文摘

Diarrheagenic和uropathogenic大肠杆菌类型主要表现为独特的细菌毒性因子的表达。stx1,stx2(志贺毒素),cdt(cytolethal向外毒素)基因通过水平基因转移。一些致命的基因等espP(丝氨酸蛋白酶),etpD(分泌通路的一部分)诱导(catalase-peroxidase),或sfpA基因(Sfp菌毛),质粒和其他人一样警察(鞭毛蛋白)和fimH基因(菌毛i型)是位于染色体。基因组致病性岛(PAIs)携带一些毒性基因等他基因。确定毒性基因的存在cdt包括临床分离株基因stx1,stx2,cdt,他,espP,诱导,sfpA,etpD,警察,fimH聚合酶链反应(PCR)进行评估。最普遍的隔离etpD和诱导基因的85.7%cdtII。诱导基因也观察到83.3%cdtI。然而,在42.85%的cdtIII隔离,espP基因是最检测。此外,他基因也是最突出的cdtIII(71.42%)。sfpA基因在66.6%的吗cdtV。stx1在100%的基因检测cdtII,cdtIV,cdtV类型。毒力基因的存在和模式被认为是中cdt积极的同形像和用于聚类分析。

1。介绍

大肠杆菌(大肠杆菌)通常被称为一个殖民的人类肠道细菌。外源DNA,包括质粒、致病性岛(PAIs)、转座子和噬菌体通过水平基因转移的古代不致病的大肠杆菌应变,导致特定的致病型的发展。然而,基因组在进化历程背景有一个关键的角色。致病性大肠杆菌菌株毒力因素的分类是基于体验和最常见的疾病。

志贺毒素是一家庭相关的毒素与两大集团,Stx1 Stx2,基因表达的水平被认为是通过噬菌体。志贺毒素的编码stx1和stx2基因是一个a - b型毒素,抑制蛋白质合成,导致出血性结肠炎和溶血性尿毒症。的stx基因位于基因组的非均匀溶解性(stx2)或神秘的(stx1)人字形噬菌体1- - - - - -4]。Cytolethal向外毒素(上)首先识别细菌毒素,阻止真核细胞周期,抑制细胞增殖,并最终导致细胞死亡。一个三方holotoxin CDTcdtB活动单元,DNAase-I-like活动(5]。五个不同的上(电流-电压)已报告大肠杆菌到目前为止,他们指定的出版物。CDT生产与致病性有关大肠杆菌。的存在cdt基因在不同种类的细菌和DNA分析附近的cdt基因表明毒素从异型的物种获得了水平基因转移。然而,可能系统发育起源(或祖先)仍仍然难以捉摸。有趣的是,噬菌体和相应的插入序列残附近被发现大肠杆菌cdt基因。这些数据表明,cdt基因水平转移获得的事件在某种程度上,独自进化之后(5,6]。

与stx基因,某些类型的cdt噬菌体基因横向收购大肠杆菌(6,7]。

现在明显的是,一些致命的基因是位于一个大致命的质粒(pO157)致病大肠杆菌,其中的细胞外丝氨酸蛋白酶基因(espP),catalase-peroxidase基因(诱导)和II型分泌通路蛋白D (etpD)。除了大小不同的质粒被报道,不得标明独立性包含所有这三个基因的基因交流通过水平基因转移过程。EspP可以分为autotransporter蛋白质家族,以丝氨酸残基的活性中心催化地活跃。EspP劈开胃蛋白酶和人类凝血因子V (8- - - - - -11]。Catalase-peroxidase基因(诱导)编码一种蛋白质显示双官能团的过氧化氢酶和过氧化物酶活性12]。这种酶是思想表达的致病性菌株,从引起的氧化损伤保护这些病原体吞噬细胞产生的活性氧分子或其他宿主细胞在感染过程中(13]。II型D编码的蛋白分泌途径etpD在上述质粒编码的基因是另一个致病因素(14]。

一群六个基因,称为sfp包括sfpA基因是位于另一个质粒,pSFO157在某些致病大肠杆菌菌株。这个基因集群介导mannose-resistant红血球凝聚和表达的小说类型的菌毛,Sfp菌毛,直径3 - 5纳米,主要单元是SfpA [15,16]。

1型菌毛,编码的染色体鱼翅基因簇,是最常见的胶粘剂的细胞器大肠杆菌。Fimbriae-mediated依从性,促进了殖民和生存在宿主细胞,在发病机制中起着重要的作用。1型菌毛由一个主要结构单元(费马)和几个较小的组件,包括adhesin (FimH) [17,18]。警察编码鞭毛蛋白亚基的基因位于染色体上,可能会被认为是基因背景。鞭毛促进细菌的运动,有一个重要的角色在肠道细菌分布和宿主组织(19]。

