文摘
特拉肠杆菌科(CRE)生物出现中成为一个主要的全球公共卫生的威胁抗菌素耐药细菌的人类病原体。对如何不尽出现。不尽的表型特征之一是heteroresistance,临床与治疗失败的患者碳青霉烯。通过在体外whole-transcriptome我们追踪基因表达分析在两个不同的菌株(BR7 BR21) heteroresistant KPC-producing肺炎克雷伯菌,第一次接触杀菌浓度imipenem无毒介质增长紧随其后。在这两种菌株,第一反应就是由转移相关基因的表达在向那些参与糖酵解分解代谢的途径。这反应的是全球抑制转录变化涉及蛋白质翻译、折叠和运输,减少表达的基因编码脂多糖生物合成的关键时刻。出现高层特BR21分组人口前噬菌体(是1)中断ompK36与不可逆OmpK36孔蛋白的损失。另一方面,OmpK36 BR7损失是可逆的。两heteroresistant收购高级耐碳青霉烯的菌株与独特的和共享的逐步转录程序。碳青霉烯heteroresistance可能摆脱最自适应分组人口在人口的细胞发生一系列复杂的压力适应反应。
1。介绍
2013年,疾病控制和预防中心(CDC)指定的特拉肠杆菌科(CRE)作为“紧急威胁”病原体(1]。早在2017年世界卫生组织(世卫组织)包括不尽中“优先级1,关键”病原体耐药性细菌的全球优先级列表(http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteria-antibiotics-needed/en/)。不尽是后果严重的威胁,因为抗生素引起的感染都迫切需要新的治疗方法(1- - - - - -3]。最令人担忧的不尽的革兰氏阴性杆菌产生肺炎克雷伯菌" (KPC),广谱β内酰胺酶。碳青霉烯以及其他所有KPC使其失去活性β内酰胺药物。肺炎克雷伯菌,与卫生保健相关感染的常见原因设置,是最经常发现KPC-producer [4]。的基因编码的酶进行了几种类型的质粒,很容易传染给其他革兰氏阴性物种等大肠杆菌最重要的原因之一,community-onset感染(4,5]。
KPC-producing菌株有时错过了常规自动血压计敏测试(6- - - - - -10),通常建议由于异构亚种群在这些菌株(7,11- - - - - -14]。这样的亚种群可以适应不断变化的环境中(7,15- - - - - -18]。这些潜在不仅使他们的检测,也可以获得在活的有机体内高层阻力导致治疗失败和死亡率上升6,8- - - - - -10,19- - - - - -25]。事实上,与KPC-producing相关死亡率k .肺炎(KPC-Kp)感染在许多医院超过50% (6,20.,23,25]。KPC-Kp感染的有效治疗仍然是非常具有挑战性的6,8,20.,23,25,26]。
我们之前显示,暴露的carbapenem-heteroresistant KPC-Kp菌株杀菌浓度的imipenem导致可再生的,两相的模式几乎完全杀死的人口,其次是在20小时内恢复(h) (11]。最低抑制浓度(MIC)的imipenem恢复相比,人口的增长至少四倍人口的麦克风前imipenem曝光。这种高级耐药发生典型通过损失OmpK36孔蛋白,促进了imipenem的条目。
在这里,我们进行了本研究了解亚种群的heteroresistant KPC-Kp生存后,碳青霉烯的杀菌浓度。我们确定了连续的复杂与压力相关的转录变化这些KPC-Kp菌株进行,这与选择有关高层特细菌细胞群。此外,这个高层阻力似乎涉及超越药物失活机制KPC-mediated孔蛋白水解或药物排斥的修改。
2。结果与讨论
2.1。相关的一些基因突变中观察到两个无性生殖Carbapenem-Heteroresistant致命Imipenem曝光后菌株
