文摘

棒状杆菌属伪导致干酪的淋巴腺炎(CLA),这是一个在绵羊和山羊传染性和慢性疾病。为了评估的组织病理学改变妊娠的生殖器官感染了细菌,20显然健康成年人布尔被分成四个接种组,皮内注射,鼻内,口服、和控制,由五个山羊。除对照组,未曝光,其他接种107CFU / 1毫升的生活c .伪通过上述各种路线。感染后三十天,卵巢、子宫和髂淋巴结收集细菌复苏和分子检测,以及组织病理学检查。均值变化坏死,充血,炎性细胞浸润,和水肿严重程度不同卵巢,子宫,髂淋巴结后不同的接种途径。总的来说,鼻内接种途径显示更严重( )病变器官检查。本研究的结果表明c .伪能使不孕造成病理病变的子宫和卵巢。

1。介绍

棒状杆菌属伪是革兰氏阳性兼性厌氧,小弯曲杆菌(1,2]。它通常被认为是一个重要的动物病原体引起干酪的淋巴腺炎(CLA)在绵羊和山羊。一些出版物报道,CLA可通过口头传播,皮内、鼻内,腹腔内路线(3- - - - - -7]。生物也被报道造成重大经济损失的农民由于隐藏和肉谴责(8- - - - - -11]。最近,我们的研究显示,妊娠孕激素和雌激素水平增加接种细菌;这可能使不孕因为改变激素水平影响排卵和植入(7]。基于上述研究,有可能的细菌可能影响生殖器官能源部并导致病变。

的发病机制c .伪的生殖器官很复杂,不是很清楚即使相信细菌传播通过传入淋巴结淋巴系统和内脏器官,在巨噬细胞内繁殖,生存phagolysosomal酶的作用[12,13]。然而,为了更好地理解其发病的机理与不孕症有关,有必要探讨生殖器官的病理变化和相关淋巴结万军之接种细菌。因此,本研究旨在调查的组织病理学变化相关的生殖器官和淋巴结的妊娠实验感染c .伪通过皮内、鼻内和口腔的路线。

2。材料和方法

2.1。道德的考虑

实验根据国际动物保健和使用委员会的指导方针,马来西亚Putra大学。实验过程的批准下进行动物保健和使用伦理委员会(芬欧蓝/ IACUC / AUP-R29/2014),马来西亚Putra大学在马来西亚需要动物福利法案(2014)。

2.2。动物和管理

二十(20)看似健康,没有布尔并没有CLA的历史被用于这项研究。山羊被保存在单独的笔。温度和通风的笔没有监管和山羊喂食与商业山羊丸(300克/山羊/天)。切纳皮尔草、矿块和饮用水随意。并适应了两个星期,血液样本和拭子样本(口腔、阴道和鼻)收集筛选的同学通过细菌隔离和PCR检测所述内et al。14]。直肠温度监控日报(早晚)和妊娠检查进行了实验前一周开始使用超声波机(brand-SIUI CTS 900 v和探针5.0 MHZ)。

2.3。发情同步

为了避免循环的差异变化,并都试图发情同步。阴道内的海绵包含30毫克flurogesterone醋酸(FGA)被插入了9天。海绵清除前48小时,cloprostenol (50μg)和孕马血清促性腺激素(PMSG;750 IU)肌内注射(15]。

2.4。细菌源和再确认

棒状杆菌属伪用于本研究从先前获得爆发干酪的淋巴腺炎在花园Pertanian大学,马来西亚Putra大学(16]。隔离是恢复脑心浸液肉汤。细菌在10%羊血琼脂和MacConkey recultured琼脂板和孵化在37°C 48小时。此外,生化测试(过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、脲酶和发酵的糖(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和木糖))进行细菌的进一步确认。

2.5。剂制备和集落形成单位数量

几个血琼脂平板的菌落接种到脑心浸液肉汤(BHI)和在一个孵化器孵化瓶组在37°C, 150 rpm 48小时。嗨肉汤连续稀释10倍。一个10毫升7同时使用稀释剂和镀上血琼脂平板集落形成单位(CFU)计数被阿尔卡莫17]。

2.6。实验设计

20山羊被随机分为四(组1、2、3、4)组。组2、3和4注射107cfu / 1毫升c .伪、皮内、鼻内和口头。组1一直未曝光作为对照组,1毫升无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)口服。所有的动物观察日常的临床体征和直肠温度监控整个研究期间。三十天感染后,所有的动物被宰杀放血和尸检进行收割的生殖器官及其相关淋巴结细菌隔离和标识c .伪和随后的PCR检测。

2.7。隔离和检测c .伪从组织

生殖器官的组织样本和髂淋巴结均质无菌培养血琼脂和孵化48小时37°C。殖民地与惊人的形态特征(即。,small, white, dry, and crumbly colonies) were subcultured onto new blood agar to get pure colonies. Biochemical tests (catalase test, nitrate reduction test, urease, and fermentation of the sugars (glucose, sucrose, maltose, and xylose)) were performed to confirm the bacterium.

