pcr分子诊断肝炎病毒(HBV和丁肝病毒)在丙肝病毒感染的病人和他们的生化研究

文摘

Seroprevalence丙肝病毒的发现表明丙肝病毒在全世界超过10%的乙肝病毒或HDV-infected患者导致肝病。这里显示乙肝病毒和丁肝病毒合并感染协会巴基斯坦与丙肝病毒感染的患者,研究疾病的严重性,可能的解释患者合并感染的相关危险因素。730包括肝脏病变的患者,其中501被发现感染丙肝病毒通过PCR阳性。5.1%的患者合并感染乙肝病毒,1%合并感染乙肝病毒和丁肝病毒。双重和三重感染患者的肝功能显著改变比单一的丙肝病毒感染。意味着胆红素、AST和ALT水平最高(3.25 mg / dL, 174 IU / L和348 IU / L)三重感染而双重感染患者的肝功能(1.6 mg / dL, 61 IU / L和74 IU / L)不够高,在单一感染(1.9 mg / dL, 76 IU / L和91 IU / L)。最突出的风险因素的单一(22%)和双重感染(27%)集团是“重复使用注射器”,而在三重感染“静脉注射毒品使用者”(60%)。认为乙肝病毒和丁肝病毒合并感染同巴基斯坦丙肝病毒感染患者和紧密相关的严重肝病合并感染的两倍和三倍的可能性应该保存在考虑。

1。介绍

慢性肝炎肝相关发病率的常见原因是由于不同肝病毒、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎(丙肝)已确定的主要原因(1),导致许多并发症。每年超过一百万人死于因乙肝病毒相关并发症(2,3]。丙肝病毒也会导致许多并发症,包括肝细胞癌在32%的感染患者4]。多种病毒感染,就会导致管理问题发生率较高的发病率和死亡率(5]。因为乙型肝炎、丙型肝炎和肝炎D份额几乎相同的传输模式,多个病毒感染是可能的(6]。因此,双重和三重病毒感染已经从世界各地报道(7]。

丙肝病毒是一个正链RNA病毒,已被分为属Hepacivirus同属黄病毒属(8]。缺乏适当的实施国际标准在输血等程序,重用的注射,注射吸毒者,纹身,从理发师剃须,未杀菌的牙科重用的耳朵和鼻子穿刺针,和手术器械在巴基斯坦是丙肝病毒传播的关键因素。在世界范围内,大约有1.7亿人感染了丙肝病毒,和三个四百万人诊断为每年新发病例(9),而1000万人在巴基斯坦被假定是丙肝患者在一般人群患病率为5% (10]。

乙型肝炎病毒属于肝病毒科的家庭(11]3.2 kb的圆形基因组组成部分双链DNA (12]。乙肝抗原在巴基斯坦的平均是2.4%(范围1.4 - -11.0%)在健康成人和儿科人口的2.4%。使用注射器的重用和不安全的输血传播乙型肝炎的主要原因是(10]。δ型肝炎病毒(HDV为),首次发现由Rizzetto et al。13)在慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者,是一个独特的单链负环状RNA病毒基因组的1.7 kb需要乙肝病毒感染的辅助功能(14]。它最初被认为是一个新的核抗原与乙型肝炎病毒(5),但后来被证明是一个新的病毒,需要乙型肝炎病毒的表面抗原(hbsag)来支持它的生命周期和传染性15- - - - - -17]。丁肝病毒的患病率占15 - 20几百万人已经感染乙型肝炎病毒(18]。非常有限的患病率和流行病学数据可用丁肝病毒感染在巴基斯坦。丁肝病毒感染存在于16.6%的乙肝病毒感染患者在巴基斯坦(19]。在另一项研究从卡拉奇合并感染被报道的35.2%。这是进一步解释说,乙肝病毒/丁肝病毒合并感染导致的抑制HBV DNA。相当比例的HBV /丁肝病毒e抗原阴性的患者合并有积极感染乙型肝炎和肝硬化相比那些monoinfection [20.]。诊断多种肝炎病毒感染是由低水平的有限认识医生简单的诊断测试和可用性。最近,好结果证明了单个集成在人类血清蛋白质微阵列,可以同时确定两个病毒抗原抗体(HBsAg和e抗原)和七(HBsAb、HBcAb HBeAb, HCVAb, HDVAb, HEVAb,和HGVAb)人类肝炎病毒在20分钟21]。