我们比较两个临床株KPC-Kp (BR7和BR21) carbapenem-heteroresistant和携带 ;他们属于茎序列类型ST437-members ST258克隆复杂的全球最常见分布(27- - - - - -30.]。两株以前的imipenem heteroresistant行为特征(11]。他们有99.9%相似的基因组序列,不包括一个70 kb前噬菌体由BR21(表S1和S2)。我们还分析了整个基因组的2 h和8 h imipenem-exposed每个样本寻找突变与致命剂量imipenem曝光(表S2)。我们比较这些压力,因为我们之前观察到OmpK36孔蛋白合成它们之间的不同(11]。虽然没有应变产生致命的8 h后孔蛋白imipenem曝光,应变BR7恢复生产后的孔蛋白多个段落无毒媒体(恢复野生型imipenem磁化率),而应变BR21没有。唯一的主要区别的染色体序列imipenem-exposed样品未曝光的同行相比,由于低质量的组装和base-calling错误,主要是内部和周围移动遗传元素。一个例外是一个我中断的编码区中找到ompK368 h-exposed BR21样品,但不是在未曝光或2 h-exposed样品(表S2)。元素相同的染色体phage-encoded是100%1从SfIV (NCBI NC022749)位于一个P4前噬菌体区域(表被来自其他噬菌体的基因来源S1)。
2.2。不同转录反应是观察到两个无性生殖相关Carbapenem-Heteroresistant菌株致命Imipenem曝光后无毒介质增长紧随其后
尽管他们的基因和表型相似性,我们观察到一些显著的transcriptome-level差异两种接触imipenem其次是孵化后无毒介质。虽然都有相对较少的差异表达基因2 h后imipenem曝光(图1),BR21有两倍多的数量(1009)相比,差异表达基因BR7 (459) 8 h后曝光。均显示强烈的碳水化合物代谢的基因表达2 h后曝光(图1)。BR7也显示增加氨基酸代谢相关基因的表达和传输,而BR21显示增加了采集和铁代谢相关基因的表达和前噬菌体的基因。一般来说,如果是观察一个共享基因的差异表达这两种菌株,方向(向上或向下)协议(表S3)。
基因集的基因表达分析(GSA)显示显著的五和九KEGG orthology (KO)通路BR7 BR21,分别(图2)。BR7只有一个差异表达基因plasmid-encoded虽然BR21有14个差异表达基因在其两个质粒编码的接合转移,限制修改、DNA修复、和铁运输功能。的plasmid-mediated基因在序列100%相同的菌株和没有imipenem曝光后差异表达。
2.3。致命Imipenem暴露与微分编码代谢调控基因的表达途径
77个差异表达基因本体论注释归类为那些参与适应渗透和氧化应激,膜和细胞壁破坏,一般应激反应。我们确认90额外的与压力相关的差异表达基因调节子RegulonDB基于搜索,UniProt,其他人(表的工作S4,图3)[31日,34,35,37- - - - - -58]。这些基因参与不同种类的氨基酸,碳水化合物,蛋白质代谢,以及细胞壁生物合成和运输。渗透跟压力基因大于2倍的变化表达89年33(36%)和59例(36%)与应激反应相关的160个基因在imipenem-exposed BR7 BR21,分别,而药物未曝光的菌株(图3)。最强大的协会观察8 h imipenem暴露的菌株。
(一)
(b)
(c)
(d)
糖酵解的基因编码酶没有差异表达(BR7)或表达下调(BR21),除了最早的基因通路(图4)。因此,从糖酵解生成丙酮酸不太可能作为乙酰辅酶a的主要来源需要进入三羧酸循环。GSA表示基因在三羧酸循环的一个重要浓缩BR21(图2、表S3)。三羧酸循环的基因编码初始酶从柠檬酸合成酶(柠檬酸乙酰辅酶a和草酰乙酸的形成)和柠檬酸异柠檬酸显示增加的可逆转换表达式两株(图8 h-exposed样本4)。表达的基因的乙醛酸旁路循环,催化的aceBAK操纵子乙酸调解经济增长或脂肪酸缺乏葡萄糖,强烈增加BR7和BR21 [32,33,49,54,59]。8 h-exposed两株的表达也会降低样品的基因编码丙酮酸脱氢酶复合体(图4)。增加表达的基因编码转换的丙酮酸酯(丙酮酸氧化酶)在8 h-exposed BR21样品。基因编码转换的丙酮酸乙醛(丙酮酸脱羧化酶)是调节两菌株8 h-exposed样本。这些观察是一致的代谢转变从柠檬酸乙醛酸分流途径(49,59]。