2.8。DNA提取和聚合酶链反应(PCR)确认

从细菌中提取DNA文化使用DNAzol®根据制造商的指示(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/10503.pdf)。PCR引物和掌握混合买来IDNA生物技术Pte Ltd . PCR进行使用SensiQuest Thermocycler机器,设置30周期放大,后一个初始变性步骤在94°C 5分钟。每个周期涉及变性在94°C 1分钟,退火在56°C 1分钟,在72°C合成2分钟,在72°C和最终合成2分钟。对于每一个PCR反应管,共50μ包含2 L反应体积μL DNA作为模板,2μL (MgCl 25毫米2,2μ10 x Taq缓冲区(NH的L4)2所以4,0.5μL 10毫米的核苷酸,0.5μL底漆,0.5μL反向引物,0.5μL Taq DNA聚合酶(5μ/μL), 42μ分别添加L无菌蒸馏水。分析的放大产品在1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳的1.5μL FloroSafe DNA染色和运行60伏特(V), 350毫安(mA)为70分钟。本研究中使用的寡核苷酸引物是16 s rRNA基因(14]。正向引物使用(5′-CCGCACTTTAGTGTGTGTG-3′)和反向引物(5′-TCTCTACGCCGATCTTGTAT-3′),分别。PCR产品被检测到c .伪根据分子大小为816 bp所记录的内et al。14]。

2.9。组织病理学

孤立的生殖器官(卵巢和子宫)和相关淋巴结(髂淋巴结)收集和固定在10%缓冲福尔马林前3天处理。组织在一个自动处理组织处理器(德国徕卡TP 1020),然后嵌入在石蜡块,切割5点μ与标准的苏木精和伊红染色(圆))染色光微观评价(18]。

2.10。组织学病变评分

基于亨利et al。(描述的方法19)和Hair-Bejo et al。20.),组织病理学评分进行观察后十个幻灯片从每个器官。大约六微观领域每个幻灯片观察在不同放大(200 x 400)。三个接种组的病变和控制在0 - 3分是基于出现水肿,坏死,拥堵,中性粒细胞的浸润,变性,坏死。得分0表示正常(没有病变观察),1温和(病变观察不到30%),2温和(不到60%的病变观察),和3严重(60%以上的病变观察)。

2.11。统计分析

数据分析使用统计软件图垫棱镜(版本6.0)。一维方差分析与克鲁斯卡尔-沃利斯非参数测试用来测试损伤分数之间的差异在不同的接种组。被认为是重要的差异 。

3所示。结果

3.1。细菌再确认

生化试验进行证实了细菌c .伪。结果是过氧化氢酶阳性、硝酸盐还原和脲酶阳性。

3.2。PCR的确认和分析

816个基点的部分16 s RNA是独一无二的c .伪并通过PCR检测。组织的细菌分解动作山羊(卵巢、子宫和髂淋巴结)通过鼻内接种和口服接种路线16 s RNA阳性,而山羊的接种皮内检测PCR阳性仅从髂淋巴结的细菌培养。

3.3。组织病理学变化

均值的变化在卵巢坏死和拥堵在所有组和中度到重度的不显著( 三个接种组(表之间的)1)。然而,炎性细胞浸润在皮内注射组和卵巢是轻度中度到重度口腔和鼻内组(数字1(一),1 (b),1 (c))。

表1
意味着大量的组织病理学变化的卵巢妊娠的布尔接种实验c .伪。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
的显微照片部分卵巢妊娠的接种棒状杆菌属伪:(一)炎症和坏死细胞(圆)鼻内接种后;(b)炎症和坏死细胞(圆),拥堵布朗(箭头),口服接种后;(c)堵塞(黑色箭头),炎症和坏死细胞(黑色圆),皮内接种后(圆)×200)。

均值变化坏死、炎性细胞和拥堵在子宫轻度至中度以下皮内注射和口服接种和中度到重度的后鼻内接种(表2)。这些变化是显著提高( 鼻内组)和类似的皮内注射和口服组。另一方面,水肿相当在鼻内和口服接种后的子宫( )和显著降低( 皮内注射组(数据)2(一个),2 (b),2 (c))。

表2
意味着大量的组织病理学变化,妊娠子宫的布尔接种实验c .伪。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图2
显微照片部分妊娠子宫的接种棒状杆菌属伪。注意(a)炎症和坏死细胞布朗(箭头),变性的子宫内膜腺上皮(蓝色箭头),后鼻内接种;(b)子宫内膜腺体细胞的变性(黑色箭头),炎症细胞(橙色箭头),口服接种后;(c)炎性细胞黏膜下层(蓝圈),子宫内膜腺上皮细胞的变性和坏死(黑色箭头),皮内接种后(圆)×200)。