三重感染的治疗选择是有限的,拉米夫定单独或结合干扰素并没有显示多少受益的患者合并感染丁肝病毒(22]。由于没有报告从巴基斯坦人口(三重感染肝炎病毒引起的23),本研究的目的是找到的巴基斯坦的乙肝病毒和丁肝病毒合并感染丙肝病毒感染的病人。

2。材料和方法

2.1。病人和样品

atta - ur - rahman目前研究应用生物科学学院(非洲性病),国立大学的科学和技术(社交),与资本合作发展局(CDA)医院、铁路医院(IIMCT)、拉瓦尔品第,伊斯兰堡,巴基斯坦拉瓦尔品第市的圣家医院。该研究机构审查委员会批准(IRB),非洲性病和社交。

在目前的研究中,共有730名患者,肝病,包括被称为非洲性病诊断中心期间从2009年7月到2010年3月。在研究过程中,静脉血样采集整夜禁食后在早上。137个样本收集从资本发展机构(CDA)医院,伊斯兰堡,257年样本政府圣家庭医院,拉瓦尔品第,铁路155年样本医院(IIMCT), atta - ur - rahman拉瓦尔品第,181从学校应用生物科学(非洲性病)诊断。

2.1.1。丙肝病毒RNA的提取

血清的病人受到病毒RNA提取利用QIAamp病毒RNA提取工具包(试剂盒),根据制造商的协议。

2.1.2。定性分析(pcr检测)

与慢性丙型肝炎感染所有ELISA阳性样品被PCR进一步确诊丙肝病毒的存在。间接ELISA法用于检测丙肝病毒抗体的两步孵化过程(microLISA)。

2.1.3。嵌套PCR检测HCV RNA

病毒RNA被送往reverse-transcribe 5′NCR使用Moloney丙肝病毒的小鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RTase, Fermentas)反应总额的20倍μl反应混合物中含有4μL MMLV (5 x)缓冲区,1μL M-MLV逆转录酶(RT)酶,1μ0.5 L核苷酸(10毫米)μ1.5 L核糖核酸酶抑制剂(Fermentas)μL核糖核酸酶游离水,1μL特定反义底漆P2 5′-ACTCGCAAGCACCTATCAGGCAGTAC-3′(Macrogen、韩国),和10μL模板(病毒RNA)。互补脱氧核糖核酸合成使用ABI Veriti thermocycler 96 -好。周期互补条件如下:42°C 55分钟70°C 10分钟紧随其后。互补脱氧核糖核酸生产是短期储存或储存在4°C−20°C长期存储。互补脱氧核糖核酸产品是用于感染丙肝病毒的定性分析。第一轮PCR进行使用感觉P1 5′-CCCTGTGAGGAACACTGTCTTCACGC-3′和反义P2 5′-ACTCGCAAGCACCTATCAGGCAGTAC-3′引物(Macrogen、韩国)之后,第二轮PCR(嵌套PCR),使用第一轮产品内在感觉P3 5′-GAAAGCGTCTAGCATGGCG-3′和反义P4 5′-CACAAGGCCTTTCCGACC-3′引物(Macrogen、韩国)。pcr进行使用聚合酶(Fermentas) 35周期。PCR产品可视化1.2%琼脂糖凝胶和存储−20°C到进一步使用。

