文摘
这是第一次报告的确认Encephalitozoon cuniculi(大肠cuniculi在农场兔子肉位于墨西哥北部。八十名年轻兔子展出这种新兴人畜共患疾病的临床症状,如斜颈,共济失调,麻痹性痴呆,盘旋,滚动。样品的大脑、肾脏和肝脏组织学病变的检查。第一次病变所致大肠cuniculi是根据其严重程度评分(I, II, III)和肉芽肿的大小(类型A、B和C)。主要的脑损伤是三级,恰逢C肉芽肿型的存在。大脑病变位于皮层,脑干,髓质。肾损伤也是三级分布在皮层和肾髓质,无肉芽肿形成。超敏反应的参与类型III和IV建议。所有的兔子都是血清反应阳性的大肠cuniculi中央情报局的测试,表明这种人畜共患和新兴病原体广泛分布在动物中供人类食用。我们相信这项工作检查时可以作为指导大肠cuniculi并将确认这个病原体的诊断提供了方向。
1。介绍
Encephalitozoon cuniculi(大肠cuniculi)是一种单细胞专性细胞内微生物属于门小孢子虫目,类Microsporea,订单小孢子虫目(1,2]。所有哺乳动物都容易感染这种真核生物(3];然而,它会导致很严重的中枢神经系统(CNS)和肾脏疾病的宠物兔子和实验室(Oryctolagus cuniculus)[4]。感染兔子消除尿液和粪便中的孢子;因此,宿主感染通常发生污染的水或食物摄入后感染性孢子(5]。Encephalitozoon cuniculi被认为是一个渐进的、人畜共患,投机取巧的病原体的免疫活性的和免疫力低下的个人6,7]。孢子感染肠上皮细胞,也许通过派尔集合淋巴结补丁或interepithelial淋巴细胞,血液或淋巴系统扩散,到达大脑、肾、肝脏等器官。孢子也可以通过细胞间吞噬细胞内化,位于肠道上皮细胞,从那里他们迁移到其他器官8]。宫内感染,也被认为是一个重要的传播途径的后代,这偶尔会患白内障,葡萄膜炎,眼前房积脓9];吸入microsporidian孢子是另一个可能的途径传染的10]。Encephalitozoon cuniculi感染导致严重的肉芽肿性脑膜脑炎和慢性间质性肾炎和纤维化(11]。在很多兔子,疾病会存在亚临床数月之久。由于脑损伤,感染兔子可以开发中枢前庭疾病的迹象,特点是斜颈,共济失调,麻痹性痴呆,和纵向滚动;动物通常是无法正确的本身,甚至是眼球震颤和癫痫发作12]。慢性肾功能衰竭,虽然在受感染的兔子很常见,往往导致不太特定的症状,如体重减轻、嗜睡、食欲不振。一些兔子也会出现尿失禁和可以成为polydipsic polyuric [4]。典型的肾损伤表现为抑郁疤痕外表面,当胶囊分离更明显。这些都是引起的慢性间质性肾炎和纤维化,给肾脏的外观(13]。Encephalitozoon cuniculi已经成为一个重要的机会性病原体免疫抑制个体,如艾滋病患者和那些接受抗肿瘤或免疫抑制药物14,15]。此外,这种微生物也可以感染免疫活性的人和动物(16]。由于这些原因,大肠cuniculi已经在世界范围内得到更多的关注,已成为一个重要的病原体对人类和动物(17]。有很多最近的免疫学和病理研究在欧洲,亚洲,和我们关注大肠cuniculi这些动物兔子和感染周围的人,像工作和研究人员18,19]。大多数这些研究涉及到兔子,当宠物或那些来自实验动物中心(12]。但是,没有这种人畜共患疾病的血清学或组织病理学研究已经在墨西哥进行的。因此,本研究的目的是充分描述组织学病变,随着血清学结果,淫秽的,和尿液分析严重爆发encephalitozoonosis兔子肉农场,这个病原体此前还没有见过。
2。材料和方法
2.1。动物研究
八十年新西兰白兔从五个半精耕细作的农场,注定要肉的目的,检查后出现神经系统临床症状暗示encephalitozoonosis,如斜颈,嗜睡,滚动,或走几圈。28兔子(13岁女性,15岁男性)有间接的证据多尿症,表现为脱水和尿后四肢的滚烫的。建立了农场的直辖市Cadereyta吉梅内斯(25°36′N;100°00 W′), Cienega de Flores (25°57′N;100°11′W), Higueras (25°57′N;100°01 W′),马林(25°23′N;女孩100°02 W′),加利纳直接(24°50′N;100°04′W),新莱昂州,墨西哥和感染发生在2015年6月到8月。动物们年轻,大约3个月的年龄,男女受到影响(35岁女性和45岁男性)。他们所有人面对严重的减肥,大约1.5公斤(正常= 2.5 - 3公斤),据说准备肉市场。 Sick animals were submitted for postmortem examination to the Pathology Department of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Nuevo León.