致病性岛(PAIs)基因组岛的子群,携带一个或多个毒性基因和致病细菌的基因组中缺席不致病的物种的基因组。《占领较大的基因组区域。区域进行溶血素基因(他)位于PAI的大肠杆菌染色体(20.- - - - - -22]。

在这项研究中,毒性的发生plasmid-borne基因,在CDT-producing致病性岛,和染色体编码的基因大肠杆菌菌株进行了研究。

2。材料和方法

2.1。菌株

在这项研究中,30 CDT-producing菌株进行调查。从临床腹泻患者的菌株25,26一夜之间,)和被培养在仅有37°C Bertani(磅)中。

2.2。DNA提取

模板DNA提取是由Phenol-Chloroform试验(1毫升培养磅离心机在14000转3分钟),然后是颗粒溶解在1毫升的5毫米Tris-HCl pH = 6.8,离心机在10000转2分钟。350年resuspended颗粒μL(5毫米Tris-HCl pH = 6.8和25μL溶菌酶(5毫克/毫升)和25μL 1 M Tris-HCl, pH值:8.8,孵化在室温15分钟。接下来,15μL 0.5添加EDTA是40μL SDS10%和10μL核糖核酸酶酶(20毫克/毫升),轻轻混合,在37°C和治疗2 - 3小时。添加5之后μL蛋白酶K(20毫克/毫升),样本在37°C和孵化过夜,后来,加热5分钟在55°C。然后,400年μL苯酚添加和混合轻轻地和400年μL氯仿是补充说,混合大力或涡流,和离心20分钟(14000 rpm)。上阶段收集,和800年μL冷乙醇添加96%,室温15 - 30分钟,然后离心机在14000 rpm 15分钟。上阶段是丢弃和颗粒被洗1 - 2次,干,溶解在50μL TE (1 x)然后在75°C加热15分钟。

此外,洗脱了使用TE (1 x)缓冲区。完全,模板的浓度调整到100 ng /μl

2.3。目标基因,PCR扩增条件

Virulence-associated基因,包括警察,fimH,stx1,stx2,etpD,espP,sfpA,诱导,他基因,通过聚合酶链反应(PCR)进行评估。cdt输入基于特定的引物。在表1核苷酸序列的引物用于放大目标基因的描述。

表1
目标基因的核苷酸序列的引物扩增。

PCR样本准备25的总量μL (PCR缓冲:(10 x)缓冲/ CinnaGen有限公司核苷酸:25毫米/ Fermentas Taq DNA聚合酶:每5台μL / CinnaGen有限公司MgCl2:50 mM / CinnaGen有限公司D.D.W.,Template: extracted genomic DNA (100 ng/μL), Thermocycler: SENSOQUEST Labcycler)。

2.4。克隆和测序

在这项研究中,我们克隆出一些积极的样品和PCR测序产品。优化PCR和基因扩增后,基因从凝胶中提取琼脂糖是用“核心™凝胶萃取装备ge - 100, CoreBioSystem有限公司“我们还利用pTZ57R / T向量结扎过程完成了英斯达克隆™PCR克隆工具(Fermentas)。重组细胞培养在盘子里含有氨苄青霉素(500毫克/毫升)。

2.5。分层聚类

基于dendogram Virulence-associated基因的菌株进行比较说明。层次聚类分析和系统树图是由IBM SPSS统计软件(版本20)。所有毒性基因视为变量和统计设置是设置在集聚时间表。集群的方法是通过测量平方欧氏距离团体之间的联系。

3所示。结果

3.1。毒性基因检测

毒力基因的存在,包括espP,etpD,诱导,sfpA,他,警察,fimH,stx1,stx2,cdt基因,由PCR(表来评估2)。

表2
virulence-associated基因的发生包括质粒、致病性岛,染色体和噬菌体的基因。(+)表示积极的PCR产物和提到基因的存在而(−)表示- PCR产物。

所有的压力都cdt积极和有关cdt类型6个菌株cdt-I(20%)、7株(23.3%)cdt-II,cdt-III,cdt-IV,3株被公认cdt-V(10%)。

在目前的研究中,stx1临床分离株的基因存在于86.7%。然而,stx2基因检测菌株的13.3%。stx1基因也被发现在83.3%的cdt类型-我生产菌株,而这是在所有的发现cdt类型二世,四世,V菌株的57.1%cdt- - - - - -三世隔离(表3)。stx2基因的33.3%cdt类型 紧张,14.3%cdt -类型三世,四世压力,而在CDT -二世和CDT - 生产隔离观察。