2.1.4。检测患者血清样本中丙肝病毒感染

丙肝病毒的血清样本检测乙型肝炎病毒的感染。分析乙型肝炎病毒感染,带设备(美国ACON)使用。检测表面抗原夹心ELISA方法(microLISA)。

2.2。乙型肝炎病毒DNA通过PCR检测

乙型肝炎病毒的检测,表面的特定部分基因放大通过PCR HBV基因组DNA使用特定的正向和反向引物。

2.3。病毒DNA提取

病毒DNA分离的血清乙肝病毒感染患者的样本使用试剂盒工具包(德国)根据制造商的协议。

2.4。聚合酶链反应

提取的DNA进行PCR检测乙肝病毒的。20μL PCR反应混合物含有DNA, PCR反应混合液(50单位/毫升的Taq DNA聚合酶反应中提供专有缓冲pH值8.5,400μdATP, 400μdGTP, 400μdCTP, 400μMgCl M dTTP, 3毫米₂)(Promega猫。# M7502), 10毫米底漆(Macrogen、韩国),5′-CCGAATTCGCCACCATGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCT-3′和10 mM的反义底漆(Macrogen、韩国)和5′-CCCGAATTCGCCACCATGCGAACCACTGAACAAATGGCACT-3′。三十的循环DNA进行了放大。每个周期的条件在94°C变性45秒钟,引物退火在45秒64°C,和45秒72°C伸长,紧随其后的是最后一个72°C伸长了7分钟。与内嵌套引物PCR产物进一步放大,10毫米底漆(Macrogen、韩国),5′-CCCGAATTCGCCACCATGGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCT-3′,和10 mM的反义底漆(Macrogen、韩国)5′-CCCGAATTCGCCACCATGGGCACTAGTAAACTGAGCCA-3′额外30周期相同的反应条件下。PCR产品可视化1.2%琼脂糖凝胶和存储−20°C到进一步使用。

2.5。检测ELISA的δ型肝炎病毒(HDV为)

所有病人的血清HBV DNA阳性,PCR检查使用第三代anti-HDV抗体的ELISA测定工具包(全球诊断、意大利)使用制造商的协议中所述的方法。总之,将孵化器。所有的试剂都带到室温使用前(约1小时),没有把盘子从袋子里。所有组件都摇动了。然后板从包中删除。血清样本的1/20稀释管分开准备通过增加5μL 95样品μL样本稀释溶液稀释(1/20)。80年μL样本稀释的解决方案是添加到所有井除了那些分配给控件。20μL 1/20稀释血清样本,100μL积极控制,100年μL(截止(截止一式两份),和100年μL消极的控制被添加到相应的井。板着一张密封和孵化60分钟。然后antigen-conjugate复杂的准备。海豹被吸入液体从所有井洗五次,0.3毫升的清洗解决方案。然后马上100μL重组antigen-conjugate复杂的添加到每个好,覆盖着一张密封,并在孵化器孵化60分钟。海豹被从所有井和液体是吸气和洗五次0.3毫升的清洗解决方案。后,100年μL底物溶液添加到每个好,室温下孵化20分钟,受光,然后立即50μL停止解决方案添加到所有井,最后与ELISA板读者阅读450海里的1小时内停止。

2.6。生化因素

以下生化检查在本研究测试。空腹血糖水平,总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL),丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、胆红素、空腹甘油三酯(TG)是由麦蓝300年测量装置(默克公司)。慢性丙型肝炎患者血清的501对这些参数进行了分析。

2.7。统计分析

在统计分析临床变量均值±SD。意思是,SD,价值,CI(95%)和标准错误使用独立的计算和比较以及。为价值,重要性水平是5%。使用计算机软件完成数据分析,为windows SPSS 16.0版。

2.8。数据收集的危险因素

常见的危险因素评估与丙肝病毒传播,不存在省级数据采集系统。数据收集进行采访的每个病人和使用调查问卷。

3所示。结果

3.1。样品的分子筛查

共有730个样本,疑似丙型肝炎感染,受到pcr检测病毒RNA,其中501(平均年龄的病人)样本证实HCV阳性,给一群大约的大小。227年英国石油公司在PCR,如图1。

3.2。乙型肝炎病毒感染丙肝病毒阳性病例的筛查(合并感染)

