Gamma-Radiation-Resistant的临床效果曲霉属真菌sydowii在无菌鼠免疫炎症性肠病

文摘

我们报告和调查的125不慎污染小鼠(位于两个无菌positive-pressurized光电隔离器)与新兴人类的病原体和珊瑚曲霉属真菌sydowii。受感染的老鼠对应基因线SAMP1 / YitFc,有100%免疫开发克罗恩氏病自发的病态倾向,即炎症性肠病(IBD)。病原体更新基于范围的回顾文献和临床观察和实验进行了讨论。无菌鼠的不必要的感染(免疫容易遭受慢性炎症)与人类病原体答:sydowii导致没有明显的临床疾病的迹象,在抓捕非法曝光期间,或在DSS-induced结肠炎实验。结果和观测表明,答:sydowii独自在免疫功能不全的临床效果有限无菌鼠或需要其他共生的微生物菌群曲霉属真菌相关疾病的发生。

1。介绍

到目前为止,有一些研究报告主要的严重程度和传播胃肠道免疫缺陷的宿主中曲霉病,包括儿童(1)(参见引用(2])。尽管曲霉病主要是局限于有氧表面,系统性感染和死亡率迅速被发生在人类和家畜(3),特别是在胃肠道屏障的破坏和相关微生物群(失调),从而增加对致命的系统性真菌感染的易感性(2]。侵袭性真菌感染,曲霉病占24%的人类患者。曲霉病,每五个病人发展致命的侵入性感染。

流行病学的兴趣,我们报告一位著名的海洋真菌病原体珊瑚和人类,曲霉属真菌sydowii,作为一个无菌的有害污染物(GF)群桑普/ YitFc小鼠免疫容易受到自发的炎症性肠病(IBD);它们克罗恩病肠道疾病)和其他multiorgan炎症并发症。它们这样的克罗恩病肠道疾病发生在两个特定的无菌小鼠100% (SPF)和无菌条件。曲霉病(中3),答:sydowii临床流行病学是有趣的,因为它是一个已知病原体导致海扇珊瑚死亡率(柳珊瑚ventalina;动物捕食浮游生物),各种威胁加勒比海珊瑚礁自1990年代(4),它似乎依然地理限制。感染导致循环紫色区域坏死不属证明珊瑚和死亡率。从人类分离出来的最初在美国从1989年的皮肤(如皮肤和指甲)感染(5),答:sydowii近年来被隔离病人的其他更遥远地区(捷克、俄罗斯)(6,7]。

老鼠在无菌条件下的风险非常高的感染任何共生体,致病性,或环境微生物。在这里,我们报告一例125无菌桑普/ YitFc老鼠无意中接触到答:sydowii通过商业无菌级辐射污染的饲料。(桑普/ YitFc)老鼠污染在这个研究特别容易答:sydowii机会性真菌感染,因为他们(i)无菌,因此缺乏保护竞争表面微生物共生的植物(微生物群),肠道和皮肤;(2)鼠标基因线免疫容易进步慢性肠道炎症,结膜炎,溃疡性皮炎;(3)他们减少清除病原体肠炎沙门氏菌(8];及(iv)因为无菌鼠没有保护性抗体介入适应性(内存)免疫与微生物接触共生体由于缺乏或致病微生物生长在无菌条件。

2。情况下

历史背景相关的报告,我们首先进行了系统范围的出版物答:sydowii自1980年发现于植物(9),直至2016年2月15日,使用PubMed和”曲霉属真菌sydowii“作为搜索关键字。然后我们调查了100年谷歌学术搜索(即点击率最高。,articles with the highest citations) and secondarily reviewed the title relevance of their Google citations referencing the papers for the years 2013–2015 to capture recently published studies with low citation indexes. Analysis of titles, abstracts, and content of 97 selected research studies indicates that the frequency of studies on emerging bioengineering and basic research on答:sydowii是呈指数增长的隔绝以来影响海扇珊瑚与濒临灭绝的珊瑚礁在西印度群岛在1990年代(图1)。范围审查也变得明显,对肠道的殖民和致病性答:sydowii在哺乳动物。mycobiome的假定的角色因为疾病因素在人类炎症性肠病(IBD)越来越多,我们认为相关的报告可衡量的死亡率和临床发病率的结果在这个污染事件,进一步了解动物mycobiome的角色。炎症性肠病的相关性,影响遗传鼠标线是仅有的两个可用自发为克罗恩氏病肠炎小鼠模型,主要受回肠炎(回肠炎症,即。最后一段小肠)。