2.2。样品和组织学的集合
兔子被安乐死,常规尸检。在验尸,外部和内部的耳朵和鼓膜的大疱进行歧视可能耳道感染。样品从大脑、肾、肺、心脏、肝脏、消化系统,眼睛固定在10%中性缓冲福尔马林48小时。样本处理常规组织学和苏木精和伊红染色(他),calcofluor白色(CW),和修改三色的蓝色(MTB)。一个积极的感染大肠cuniculi被认为是当孢子观察器官检查。
中枢神经系统(CNS)。大脑的组织学检查包括脑膜、额叶、小脑、丘脑、下丘脑、脑桥、中脑、延髓、脑干、脊髓颈地区。评估和确定病变观察到大脑中,我们使用以下:年级我,广义血管充血,血管周的嗜神经水肿,和离散淋巴细胞成套;二级,温和nonsuppurative脑炎和胶质反应,星形胶质细胞,astrogliosis和温和的血管周围淋巴细胞浸润,和寄生虫囊肿;三级,严重nonsuppurative肉芽肿性脑膜脑炎与相邻的寄生虫囊肿,胶质反应的众多领域,丰富的血管周围淋巴细胞浸润,有卫星,出血,神经坏死、软化。同样,肉芽肿的大小分类如下:A型,50岁以下的肉芽肿μ米直径;100 B型,肉芽肿μ米直径;和类型C,肉芽肿大于100μ米直径。
肾组织。同样,病变的肾脏被分类如下:一级,间质性肾炎,特点是一个离散的淋巴细胞浸润,上皮退行性改变皮质和髓质,扩张肾肾小球和透明管腔内投;II级、中度慢性间质性肾炎和肾小管上皮细胞坏死和脱落;三级,严重慢性nonsuppurative肉芽肿性间质性肾炎,伴随着坏死,肾小球粘连,国米,intratubular出血和严重的间质坏死和纤维化。
肝组织。使用相同的组织分级系统如下:一级,nonsuppurative门静脉周的间质浸润与小叶中心的拥堵和毛细管扩张;II级,前面描述病变伴有脂肪变化,拥堵,小叶气球样变性;三级,小叶中心的坏死和出血。
2.3。碳免疫测定(CIA)
从中央耳动脉血液样本被所有的兔子。血栓形成是允许的,和血清20°C到碳储存在−免疫测定(CIA)测试(Medicago®,乌普萨拉,瑞典)。分析是基于免疫球蛋白特定的检测大肠cuniculi孢子和执行根据制造商的指示。结果在40 x光显微镜下阅读。从兔血清凝集的孢子,彩色灰褐色的碳粒子背景被认为是积极的大肠cuniculi感染。一个消极的结果被认为是当孢子出现发白的在相同的背景下。所有样品比较积极和消极血清控制的商业工具。
2.4。尿液和粪便的集合
这两个程序进行尸体剖检。收集的尿液样本cystocentesis和染色前储存在4°C calcofluor白色和三色的蓝色。直接从兔子的粪便样本被肠验尸,直接被放置到塑料容器含有10%中性缓冲福尔马林。样本的筛查大肠cuniculi孢子使用相同的染色程序用于尿液样本。
连续波染色。Methanol-fixed粪便涂片染色了calcofluor白色10分钟在一个黑暗的房间,用蒸馏水冲洗。幻灯片被风干和抗衰落水安装安装介质,包含DABCO®抗衰落(Sigma-Aldrich、墨西哥)。样本观察下紫外荧光显微镜数字化的波长395 - 415纳米。阳性样品中,孢子出现青白色或青绿色椭圆结构在一个黑暗的背景下。
快艇。Methanol-fixed粪便涂片染色了三色的蓝色(Para-Pak®,子午线生物科学,Inc .,辛辛那提,OH)为90分钟37°C。幻灯片被冲洗顺序在酸醇、乙醇、二甲苯,安装在组织学树脂,并在100 x光显微镜下观察到。孢子量化进行了如前所述,样本给定的四个名称基于孢子观察到的数量:(a)很多(超过10孢子),中等(5 - 10孢子),罕见的(约1 - 5孢子),和不确定的(无孢子)。在阳性样本,孢子观察到明亮的粉红色椭圆形或圆形结构,有时显示粉红色片带状条纹。
2.5。统计分析
卡方分析被用来测试感染率的差异在不同组的兔子和识别病变年级和兔子性别之间的任何联系。一定程度的被认为是显著的。软件一款统计软件v。16(Minitab® Inc., Pennsylvania, USA) was used for statistical analysis.