大量的谷氨酸代谢基因显示强大的增强表达imipenem曝光(图5)。谷氨酸是碳和氮的主要来源,尤其是在osmotically强调细胞(34,35,43,60- - - - - -62年]。磷酸腺苷的基因盒(ABC) glutamate-aspartate运输车gltIJKL增加了表达所有imipenem-exposed样品BR7和8 h-exposed BR21样品。这些发现证实了GSA的菌株(表S3)。的glt(从编码谷氨酸合成基因α酮戊二酸和天冬酰胺)没有差异表达。相反,我们看到高层表达的基因在四个不同的分解途径,这可能导致谷氨酸和GABA生产副产物或产物(图5)。事实上,九个基因表达增加的六株2 h和8小时的接触中发现了这些途径。
我们还观察到的所有基因的表达增加转氨酶和glutamylated腐胺(图分解代谢过程5)。GSA支持重大的发现基因在这些途径(图的浓缩2、表S3)。GABA分流,这些通路的一个重要组成部分,琥珀酸源和NAD (P) H中形成腐胺降解途径进入三羧酸循环(34,43]。这些基因特征明显属于碳starvation-induced操纵子,csiD- - - - - -ygaF- - - - - -gabDTP(31日,34,35]。
所有的精氨酸和组氨酸分解代谢的通路中的基因形成谷氨酸被强烈的表达(图5)。GSA识别重要的浓缩精氨酸分解代谢的通路中的基因(图2、表S3)。第一个报告基因在这个通路RpoS-controlled [35]。
GABA和谷氨酸是第一批兼容期间迅速积累的溶质渗透压力和最主要的两个兼容的溶质在细菌(43,61年,62年]。谷氨酸诱发其他重要osmoprotectants的吸收。因此,我们观察到的增加表达的基因编码传输osmolytes甜菜碱和CRP-regulatedosmC,osmY脯氨酸转运体,putP(表S4)。
2.4。Imipenem暴露与微分表达式外膜蛋白基因的完整性、运输、处理,以及在全球抑制蛋白质的表达
我们之前报道,观察亏损OmpK36 8 h-exposed样本BR7和BR21从相对imipenem转换的关键因素对高层imipenem电阻(11]。突变体的损失carbapenem-heteroresistant表型没有获得高水平的imipenem阻力并没有废除这孔蛋白的生产63年]。我们没有发现的微分表达式ompK36在2 h-exposed B21样品,也没有在任何imipenem-exposed BR7样品(表S3)。的表达ompK35没有与imipenem不同曝光。事实上,ompK35已经非常低的表达即使在未曝光的样本,同意我们的前报告的缺失在sds - page分析(11]。
小分子rna已知控制外膜的合成名叫[45,64年,65年]。我们没有发现的微分表达式micF (ompK35),micC,或rybB (ompK36)。其他小型非编码rna控制的翻译已报告ompC在大肠杆菌(45,66年),但我们没有识别相似的序列中k .肺炎菌株。然而,在这两个菌株我们发现重要的微分表达式云母据报道,一个小RNA的控制下RpoE错误折叠蛋白质的积累,进而减少的稳定性ompA记录在大肠杆菌(图S1)[45]。
我们下一个研究基因的表达参与蛋白质加工和出口从细胞质到外膜。令人惊讶的是,尽管BR7只显示的表达增加clpA热休克和hflc例如蛋白酶基因8 h-exposed样本,BR21显示微分表达式在许多与这些功能相关的基因(图S1)。这些措施包括减少8 h-exposed样本的表达证券交易委员会编码基因,塞卡风和secY。Sec-dependent通路是重要的出口大部分蛋白质,包括β桶外膜名叫[37]。表达膜普遍压力蛋白B的积分(uspB)两株增加8 h-exposed样本。这种蛋白质是由rpo和碳饥饿和涉及传感和响应膜损伤(42]。RpoS-regulated, osmotically诱导蛋白质osmB,称为膜再密封作用,(40)增加了表达只在8 h-exposed BR21样品。