共有501名丙肝病毒阳性样本筛查HBsAg通过检测试纸技术(ICT HBsAg);501个样本,33(6.6%)被发现HBsAg阳性。这些33个样本筛选HBV DNA通过嵌套PCR技术和嵌套PCR的结果如图所示2。积极的样品给一个乐队的大小近似的242个基点。共有31(6.2%)发现HBV DNA阳性样本和数据表1。

3.3。对丙肝病毒和乙肝病毒的筛查合并丁肝病毒感染病例

确认样品后HBV DNA, 31(乙肝病毒和丙肝病毒)合并样本进一步丁型肝炎病毒(丁肝病毒)感染筛查。Anti-HDV ELISA筛选进行乙肝病毒和丙肝病毒合并感染样本,发现5 (HCV阳性总数的1%)样本阳性Anti-HDV抗体显示501个样本总数的1%有三重感染丙肝病毒,乙肝病毒,和丁肝病毒,平均年龄的,如图3和4。

3.4。肝功能生化参数()的单,双,三感染病人

501年的样品被分成3组:(1)患者的单一感染(HCV),(2)双重感染患者(丙肝病毒和乙肝病毒),和(3)三重感染患者(丙肝病毒、乙型肝炎病毒和丁肝病毒)受到分析肝功能测试,也就是说,ALT, AST,胆红素。在单一感染的情况下,平均水平的AST、ALT、和胆红素被发现76 IU / L, 91 IU / L,分别和1.9 mg / dL。这些水平是61 IU / L, 84 IU / L和1.6 mg / dL的双重感染AST, ALT,分别和胆红素。三重感染肝功能的平均值是174 IU / L, 348 IU / L,分别为3.25 mg / dL(表2)。

3.5。评估潜在风险因素与单一的传播,双重和三重感染

各种可能的危险因素,例如,输血、注射吸毒者,牙科操作,剃刀共享,在当前的研究中观察到与每一个负责感染传播,双重和三重感染有数字6,7,8和表3。

3.6。数据的统计分析

所有501名患者被纳入研究;229人(46%)是女性的平均年龄和229年(54%)是男性的平均年龄。性别和年龄的摘要丙肝病毒感染患者协会在桌子上4。很明显从表4没有显著的性别关系/平均年龄的病人和丙肝病毒感染。

仅在第一组感染丙肝病毒单一,数量没有显著差异的男性(53%)和数量的女性(47%)以及男性的平均年龄(和女性的平均年龄)如表所示5。在第二组与双肝炎感染(丙肝病毒+乙肝病毒)案件不同于第一组。男性双重感染的数量都比女性(69%)的两倍多(31%)。女性的平均年龄在这个组和男性,如表所示6。在第三组与三重肝炎感染(丙肝病毒、乙型肝炎病毒和丁肝病毒)观测结果是不同的。所有的病人在这组男性的平均年龄。

3.7。比较合并感染患者的肝功能(HCV / HBV)和单一感染(HCV)

合并感染患者的肝功能(丙肝病毒和乙肝病毒)比较与丙肝病毒感染的病人通过独立以及。发现双重感染患者的肝功能显著降低(接近正常的值)与单一感染患者值0.020 < 0.05和0.052的ALT、AST和胆红素,分别如图5。

三重感染患者的肝功能(丙肝病毒、乙肝病毒、丁肝病毒)与单一感染患者相比(HCV)通过独立以及。发现三重感染患者的肝功能显著提高(从正常的值)与单一感染患者的所有三个值< 0.05 ALT、AST和胆红素,如图5。