3所示。结果
3.1。临床表现
所有的兔子检查在这项研究中有神经系统症状兼容大肠cuniculi感染。观察不同程度的中枢前庭障碍,包括头倾斜,盘旋,滚动、共济失调、眼球震颤、麻痹性痴呆。在尸检中,没有一个兔子头部创伤的迹象显示,牙科疾病,鼓膜的大疱问题,耳螨,或耳道细菌感染,任何可以解释观察到的神经系统症状。
3.2。碳免疫测定(CIA)测试
所有采样兔血清阳性大肠cuniculi中情局测试。在所有情况下,无数的孢子观察下40 x客观;与碳颗粒包围了孢子褐色或深褐色的背景,这表明免疫球蛋白反应的存在大肠cuniculi孢子。
3.3。组织病理学研究
中枢神经系统。所有检查兔大脑样本显示慢性脑损伤的微观证据,特点是多病灶的nonsuppurative肉芽肿性脑脊髓炎,伴随着大肠cuniculi囊肿。受影响最严重的地点是大脑皮层,白质,延髓,而小脑、脊髓和脑脊膜没有显示微观病变或寄生虫囊肿的研究标本。三十个兔子(38%)有年级我病变(图1动物),16(20%)显示二级病变(图2兔子),35(44%)三级病变(图3)。兔组和性别之间的任何观察到的差异没有统计学意义(= 5.64;)。此外,毗邻类型C肉芽肿,我们观察到完整和寄生虫囊肿破裂释放感染性孢子直接进入神经组织(表1)。
肾脏。宏观上,肾组织样本显示慢性肾功能损伤的证据。35动物(44%),有多个焦点含有深红色和灰色的不规则的区域,大约0.5 - 1厘米,外肾脏表面。在严重的情况下,这些损伤经常结合形成更大的损伤。肾皮质的切削表面显示径向灰白色不等领域扩展到髓质,而肾盂显示没有明显变化。显微镜下,肾损伤的特点是多病灶的和节段nonsuppurative肉芽肿性间质性肾炎,联系在一起大肠cuniculi囊肿和免费的孢子(图4)。肾实质,32兔子(40%)有年级我病变(图5),10个动物(13%)包含二级病变(图6兔子),38(48%)三级病变(图7)。组和性别之间的差异没有统计学意义(= 9.52;)。此外,包含丰富的寄生在管状上皮囊肿大肠cuniculi孢子观察兔子的病变特征是第二或第三的成绩。
肝。所有动物的肝脏检查显示宏观和微观损伤的证据。在验尸,肝脏是拥挤和放大,和几个人硬。肝包膜增厚,呈乳白色。肝脏病变的特点是一个灶nonsuppurative肉芽肿性炎症反应。16只兔子(20%)显示年级我病变(图8),37个动物(47%)二级病变(图9兔子)与肝脂肪变化,27(34%)三级病变(图10)在肝实质。组和性别之间的差异没有统计学意义(= 6.456;)。
3.4。尿液检查
快艇。我们发现23%的兔子出现阳性尿孢子的沉积物。孢子稀少,2场,大约2 - 4μ米的长度,粉红色到红色的粉色。大多数是椭圆形或略长。
连续波。启用该荧光染料的快速观察microsporidian孢子在29%的兔子。孢子很容易观察和彩色作为一个强烈的明亮的蓝色绿松石在一个黑暗的背景下。
3.5。粪便检查
快艇。采样的兔子都是阳性microsporidian孢子在凳子上。这些彩色鲜艳的红色,粉色和测量约2 - 4μ米的长度。许多孢子显示典型的对角线或水平线在赤道带,表示极地管。我们发现59兔子(74%)显示1到5孢子/场(罕见),12个动物(15%)显示5到10孢子/场(中度),和9动物(11%)有超过10孢子/场(许多),表2。
连续波。这种荧光染料的染色的粪便样本允许快速观察microsporidian孢子的兔子。由于黑暗的背景涂片,孢子很容易的识别。成熟和完整的孢子显示了强烈的明亮的蓝色荧光,而不完整或发芽孢子有微弱的蓝色的颜色。
4所示。讨论
