在我们的研究中,我们发现表达下调ACCD4基因在MB(图8),对霉菌酸的合成和生存至关重要m . smegmatis(33]。同样,在分枝杆菌catalase-peroxidase (KatG)是一种重要的蛋白质负责异烟肼的激活。它已经知道KatGp水平升高在氧化应激(34]。与此同时,我们发现的upregulationKatG基因分枝杆菌当处理MB(图8)。同样地,我们发现的差别,对这些基因联赛基因(图8)而著称的活动在DNA修复和复制35]。GPL基因负责生物膜的形成,菌落形态、和滑动的能动性36,37]。在我们的研究中,我们发现GPL中表达下调的MB(图8)符合MB抑制生物膜的形成和菌落形态改变。

在假丝酵母、菌丝的壁蛋白1 (Hwp1p)是一个重要因素显示毒性表现形态形成转换和生物膜的形成(38]。我们发现HWP1基因表达下调的假丝酵母细胞治疗MB(图8)。超氧化物歧化酶(SOD2)基因是一个重要的基因负责防止氧化应激(39]。通过rt - pcr证实SOD2基因表达下调的白念珠菌当处理MB(图8)。尼曼C2(NPC2)基因参与甾醇运输通过蛋白质膜相互作用[40]。结果发现,NPC2基因表达下调时对待MB(图8)符合MB诱导膜破坏。因此,所有的rt - pcr结果显示良好的MB诱导中断表型的相关性分枝杆菌以及白念珠菌。

4所示。结论

考虑到有限的可用抗真菌和抗细菌治疗伴随耐药性的增加,搜索的新需求,安全,有效的抗真菌和抗结核治疗是不可避免的。考虑到MB是FDA批准的染料,已用于各种治疗的选择,不同的抗真菌和抗细菌的机制MB(图9)在本研究将进一步帮助理解MB作为有前途的药物利用研究的未来。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

拉胡尔Pal和Moiz a·安萨里同样导致了这项工作。

确认

作者感谢约瑟夫·海特曼和Sarman辛格提供白念珠菌(SC5314)和m . smegmatis(mc²分别155)参考菌株作为慷慨的礼物。他们也感谢Rajendra普拉萨德,迪恩,学院科学、工程和技术,鼓励。