研究对象被分成三组。在第一组,病人有单一感染丙肝病毒被放置,和第二组由患者感染丙肝病毒和乙肝病毒的两倍。的病人感染了所有三个病毒被安置在第三组。

3.8。可能相关的航线合并感染的传播

为了建立一个协会合并感染与传播途径(两倍或三倍),整个数据的传播路线被分成10组比较和单合并感染患者之间的路线。分析数据后发现,与合并感染相关的最重要的传播途径是静脉注射毒品使用者(IDU) 50%(6/12)的受试者合并感染乙肝病毒和丁肝病毒被发现。从这些数据,另一个可能相关的合并感染的传播途径可能是多个输血23%(3/13)合并感染的病例。性传播的情况下,使用受污染的工具,鼻子和耳朵穿孔(11.1%的合并感染患者在每个)和卫生保健工作者(10.3%)也被认为是作为合并感染相关的传播路线如图6,7,8。

4所示。讨论

丙型肝炎患者合并感染乙肝病毒的频繁在巴基斯坦和这项研究表明,与丁肝病毒双重感染也是一个严重的问题。由于不同肝病毒是一种常见的慢性肝炎肝相关发病率的原因。乙肝(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的主要原因是慢性肝炎(1,24,25]。它已经表明,重复感染甲型肝炎或E在乙肝病毒和丙肝病毒可能导致病人的恶化和增加或沉淀脑病(26]。多种病毒感染,就会导致管理问题发生率较高的发病率和死亡率(5]。双重和三重病毒感染被报道来自世界各地。乙型肝炎、丙型肝炎和肝炎D分享相同的传输模式,多个病毒感染是可能的(6]。当前研究的目标是确定的双重或三重病毒感染在慢性丙型肝炎患者,乙型肝炎和肝炎D三重感染(s)的影响(如果存在)肝炎的肝、和风险因素参与其传播。

在目前的研究中,501名丙肝病毒阳性样本,54.3%男性和45.7%女性,进行乙肝病毒双重感染的筛查和31(6.2%)被发现阳性双重感染。双重感染患者筛查的丁肝病毒和5个(1%)被发现阳性三重感染。在本研究中,HBV DNA中发现55.2%的病人在24.1%。其次是丙肝病毒这种效应可能是由于这一事实,作者主要引入乙型肝炎诊断和测试他们的病人丁肝病毒和丙肝病毒时主要是慢性肝炎的病人堂和测试三种病毒。感染主要是通过注射药物(即。乙肝病毒和丙肝病毒)。在肝脏感染的情况下,水平的ALT, AST,通常和胆红素上升表明肝损伤。均值的AST、ALT和胆红素水平仅在慢性丙型肝炎患者被发现国际单位/ L,国际单位/ L分别mg / dL。丙型肝炎患者合并感染乙肝病毒的,意味着AST、ALT、胆红素水平被发现是61(±15.39),84(±16.26),和1.6(±0.73),分别。AST和ALT水平的酶和胆红素在三重肝炎相对较高相比单/双感染。肝功能(图5和表2)174(±77.00),348(±117.05),和3.25 (±0.88)。发现多个使用注射器(110)(94)(22%)和牙科操作(18.7%)是丙肝病毒的主要传播途径,以防单独或合并感染乙肝病毒,而使用受污染的针头的独立的原因是三重肝炎影响研究对象中有80%的患者。大部分的患者参与研究(96)(20.4%)甚至不知道他们是如何获得这些病毒感染。这可能是由于缺乏对病毒性肝炎的认识,卫生条件差,缺乏适当的处置废弃物。几乎在所有样本,丙肝病毒通过IDU的收购;丙肝病毒seroprevalence注射吸毒者中,89.7%与10.5%相比noninjection吸毒者,和IDU是迄今为止最强的丙肝病毒感染的风险因素多变量分析。

相互竞争的利益

作者认为他们没有利益冲突。

作者的贡献

穆罕默德纳西尔Riaz进行分子诊断研究和Ummar Raheel主要是参与统计数据和解释数据。穆罕默德Faheem做样本集合,Hashaam帮助在平面设计,我们Najam萨哈尔Sadaf Zaidi参与编译并最终确定。所有作者都参与论文准备,数据分析和修正。

确认

作者感谢国立大学的科学和技术,促进他们的研究。他们也感谢巴基斯坦科学基金会提供资金来开展这项工作。

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