表3
目标基因在不同的频率cdt类型隔离。

他基因中没有检测到任何CDT-I-producing菌株。然而,它是14.3%的检测cdt- - - - - -二世压力,71.4%的cdt- - - - - -三世压力,57.1%的cdt- - - - - -四世压力,66.7%的CDT-V-producing隔离(表3)。在这种临床分离株,占53.3%etpD,63.3%的诱导,23.3%的espP基因检测。在目前的研究中,etpD在33.3%的基因cdt类型I, 85.7%的cdt类型II, 28.6%的cdt类型III, 57.1%的cdt类型IV,和66.7%的cdt类型V菌株。espP基因存在于16.7%的cdt类型I, CDT-III-producing的42.9%,28.6%cdt类型IV, 33.3%的cdt类型V菌株,同时,CDT-II-producing分离株的基因没有检测到。此外,诱导在83.3%的基因检测cdt类型I,在85.7%的cdt类型II, 57.1%的CDT-III CDT-IV-producing菌株,同时,这种基因CDT-V-producing菌株(表中没有观察到3)。

发生致命的基因,espP,etpD,敏感,和sfpA,是属于一个a - m模式基于质粒编码基因的存在(表吗4)。

表4
不同的cdt类型菌株及相关基于其他毒性基因的基因型和配置文件指定基于plasmid-borne共存的基因。espP:配置文件,etpD:配置文件B,诱导C:配置文件,espP /敏感:异形,espP / sfpAE:概要文件,etpD /敏感:配置文件,etpD / sfpA:G,/ sfpA诱导:H,etpD / / sfpA诱导:我,espP / etpD /敏感:K剖面,espP / etpD / / sfpA诱导:概要L,剖面M:表示没有质粒基因和染色体的基因(fimH,警察,他,stx1或stx2)。

最突出的F概要文件以20%频率重复了6次(etpD /敏感)。质粒基因的缺失是10%的菌株所示。相关联的所有出生的质粒基因频率与L概要文件仅为3.33% (espP / etpD / / sfpA诱导)。

概要F(患病率越高etpD /敏感)是相当大的(20%),然后概要文件C (诱导)更为普遍(16.68%)。概要文件的频率B (etpD)、D (espP /敏感),G (etpD / sfpA),和M(缺乏plasmid-borne基因)为10%。其他剩余的频率配置文件异常和概要我(3.33%etpD / / sfpA诱导)为6.67%。

在cdt-I组,我概要(50%etpD / / sfpA诱导)显示,40%的菌株C概要文件(诱导)了。在cdt-II组,50%菌株还显示我配置文件(etpD / / sfpA诱导),66.67%的菌株F概要文件(etpD /敏感)(最突出的概要文件)被检测到。突出的特性cdt-III组E概要(100%espP / sfpA)和66.67% D剖面(espP /敏感)。H K和L概要文件是最频繁的概要文件(100%)cdt-IV组。在cdt-V组中,100%的菌株有一个概要文件(espP)和66.67%显示G概要文件(etpD / sfpA)。在每一个cdt组特定的质粒出生档案表所示5。

表5
不同的频率cdt类型基于毒性plasmid-borne基因完全隔离。

最突出的基因在每个小组确定。诱导质粒基因是83.3%cdt-I和85.7%cdt-II组。的etpD基因表达为85.7%cdt-II组和66.66%cdt-IV集团;espP演讲是42.85%和33.33%cdt-III和cdt-V组,分别。的sfpA表示在cdt-IV和cd-tV组分别为42.85%和66.66%。

3.2。Dendogram集群的菌株

在图1层次聚类分析基于平均链接和新距离集群结合。毒力基因协会模式相比,这些菌株的链接。在这个dendogram协会cdt-I,cdt-II(4)分支和遗传连锁的cdt-IV,cdt-V(3)分支组分支1所示。基因型协会cdt-III也显示在一个完全分离的分支机构(分公司2)。


图1
系统树图使用平均之间的联系组:这幅图描绘了30检查临床分离株之间的层次聚类分析集群基于virulence-associated因素包括致命的质粒、噬菌体、染色体、基因和致病性岛。结束时,每个分支的数字表明菌株,随着向右移动相对距离变得越来越明显。距离更明显的利用0 - 25在图的顶部。描述表,在树的前面说明了比较模式的共存和毒性的基因在不同的菌株(光灰度显示基因丢失和深灰色的刻度显示不同的毒性基因起源)。定义模式可以观察到cdt基于其他毒性基因类型隔离。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们分析了不同大肠杆菌从临床分离菌株腹泻病人为了获得的证据之间存在毒力基因型和不同cdt类型。它已经表明,CDT生产与致病性有关大肠杆菌。的低流行率cdt基因和与其他毒性基因表明他们的协会cdt基因是获得独立的大肠杆菌血统,可能由于水平基因转移(7]。五个不同的上已经报道了大肠杆菌到目前为止,(5]。它也被发现cdt-I和cdt-IV基因似乎属于同一系统发育血统,而cdt-II,cdt-III,和cdt-V在另一个血统基因是聚集在一起。此集群配置文件是基于基因组扩展多样性。在我们的研究中,关于评估毒性基因两个分支1(包括首次分为分支cdt-I,cdt-II和cdt-IV,cdt-V基因)和分支2,cdt-III基因。这些数据表明,cdt基因水平转移获得的事件在某种程度上,独自进化之后(5]。我们的研究显示完全分离cdt-III同意从其他cdt类型的发现这群来自动物和其他组更属于人类。此外,cdt-I,cdt-II(4)分支和cdt-IV,cdt-V(3)分支组更类似关于毒性基因和起源于相同的后代。