在这项研究中,我们评估了80只兔子从严重的爆发大肠cuniculi在年轻的兔子。我们所有的数据强烈暗示这种病原体作为疾病的病原体,和微生物(1)确认了孢子的形态特征在大脑和肾脏,使用不同的污渍(20.];(2)器官的组织学损伤取样(4];(3)检测结核分枝杆菌孢子在粪便和尿液使用和连续波染色技术(21];和(4)由中情局血清学确认测试(22]。在这项研究中,令人惊讶的是所有的动物研究显示,严重的脑损伤兼容大肠cuniculi。受影响最严重的地点是脑干,延髓和大脑皮层。相反与文学、小脑、脑膜和脊髓仍然没有病变。没有观察到损伤耳道,鼓膜的垂饰,或前庭的身体,这是令人惊讶的事实,兔子大量中枢前庭疾病的迹象显示经常发现与小脑病变,包括共济失调、滚动和盘旋,嗜睡,斜颈(23,24]。因此,临床症状是直接相关的严重炎症反应在大脑组织受感染的兔子。这使颅内压增加,导致上述症状(25]。神经病理学兔子的其他潜在原因包括细菌性脑炎、hydrocephalia,恶性淋巴瘤(26];然而,这些条件在尸体剖检观察和组织病理学检查。神经系统症状符合表示最严重的中枢神经系统损伤(三级)也表示最严重的大脑nonsuppurative肉芽肿(C型)。然而,一些兔子的离散变化和显示,没有证据表明在神经组织肉芽肿。之间缺乏关联程度或程度的脑损伤和兔子对比一些先前发现的临床行为,这表明神经组织损伤导致的严重程度大肠cuniculi感染是直接负责神经系统症状的表现20.,26]。同样重要的是要注意,炎症反应的严重程度在大脑中并未反映神经症状的严重程度(23]。回顾性研究118自然感染的兔子,然而,据报道,临床表现如斜颈和共济失调更频繁地发生在动物身上最严重脑损伤(22),这是同意我们目前研究的结果。此外,如上所述,性别不是一个诱发因素的神经症状(27]。
本研究比较小的动物数量有限的研究,只有兔子有明显的神经症状的检查。然而,从我们的数据,我们推断宿主抵抗和感染代理之间的关系可能存在处于平衡状态(28]。我们建议的广泛扩散大肠cuniculi在大脑中可能导致的寄生虫囊肿破裂,释放感染性孢子直接相邻的神经组织(29日]。这将导致肉芽肿反应中观察到的大部分被感染的动物类型B或C脑损伤,这是符合观察到孢子和完整的囊肿被发现相邻肉芽肿反应(30.]。支持这个,假设内生孢子的甲壳素microsporidians是巨噬细胞的趋化现象的(31日),导致CD8的招聘+细胞和和干扰素- - 2的生产γ(32]。结束的结果是一个肉芽肿(1]。很少有研究试图分类和描述大肠cuniculi在自然感染病变(33]。严重的伤害已报告在小脑和脑膜的兔子自然感染大肠cuniculi(34];然而,这不会发生在我们的研究中。相反,我们发现,三级病变,C肉芽肿型有关,是一个常见的发现在大脑组织。这也与其他作者发现肉芽肿的形成是罕见的20.]。这种差异可以归因于动物的年龄,大多数研究的平均年龄是3岁左右,而在我们的研究中,平均年龄为3个月(年轻人)。我们的数据表明,年轻的大脑病变更严重比老年人(35]。可能损伤的严重程度减少兔子长大成人,因为它们更耐大肠cuniculi感染(5]。虽然分类肉芽肿的大小并没有表现在研究[5),他们报道肉芽肿,小于这些在我们的研究中发现。根据建议分级系统,小的和大的肉芽肿的发生神经组织的老兔子可以表明一个大肠cuniculi再感染或复发性寄生虫血症33,36]。
肾脏,大多数兔子研究提出了三级受伤,但与病变的严重程度中观察到大脑,肉芽肿很少观察到肾实质。然而,间质淋巴细胞增生,肾小管上皮细胞的坏死,间质纤维化更丰富的肾脏和直接与完整的和含有寄生虫囊肿破裂。显微镜下,肾损伤更严重比观察到大脑组织,这表明,在自然感染年轻兔子,肾脏可能受感染的第一(33,37]。