我们还发现减少编码核糖体蛋白基因的表达和翻译启动因素8 h-exposed样本的两株,表明全球抑制蛋白质的翻译(图S1)。这可能是一个额外的抗生素所强加的压力反应的影响,涉及细胞内稳态限制蛋白表达。特别是,减少表达基因编码中可观察到CshA出局区蛋白质,与增长缓慢,核糖体生物起源、和RNA转录退化(67年]。GSA识别显著富集的核糖体基因通路在BR21(图2)。
成功的治疗结果不尽是一个主要的威胁和紧急和日益增长的威胁公共卫生1,4]。这里,我们观察到出现高层特拉亚种群从heteroresistant KPC-Kp人口与微分适应性反应压力由一种抗生素。在两个遗传型的相关heteroresistant菌株k .肺炎菌株暴露在无毒介质imipenem孵化紧随其后,我们观察到(1)转录变化首先涉及一般渗透压力反应,其次是碳源利用和蛋白质加工、外膜完整性和运输;(2)这些连续的压力适应反应与瞬态(BR7)以及出现不可逆转的外观(BR21)高层imipenem耐亚种群;(3)转录变化与遗传相关损失OmpK36生产和浓缩的亚种群(BR21)获得高级CR。
我们发现的损失OmpK36在随后的两个菌株接触imipenem截然不同的路径。Imipenem-exposed BR21样本显示的变化在庚糖核心基因潜在的修改,已与平动的镇压ompC在大肠杆菌(68年- - - - - -70年]。应变BR7降低了编码的关键时刻,有限合伙人合成物的基因表达可能导致异质性的有限合伙人,或减少脂质外膜(图中S2)。这些变化可能导致的失败OmpK36插入外膜(68年- - - - - -70年]。我们也观察到非编码RNA的增加,云母,这可能会导致错误折叠外膜蛋白在回应致命imipenem接触(45]。不像BR21永久失去OmpK36的结果1插入,BR7 OmpK36损失是可逆的,也许通过暂时性的错误折叠蛋白质的复性。在后者,一旦药物被撤回,孔蛋白表达恢复,这可能表明一个潜在的健康优势菌株在缺乏药物暴露。
需要我们先前表明,水解KPC imipenem-resistant KPC-Kp亚种群摆脱相对易感人群(11]。我们目前的研究表明,KPC是必要但不充分KPC-Kp获得高级耐碳青霉烯。也许包括KPC的第一步β内酰胺酶水解浓度相对较低的imipenem进入周质。这使得一些亚种群生存。然而,持续的药物导致肽聚糖损伤。我们建议,随后损伤诱发将军和渗透压力反应重定向的细菌代谢葡萄糖利用率glutamate-dependent新陈代谢。这有多重目的为catabolite-mediated适应性反应为关键代谢物进入三羧酸循环。这个反应让另一组亚种群存活足够长的时间废除OmpK36的生产,从而导致减少细胞的药物,因此高层CR。噬菌体感应触发carbapenem-imposed压力也可能扮演一个角色在这个连续的适应性反应,与BR21观测到的。
我们的研究的局限性包括所得到的测试结果在体外实验室条件下与风险控制。RNA的转录概况分析从细菌中提取孵化后无毒介质材料与方法中描述他们暴露于imipenem 2和8个小时,分别分析细胞药物接触后立即将主要包括成绩单与细胞死亡相关。高级BR21阻力是不可逆转的,而BR7恢复其预曝光heteroresistant表型在孵化后无毒介质。因此,我们在这里描述的不是直接关系到imipenem接触但是无毒的细菌传播效果中幸存下来的族群初始imipenem选择性压力。
尽管有这些限制,我们观察到不同的进化历程与外观有关高层两个碳青霉烯耐药heteroresistant KPC-Kp菌株接触到碳青霉烯的孵化之前无毒介质。我们建议在heteroresistant高级碳青霉烯抵抗k .肺炎菌株的结果序列自适应的改变对压力的反应首先由一个碳青霉烯。进一步的研究需要额外的CRE菌株确认或概括这些观察。