图1

同行评审研究的频率曲霉属真菌sydowii呈指数增加在过去的十年里,与曲线的肩膀开始后,真菌与新兴传染病感染加勒比海珊瑚。第一份报告是在1980年在埃及工厂,(9]。在PubMed系统范围的评论文章,直到2016年2月。两步移动平均线(实线)和多项式估计曲线(虚线;出版物的估计;年)。

真菌感染机会,通常发生在免疫功能不全的主机(4,6),在人类和动物。SAMP1 / YitFc小鼠免疫相关性的对应基因线以痛苦自然进步肠道炎症,具有独特的三维结构相似性对人类克隆氏病病变(10]。SAMP1 / YitFc老鼠也有复杂的免疫异常外显率为100%。虽然部分理解,这些小鼠的免疫异常似乎从T-helper-1 (Th1)驱动的炎症在年轻的时候一个炎症过程由联合Th1 / Th2变更在成年动物也强调了疾病恶化。从力学上看,老鼠肠道上皮屏障和病原体清除障碍8,11),这可能会提高他们的素质在女朋友的条件下明显的真菌感染。

在此,我们描述了意想不到的快速、同时污染125只老鼠住在两个女朋友positive-pressurized光电隔离器答:sydowii在一个既定的女朋友育种机构(克利夫兰,哦,美国)在2015年6月。时间轴的概述在污染事件和随后的实验呈现在图2(即。,fungus detection, colony dismantling, and monitoring mice for signs of disease using an in-house caging system).

图2

时间轴的答:sydowii内部污染无菌鼠设施和实施无菌cage-based住房制度监控125只动物,开展DSS结肠炎实验。

简而言之,两个女朋友光电隔离器,每周畜牧业和鼠密度高(2 - 3育种者/笼;< 10尚未断奶的老鼠/笼;12 - 14笼子/隔离器),被观察到维护意想不到的凝结和增加湿度以及包含饲料颗粒覆盖模具一天2015年6月例行检查(第0天)。去除后,表面消毒Spor-Klenz®(1%的过氧化氢,10%的醋酸,0.08% paracetic酸;Steris Corp ., 6525年目录)检疫的笼子里(没有处理/打开盖子)发起的。目视检查饲料和床上用品材料显示大部分笼子光电隔离器均表现出不同程度的污染在一周内的模具检测。由于严重程度、程度和饲料污染,殖民地被拆除,测试真菌进行识别。所有的老鼠都转移到内部笼系统,并且每个笼子和动物监测明显的抑郁,腹泻,和眼部皮肤,或呼吸道疾病的人口水平(如果需要使用可用的评分系统)来确定感染的作用的整体健康状况。所有老鼠都检查每日保持无菌级不育,防止被其他微生物污染。

在接下来的两周确认模具答:sydowii临床,动物被确定为声音,表明沉重的接触答:sydowii孢子不一定导致死亡,或明显呼吸道、眼、皮肤感染,或在GF免疫缺陷小鼠容易腹泻和肠道疾病。18岁的单菌落PCR和桑格测序内部转录间隔器(ITS1-4)表示,三个真菌隔离来自光电隔离器非常相似答:sydowii序列存入基因库(数字3(一)-3(e))。引物ITS1太极拳GTA GGT棉酚有条件现金转移支付(5′GCG G)和ITS4(5′苑苑GCT答TGA答GC)被用于PCR扩增协议(详细描述12),用梦想Taq绿色PCR反应混合液(Thermoscientific), 0.1 g / L牛血清白蛋白,MgCl二甲亚砜的1%,6毫米₂,最后一个引物的浓度400海里。最初在94°C变性3分钟之后,35周期的变性30年代在94°C,退火在30年代50°C,在72°C和扩展了1分钟。循环完成后,有一个最终的扩展时间5分钟在72°C。PCR扩增的核糖体内部转录间隔区1(1)和2区域已被推荐为目标分子医学上重要的识别曲霉属真菌随着沉积序列的基因库(13]。该地区4也是测序在这项研究中;序列从这个报告中可用在基因库加入数字KU757469 KU757470, KU757471。“真菌陷阱”(弄脏弄湿的老鼠笼子里孵化为3周23°C)与笼子用临床观察期间确认的存在答:sydowii(图3(f)),支持缺乏疾病归纳这些immune-defective inflammation-prone老鼠尽管粪便的模具/床上用品材料。