最常见的病变观察感染肝脏是第二和第三的成绩38,39]。有人建议,肝损伤的严重程度是受寄生虫进入的路线;时观察到更严重的病变大肠cuniculi孢子是口服40]。这对动物传播方式可能发生在这项研究中,因为大多数的肝脏检查显示严重的伤害。一些作者认为肝损伤的非特异性免疫反应(36]。损伤的血管周的分布相结合的血管炎是类似建议参与免疫病理现象,如类型III和IV糖甙,据报道在国内的狗(犬属后裔)[41),和松鼠猴(Saimiri sciureus)[42]。相同的免疫病理机制是在蓝狐狸建议(Alopex lagopus)感染大肠cuniculi(43]。
众所周知,一个人的免疫状态中发挥着重要作用消除大肠cuniculi(23,29日,44]。到目前为止,只有少数血清学研究全球进行确定病原体的流行在兔子45,46]。在这里,所有的兔子被血清反应阳性的采样大肠cuniculi。这是有趣的,因为积极的利率为中情局测试在其他的研究范围从31 (62%18,47,48]。这个测试用于屏幕大肠cuniculi在实验室和宠物兔子在欧洲、亚洲和美国(49),但它并没有被用在我们的国家和拉丁美洲。虽然该研究是第一个描述和测量大肠cuniculi感染农场兔子,我们第一次的数据显示大肠cuniculi感染可能是更常见的在这里比在世界其他地方50]。因为这个新兴病原体传播通过粪便和尿液,缺乏快速和特定的诊断方法(例如,美国中央情报局测试)在许多地区的地区可能是一个严重的人畜共患问题这些动物是教养,特别是对于人们直接或间接参与兔生产(51]。这个测试的一个优点是,与ELISA和IFAT相比,它提供了类似的测试结果,很容易和快速的执行不需要昂贵的设备或专业人员(52]。另一个优势是,检测大肠cuniculi特殊免疫球蛋白可以确定潜伏性感染,即使没有临床症状。同样,高频率的孢子在粪便和尿液样本建议积极感染。这项研究清楚地表明,这个病原体可以广泛的设施兔子繁殖,这些动物或其他能够无限期的孢子到环境中。在这里,只有肥育阶段进行了研究;然而,进一步的研究需要在其他产品的步骤,包括评估环境水库,水源和食品供应等53,54]。这将是人畜共患的关键识别其他可能的路线传播,建立预防和控制措施。
尿液孢子观察在兔子受伤最严重的肾组织,常常跟派伊的观察报告和考克斯(55),并确认寄生虫囊肿破裂的观察和免费的孢子在肾小管腔内。这表明复发释放孢子通过尿液和与其他作者的研究结果,报告没有孢子从兔子尿伴有严重肾脏纤维化和组织修复(1,56]。迄今为止,在多大程度上感染孢子传播是通过尿液采样患病动物的农场仍然未知。需要更多的研究来评估这些农场的健康状况对与动物福利相关的参数,如环境压力因素,管理记录和生理和富有成效的指标(57,58]。动物的感染源的研究仍然是未知的,因为这是第一次大肠cuniculi观察感染的农场。所有的动物都来自相同的兔子供应商;因此,一些动物很可能已经到达时被感染的。我们假设交通的压力可能引发了活跃的寄生虫感染和疾病的后续传播到其他兔子的设施。进一步的流行病学研究,特别是那些涉及临床健康动物,将使我们能够澄清的作用兔子的地理分布大肠cuniculi。
总之,大肠cuniculi代表人畜共患病的重要来源,这是第一次证实报告的病原体在农场肉类兔子在这个国家的一部分。主要的脑损伤是三级,恰逢C肉芽肿型的存在。大脑病变位于皮层,脑干,髓质。肾损伤也没有肉芽肿的三级。免疫病理现象的参与(过敏类型III和IV)三级病变肾脏和肝脏也建议(59]。所有的兔子都血清反应阳性的大肠cuniculi,表明这种病原体广泛分布在动物中供人类食用。此外,我们相信,这项工作将提供方向和疑似encephalitozoonosis有助于确诊。评分结果检查时可以作为指导大肠cuniculi在拉丁美洲的病变组织兽医实验室。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
作者感谢Paola Garza-Aleman她宝贵的技术援助。