这些发现提供了一个理由可能针对代谢途径我们发现参与CRE亚种群的出现。他们可能包括抑制bacteria-specific聚胺和谷氨酸分解,以及应激反应,噬菌体感应,有限合伙人合成途径。
3所示。材料和方法
3.1。学习压力和样品制备
的KPC-Kp BR7和BR21菌株在这项研究中获得从血液和尿路感染,分别来自不同的医院在里约热内卢,巴西,2009年。他们的表型imipenem heteroresistance以前特征(11]。没有个体患者数据收集。Imipenem-exposed样本来自稀释一夜之间文化标准化的光学密度在600 nm (OD600年10)的起始剂6cfu /毫升。三个生物复制每个孵化imipenem致命剂量的16 ug /毫升2或8小时37°C用颤抖的Mueller-Hinton媒体(MH)。幸存的细胞离心15分钟在5000×g, 2毫升无毒cation-adjusted MH resuspended,发展到midlogarithmic阶段(OD600年0.5)。所需的时间达到midlogarithmic阶段不同从5到6小时8小时暴露样本12到15个小时,两个小时暴露样本。未曝光的控制样本准备在相同条件下没有imipenem和需要2 - 3小时达到midlogarithmic阶段增长。RNA的提取试剂盒RNeasy MiniKit,稳定的RNA转录RNAprotect试剂后,根据制造商的协议(试剂盒,医学博士,美国)。所有菌株的基因组DNA制备的试剂盒血液和组织DNeasy工具包。
3.2。全基因组转录组测序
生物复制的数量(3)确定转录组测序的方法来优化出版测序深度和实现能力检测微分表达式(71年]。RNA和DNA样本提交QB3功能基因组学实验室(加州大学伯克利分校)图书馆准备和互补脱氧核糖核酸(RNA)合成。全基因组测序的研究样本提交Illumina公司平台在QB3 /文森特·j·科茨基因组测序设施(加州大学伯克利分校)。最终库被Bioanalzyer量化,然后通过一个300碱基对,测序paired-end MiSeq仪器上运行(基因组),或通过一个100碱基对,paired-end HiSeq 4000仪器(转录组)上运行。Illumina公司质量与FastQC序列分析(Babraham学院,剑桥,英国)。Illumina公司适配器和低质量的序列与Geneious修剪®version 9.0 (Biomatters,新西兰)或Trimmomatic 0.36 [72年]。
k .肺炎菌株BR7和BR21另外测序在太平洋生物科学(PacBio) RSII测序平台(太平洋生物科学,门洛帕克,加利福尼亚州)加州大学戴维斯基因组中心。PacBio分层的数据从头组装基因组组装管道(HGAP.2)和抛光颤软件包。全基因组组装,PacBio染色体和质粒DNA序列作为参考序列映射Illumina公司imipenem-exposed研究样本的数据。读取被映射到质粒,然后与Geneious染色体。议会提交为注释和分类子系统本体论(拉斯特73年]。变异分析的进步的淡紫色算法Geneious内运行。高度可变噬菌体(注释前噬菌体地区除外),移动元素,和基因间区域被排除在这部分的分析。
3.3。全转录组的组装和统计分析