图3

文化和分子识别曲霉属真菌sydowii。(一)答:sydowii在马铃薯葡萄糖琼脂补充与庆大霉素和氯霉素(30和125 mg / L)与典型的蓝绿色殖民地(实心三角形,三个不同的隔离GF-irradiated啮齿动物饲料在两个女朋友光电隔离器)。(b) Coculture青霉菌饲料隔离(开放三角形)强调菌落形态和色素生产答:sydowii(transagar色素)。(c)胶带的制备答:sydowii殖民地为了说明分生孢子,分生孢子,典型的果期头泡安排nonseptate分生孢子(400 x;相差显微镜检查从Remel Calcofluor白色;Alexa萤石430;发射541;吸收433海里;规模的酒吧,30米)。(d)看到不同的类型的分生孢子的形成答:sydowii。(e) Neighbor-Joining phylogram答:sydowii隔离的环境中其他18岁出版内部转录间隔器ITS1-4序列青霉菌spp。注意地区菌株的特写镜头序列不同。老鼠笼床上用品(f)全景照片(设置为“真菌陷阱”;即。,mouse cage incubated for 3 weeks at 23°C) at the end of clinical observation period confirming mice were still exposed or shedding答:sydowii。

鉴于人类皮肤感染的风险报告,模具的快速增长,和关键需要根除它女朋友设备和设施,所有的动物都被处以安乐死后临床观察期间,留下了一个小群老鼠BSL-2年级实验确定的角色上的真菌感染严重程度的急性结肠炎感应与葡聚糖硫酸酯钠(DSS)。DSS结肠炎是建立一个有效的方法来评估感染的肠道微生物致病性中的作用,包括假丝酵母spp,炎性肠道疾病的免疫学(10,14]。总之,7天葡聚糖硫酸酯钠补充(DSS)的饮用水(3%,w / v)的结肠炎导致肠道微生物群的存在。桑普/ YitFc老鼠相比殖民与普通特定的无菌的肠道微生物群,GF老鼠污染在这个研究中没有表现出临床症状的急性结肠炎基于临床症状典型的DSS-induced腹泻,体重损失,或减少盲肠的大小(数字4(一)- - - - - -4 (c))。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图4

DSS治疗没有引起典型的DSS污染小鼠结肠炎的迹象。(一)小鼠的体重(8周)污染的答:sydowii没有减肥相比,老鼠窝藏常规鼠标SPF微生物群(/组,2 /笼)。插图场景:含水量在每个笼子里水瓶表明所有小鼠消耗相同数量的DSS补充水。(b)尸检后DSS的实验。注意小的肝脏和脾脏、盲肠(左)答:sydowii老鼠老鼠,因为它预计在女朋友的条件下。(c)注意预期减少盲肠的大小在SPF小鼠DSS治疗后由于腹泻,食欲不振。

拆除后的光电隔离器和整个GF的安乐死老鼠殖民地,严格消毒协议已经实现。这些都是基于第四纪氨清洁剂去除有机物,70%乙醇去除油脂和脱水,Spor-Klenz消除微生物(细菌和真菌)孢子的女朋友设备。地板和其他表面消毒和Spor-Klenz Clidox®(二氧化氯、调药的目录96120 f)。污染的笼子被处理和动物操作(例如,粪便样本收集和体重测量)在生物安全柜中才能专门配备了新的高效微粒空气过滤器(HEPA),通常用氯气消毒。2016年7月,污染事件一年后,GF殖民地重建了修订协议对高压灭菌辐照饮食营养均衡提高饲料安全。没有进一步的污染事件与这个模具已经被观察到。