显然,现在是他基因位于PAI和编码α-溶血素。

溶血素的生产cdt-III -,cdt-IV人类和动物致病性的第大肠杆菌经常观察菌株(5]。因此,毫不奇怪,他中检测出40%的临床分离株。与其他研究,合作的患病率他基因cdt类型III, IV, V是超过其他隔离。这些结果说明,可能,可能存在的存在之间的关系他基因的类型cdt基因在临床大肠杆菌隔离。

警察和鱼翅是两个染色体基因定位分析在我们的研究中。警察基因被发现在96.7%的隔离。警察基因编码的鞭毛蛋白亚基,可以被视为基因背景大肠杆菌。因此,可以将检测警察在我们的大多数隔离。类似于我们的发现,所有的隔离警察基因在2006年在芬兰进行的一个实验23]。1型菌毛也是编码的染色体定位鱼翅基因簇。的存在鱼翅DNA序列中比较普遍大肠杆菌菌株。事实上,大多数的临床分离株,毒性和无毒,可以诱导表达1型菌毛。

在致病大肠杆菌,大量的存在致命的质粒(pO157)已经被观察到。的etpD,诱导,espP基因是位于这个质粒。pO157质粒主要是与肠出血性大肠杆菌和ETEC压力有关。在我们的研究中,53.3%的临床分离株港口etpD,63.3%的诱导和23.3%espP基因。有一个的发生之间的关系stx基因,这些基因毒性plasmid-associated24]。此外,PCR分析显示plasmid-borne的发生之间的密切关系诱导基因和stx在致病基因大肠杆菌(12]。大部分的+诱导属于志贺菌株产毒大肠杆菌(24]。我们的结果类似于发现Beutin et al ., 200524,27]。基于我们的研究结果,它可以推断诱导基因主要是出现在CDT-I CDT-II-producing菌株。

ESpP,拥有人类凝血因子V和胃蛋白酶蛋白水解活性,是志贺产毒菌株的毒力的重要标志(28]。高频率的espP在CDT-III-producing隔离是相当大的。

α-溶血素通常是与人类uropathogenic有关大肠杆菌(UPEC);此外相关编码PAI也如此不稳定和操纵子可能位于质粒或染色体(22,29日]。除了尿路感染(UTI)是主要由类型1-fimbriated UPEC和初始绑定的FimH adhesin提到的菌毛(30.]。在我们的研究中,100%的他+菌株,fimH基因检测。此外,所有他+质粒的菌株具有一个或多个pO157基因包括etpD,诱导,espP。这些基因+stx基因是一个虽然肠出血性大肠杆菌和STEC的特征espP基因是常见的EPEC和肠出血性大肠杆菌14,31日]。同时这些基因的存在表明,分离获得他操纵子和相关PAI通过水平基因转移。此外,在进化途径,实现隔离cdt改善其致病性的基因。

我们的研究结果表明,考虑CDT-producing菌株毒力基因属于异质群体。系统树图的分支型性质允许我们集群各级菌株。此外,它给出了一个案例之间的距离是多么伟大,都聚集在一个特定的步骤,使用0 - 25顶部的图表(图1)。菌株的集群作为一个特定群体或接近系统树图可能有相似的特征,拥有自己的独特的基因型和基因的内容。在同一集群,也可以观察到一个相对独特的毒性基因模式如图所示1。例如,每个不同的cdt拥有一个特定类型集团cdt基因与基因组的支柱,有一个大约基于其他毒性基因相似的模式。例如,概要F (etpD /敏感)更为普遍cdt类型II组或他基因是普遍的cdt类型III隔离。

此外,这一现象也观察到在每一组属于一个特定的plasmid-profile,这样cdt- - - - - -V在概要文件G(基因是最普遍etpD / sfpA)。这个证据进一步证实水平基因转移可能发生致病菌株之一。

协会cdt-I,cdt-II和cdt-IV,cdt-V基因型组dendogram》里描述的那样。因此,cdt-III基因型协会已被证明在一个分开的分支。另一方面,从3株cdt-V,两株cdt-IV当一个应变有关cdt-III。

这些发现可能表明CDT-producing菌株可能起源于一个共同的祖先,但在他们的进化水平基因转移,从对方。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。