全转录组装配从一式三份生物样本中进行读取索引和参考序列映射到PacBio领结2.2.3和大礼帽2.0.13 (http://ccb.jhu.edu/software.shtml)。生读/样本如表所示S3。独特的映射读取与SamTools排序0.1.19 [74年),计算得到HTSeq 0.6.1。(75年]。微分表达式分析磨边机(R, 3.2.3) [76年负二项模型下计算数据。低计数过滤;然后剩下的数量被规范化为不同成分的正确样品读库。统计上显著的微分表达式基于这些数量是由确切概率法分析两两之间的微分表达式测试3 2 h -生物复制或8 h-imipenem-exposed样品相比未曝光的日志复制样品和报告2倍变化产生的归一化微分表达式计数。随后topTags函数调整原始值为多个比较Benjamini-Hochberg错误发现率(罗斯福)校正。差异表达基因与罗斯福≤0.05被认为是具有统计学意义。饼图和热地图数据创建GraphPad棱镜version 7 (GraphPad软件,拉霍亚,CA)。原始数据,包括色散之间的重要生物复制,可以作为补充材料(表S3)。基因集合分析(GSA)来确定差异表达基因进行某些群体在imipenem-exposed样本过多。磨边机产生的差异表达基因的集合分析报KEGG自动注释服务器(成熟,http://www.genome.jp/tools/kaas/)生成KEGG orthology (KO)标识符(77年)作为输入,然后用于一般适用的基因片段的浓缩(计)分析运行在R / Bioconductor Pathview服务器(https://pathview.uncc.edu)[78年- - - - - -80年]。一个罗斯福价值截止0.2被用来评估途径的意义。
3.4。加入数据
完整的基因组和质粒BR7和BR21沉积在NCBI数据库Bioproject PRJNA358426和Biosamples SAMN06173548 (BR7)和SAMN06173549 (BR21)。
信息披露
投资者没有参与研究设计、数据收集和解释,或决定提交出版。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢Beatriz Moreira里约热内卢联邦大学的为这项研究提供KPC-Kp菌株。他们也感谢凯伦Lundy (QB3伯克利功能基因组学实验室),Shana麦克德维特(QB3伯克利基因组测序实验室),和Lutz Froenick(加州大学戴维斯分校基因组中心),感谢杰森发怒和Ke Bi (QB3伯克利计算基因组资源实验室)和运动鞋在发展实验(加州大学伯克利分校),对生物信息学计算资源和培训,亚伦Culich(伯克利数据科学研究所)和里克•贾菲(研究数据管理)数据管理基础设施,和杰弗里Skerker(加州大学伯克利分校生物科学研究所)议会的建议。最后,他们感谢Mallika Lal技术援助与样品和妮可Tarlton评论的手稿。这项研究的部分支持由RB罗伯茨细菌耐药感染的研究基金。这项工作用了文森特·j·科茨基因组测序在加州大学伯克利分校的实验室,由NIH S10 OD018174仪表格兰特。
补充材料
图S1:致命imipenem暴露与全球抑制蛋白质合成有关。改变外膜蛋白质合成,蛋白质运输和加工(第一节,高于水平线)和蛋白质翻译(第二节,低于水平线)观察在更大程度上比在BR7 BR21 8 h imipenem曝光。图S2:转录变化的肽聚糖生物合成途径(第一节,1 - 8行)和在关键时刻的脂多糖(LPS)生物合成(第二节、线合唱)致命imipenem曝光。在曝光8 h,在有限合伙人合成基因表达下调更突出BR21 B7。表S1:特征heteroresistant KPC-producingk .肺炎研究菌株,包括感染源,染色体大小,质粒类型和大小,和前噬菌体的马车。表S2:染色体序列KPC的身份和变异分析k .肺炎研究菌株和未曝光和imipenem-exposed样本之间的变异分析。BR7 v BR21,染色体身份:表S3:差异表达基因(罗斯福< 0.05)由于致命IPM暴露2 h - 8 h-exposed样本heteroresistant KPC-producingk .肺炎菌株。染色体和plasmid-borne基因分别显示。凭样品原始读取表的底部所示。表S4:差异表达基因引起的压力调节子应对致命imipenem暴露heteroresistant KPC-producingk .肺炎研究菌株。(补充材料)