3所示。讨论

这是第一次报告的无菌动物污染事件对炎症性肠病的易感性增加任何真菌病原体。我们报告答:sydowiifeed-mediated首次曝光GF动物缺乏自然保护共生体(肠道和皮肤)微生物群,在遗传背景与微生物感染易感性增加。对于人类来说,这种病原体可引起腹膜炎(15),但没有报告肠道疾病的微生物。虽然肠道的通过答:sydowii在蜗牛(向量石帆疾病)导致了可行的孢子的分泌(16),我们没有检测到它们的存在在老鼠粪便使用文化琼脂板,表明肠道殖民是微不足道的,另外,肠道运输和/或代谢产物可以使孢子superdormant,一个现象发生在其他孢子形成的微生物通过其他方式,即芽孢杆菌种虫害和艰难梭状芽胞杆菌(17]。分子检测方法(14)不是用来检测粪便中真菌孢子,但(我)的存在答:sydowii最后观察期的老鼠笼子和粪便排泄物利用真菌陷阱,(ii)的临床症状缺乏感应DSS结肠炎实验,和(3)缺乏死亡率或明显临床发病率在笼子里最高负载光电隔离器内的孢子和监测期间(无菌动物的笼子里面)在125年没有一个动物表明这种病原体对小鼠免疫功能不全的临床疗效有限没有共生的菌群。

维护GF动物是一个昂贵和劳动力密集型实践高度倾向于不受欢迎的污染物。虽然曲霉属真菌可以分为污水营养的临床菌株(腐烂的植物)或(7),GF污染的主要风险是污水营养的压力。的来源答:sydowii出现在我们的辐照饮食是不确定的,但有可能一批生植物(因为污染答:sydowii是一种腐生真菌的腐烂的植物可以用于动物饲料制备)9)担任孢子幸存辐照源(18]。杀死90%所需的能量(1日志₁₀)的微生物种群(LD10)曲霉属真菌种虫害孢子被报道在0.28和0.60之间kGy的(19]。辐照剂量的20 - 30 kGy的常用治疗饮食为SPF动物,和剂量的40 - 50 kGy的推荐饮食用于无菌的或无菌动物(20.]。虽然是不可能的文档使用的辐照协议供应商的商业饲料GF殖民地,抵抗辐射生物工程感兴趣的,因为它是越来越知道黑暗着色真菌,通过黑色素分子,似乎保护他们在高度gamma-radiated环境,包括外层空间。曲霉属真菌sydowii是第三个最常见的真菌在美国国家航空航天局国际空间站18]。对致病性GF老鼠不能扩展到其他我们的发现答:sydowii因为毒性菌株似乎strain-dependent基于研究描述临床和环境隔离7]。真菌(最初认为是完全好氧微生物)然而修改host-microbial反应肠道疾病由于真菌毒素的生产,特别是某些菌株能够殖民厌氧的肠道(例如,因为它通常发生在反刍动物的前胃)。此外,答:sydowii可以修改host-microbial反应肠道内的其他共生的菌群通过表观遗传修饰符改变小说的生产抗炎(sesquiterpenoid)分子(21,22]。如果曲霉属真菌殖民厌氧肠道的能力,它可以调节生产的微生物群和肠道炎症分泌分子。这个病例报告只强调,这和其他真菌在炎症性肠病的相关性与其它元素的相互作用需要进一步的研究来控制重要的消化系统的功能,包括各种类型的共生体和dysbiotic肠道微生物群。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

特别感谢将当前和过去的成员的人员在动物资源中心凯斯西储大学(CWRU)与畜牧业的持续支持和协议;高中生杰西卡Ezeji技术援助;米蕾Simone Edelheit太太,Rajak,蒂娜南都在基因组学核心CWRU Sanger测序;艾丽西亚太太DePlatchett社论建议;和米哈伊尔·Khoretonenko博士在生物学系,莱克兰社区学院、科学讨论和编辑的建议。这项工作是由美国国立卫生研究院的资助DK091222 DK055812法比奥Cominelli和克罗恩氏和结肠炎基金会的美国亚历山大Rodriguez-Palacios通过职业发展奖。作者承认克利夫兰消化疾病的小鼠模型的核心研究核心中心(DK097948)。

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