在髂淋巴结,脓肿是中度到重度和类似(分布 在皮内注射和口服组),而这是严重的鼻内组(表3)。然而,炎症细胞的分布和拥堵在皮内注射组轻度至中度,严重时,可比在鼻内和口服接种组(数字3(一个),3 (b),3 (c))。

表3
妊娠平均分数淋巴结病变的布尔接种实验c .伪。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
妊娠的显微照片部分淋巴结的接种棒状杆菌属伪:注意(一)嗜中性粒细胞浸润和微小脓肿中央坏死区域(黑色和橙色箭头),后鼻内接种;(b)炎性细胞浸润以中性粒细胞和巨噬细胞(黑色箭头),堵塞(蓝色箭头),口服接种后;(c)嗜中性粒细胞浸润和微小脓肿中央坏死区(黑色箭头),皮内接种后(圆)×400)。

4所示。讨论

本研究报告,首次观察到的变化相关的生殖器官和淋巴结妊娠的实验感染c .伪通过皮内、鼻内和口腔的路线。所有的动物接种机体通过不同的路线发展重要的生殖器官组织病理学变化与对照组相比;然而,山羊通过鼻内接种路线显示严重损伤生殖器官比其他路线。

我们观察到的组织病理学损伤卵巢比得上那些在子宫角。这些病变可能是由细菌或其磷脂酶D和可以解释我们早些时候的激素变化观察研究(7]。所有在场的卵巢病变观察的研究类似被悬崖et al。21在雌性老鼠实验接种c .伪及其磷脂酶D(骑士)。作者观察到的白细胞浸润腔卵泡排卵和广义的拥堵,血栓形成,变性,坏死的基质细胞卵巢。卵巢的变化观察到所有接种是否通过不同的路线可以关联到严重的生物活性,如dermonecrosis全面毛细管销毁细菌外毒素引起的(22- - - - - -24]。然而,这解释了出现坏死和血管堵塞在目前的研究。接种后水肿的子宫中找到所有的山羊也可能是由于外毒素的存在,磷脂酶D(骑士)。肉和Onon25)表示,鞘磷脂的水解和血浆蛋白质泄漏到周围组织可能发生的血管内皮膜透性的增加。在我们之前的研究7),我们调查了生殖激素水平变化的非孕接种住c .伪和报告水平的提高孕激素和雌激素在感染后三十天接种组。这些荷尔蒙的变化可以归因于病理条件在卵巢在这项研究中我们观察到。的异常增加孕酮也可以翻译成伪怀孕的迹象,从而损害正常的卵泡发育和排卵。福斯特(26)表示,说伪怀孕妊娠的动物可能源于mucometra或hydrometra子宫,这可能导致孕激素分泌增加。微脓肿观察髂淋巴结和被认为是典型的疾病的迹象。这些发现支持Adza Rina et al。6),发现山羊接种107浓度的生活c .伪通过鼻内路线发达脓肿肠系膜淋巴结和supramammary相比,口腔和皮肤内的路线。同样,Mahmood et al。27)观察到严重的脓肿形成,堵塞,出血、变性和坏死,炎性细胞浸润在波尔山羊皮下接种c .伪相比那些静脉注射接种的磷脂酶d。然而,所有这些研究未能调查协会髂淋巴结和女性生殖器官病变如子宫和卵巢。

细菌隔离显示存在的生物在所有口腔和鼻内接种后的组织,但只有在皮内接种后的淋巴结。因为巨噬细胞和树突细胞是第一个接触生物体通过皮内接种路线后,这些可能吞噬细胞吞噬细菌和进行通过淋巴引流淋巴结和细菌最终在其他组织中的节点增多。瓦利和帕里28)报道,CLA病变通常出现在内部器官,乳房,和常见的子宫,睾丸和阴囊。在一个相关的研究中,初级et al。29日]报道乳腺炎的发展和增加系统性嗜中性皮内接种c .伪乳腺的山羊。研究者也观察到supramammary肿大淋巴结脓肿形成。

5。结论

本研究表明,鼻内的路线是最有效的路线对CLA生殖系统感染病理病变观察到这些组织就证明了这一点。本研究进一步印证了我们之前发现CLA感染妊娠的并可能导致不孕导致生殖器官的病理变化以及生殖激素水平失衡。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

确认

作者要感谢穆罕默德Jefri本Norsidin,叶永佳璟Chee Puan•拉提法穆罕默德哈难,Puan Jamilah Jahari技术援助。这项研究是由教育部(MOE),马来西亚。