文摘

我们在本研究旨在确定(我)的频率隐孢子虫物种在肾移植患者(RT)和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和(2)关系的性质,症状的严重程度和持续时间与不同物种和负载隐孢子虫。粪便样本从70年(42 RT和28个艾滋病毒)和140年免疫功能不全的患者,没有修改Kinyoun隐孢子虫病的染色受到qPCR-melting曲线分析寄生虫种类的识别。qPCR检测到一个显微镜下负样本为隐孢子虫病是积极的。c . hominis,c以及,混合感染被发现在50/71(70.4%),19/71(26.8%)和2/71(2.8%)的患者,分别。隐孢子虫病的患者有更高的大便频率(中位数,差:4,3 - 6 / d和3、2 - 4 / d;)和水样粪便(52/71[73%]和64/139 (46%);)。寄生虫负载(中位数,差:日志₁₀6.37(5.65 - -7.12),日志₁₀5.81 (4.26 - -6.65);)和恶心/呕吐(29/50[58%]和5/19 (26%);)更频繁c . hominis而不是c以及感染。因此,隐孢子虫spp。(主要是c . hominis)是一个RT和艾滋病患者腹泻的常见原因。

1。介绍

coccidian肠道寄生虫隐孢子虫种虫害是肠胃炎、腹泻的常见原因的人(1,2]。它会导致严重,大量的腹泻在免疫功能低下的患者如人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者[3,4]。然而,有一个缺乏研究隐孢子虫种虫害在肾移植(RT)接受者(5,6]。被感染的病人表现出不同程度的临床表现。一些有严重症状的患者长时间而其他人在1 - 2周后恢复温和的攻击。这种多样性的原因,这可能是由不同的基因型或物种的隐孢子虫spp。,或者他们的不同负载或宿主免疫力,到目前为止尚未充分研究。

人类隐孢子虫病主要引起的隐孢子虫hominis和c以及,负责大部分的爆发隐孢子虫到目前为止所描述的。其它不太常见的物种c . meleagridis,c .地道,c . viatorum,c·缪里斯,c .犬属,c .猫属,c是,c . andersoni(7- - - - - -13]。c . hominis可能会引起更严重的感染c以及和其他动物传染病的物种7,14- - - - - -16]。相比之下,在从印度的一项研究中,HIV阳性的病人,人感染c以及和其他人畜共患物种往往比感染发烧更频繁c . hominis(11]。因此,临床表现的变化可能是由于不同的隐孢子虫物种。基因分型的隐孢子虫主要研究患者的艾滋病毒感染。目前没有研究基础上的隐孢子虫肾移植受者中种虫害。性质之间的关系,症状的严重程度和持续时间和不同种类的隐孢子虫在RT接受者,尚不清楚。

逆隐孢子虫病的发生和CD4 T细胞计数之间的关系在很多研究中已有详细记载在艾滋病患者。艾滋病毒/艾滋病患者CD4细胞计数较低(< 200细胞/ cumm)的风险较高,隐孢子虫病(4,17),严重感染细胞低于50 / cumm CD4细胞计数(3,18]。这样的研究极少在RT接受者。事实上,参与细胞免疫的在还没有调查隐孢子虫病在肾移植受者。

显微镜和ELISA诊断的支柱隐孢子虫种虫害,但无法区分不同物种之间。分子技术如聚合酶链reaction-restriction片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型的支柱。然而,耗时,需要post-PCR处理,容易交叉污染和假阳性结果19]。实时定量PCR (qPCR)是一个高度敏感的和特定的分子检测的基本工具隐孢子虫种虫害和量化其负载。在一个封闭的管试验它阻止post-PCR污染和消除耗时的过程的需要,像凝胶电泳。qPCR评估需要考虑的诊断疗效缺乏足够的数据。

因此,我们进行了前瞻性研究,以确定不同种类的频率(我)隐孢子虫患者感染免疫功能不全的患者(艾滋病毒和RT)实时PCR (qPCR)和(2)关系的性质,症状的严重程度和持续时间与不同种类的隐孢子虫和他们的负载。

2。材料和方法

2.1。病人

70免疫功能不全的患者(42 RT接受艾滋病毒感染患者和28),拥有隐孢子虫感染、有无腹泻、参加三级护理中心,2008年至2014年,被纳入本研究。包括艾滋病毒感染患者按国家艾滋病控制组织的指导方针(20.]。RT接受者接受至少一个肾移植是招募。显微镜是用来检测和qPCR的遗传特性隐孢子虫spp。卵囊负载也由qPCR决定。隐孢子虫病的患者的临床和实验室参数是与140年相比免疫功能不全的控制(60艾滋病毒和80 RT接受者)没有隐孢子虫病(图1)。人口统计数据、临床和实验室参数记录在每个病人的标准问卷。研究协议批准机构伦理委员会(引用数量PGI /博士/ IEC / 57/21.10.2011),这是按照赫尔辛基宣言》(21]。

2.2。样品收集

连续三次从每个病人粪便样本和控制受到显微镜和文化。它的一部分存储在−40°C DNA提取生理盐水。血EDTA瓶收集病人的CD4细胞计数的病人。

2.3。样品处理

粪便样本受到常规显微镜使用生理盐水和碘直接湿挂载技术检测囊肿和营养体的寄生虫。凳子浓度后正式醚浓度技术,酸快速染色法(修改Kinyoun)用于检测的卵囊隐孢子虫spp。简单地说,诽谤是在修改Kinyoun孵化的污点20分钟和孔雀石绿是用作计数器污点22]。染色涂片进行光学显微镜。粪便样本也受到文化MacConkey,柠檬酸脱氧胆酸盐琼脂(DCA)和山梨糖醇葡萄糖鼠李糖琼脂(DSRA)排除了其他常见细菌制剂引起腹泻等沙门氏菌和志贺氏杆菌spp。23]。

2.4。的遗传特征隐孢子虫spp。

2.4.1。DNA提取

连续三次大便样本汇集成一个整除从每个病人和控制受到DNA提取使用QIAamp DNA-stool Mini-kit(试剂盒Inc .)、瓦伦西亚、钙、美国)根据制造商的协议做了一些调整;包括初始洗2%聚乙烯醇polypyrrolidone (PVPP)溶解在1 x磷酸缓冲盐(PBS)和孵化凳子裂解缓冲在80°C(缓冲美国手语)10分钟,偶尔搅拌。DNA纯化和筛选了按照制造商的指示。

2.4.2。聚合酶链反应(PCR)

聚合酶链反应(PCR)进行使用四个引物的扩增二氢叶酸还原酶(DHFR)基因,某种意义上和三个反义引物(CINF CINR, (1 r, 2 r),旨在检测隐孢子虫spp。c . hominis,c以及,分别。一直在前面描述的(使用的引物24]。样品呈阳性隐孢子虫种虫害两个基因型,但消极测序。Primer-pairs CINF CINR放大575 bp DHFR基因区域。Primer-pair CINF和1 r放大357 bp地区和Primer-pair CINF 2 r, 190 bp DHFR基因区域。PCR进行总量的20倍μL,组成10μL绿色Taq大师混合(2 x), 10 pmoles正向和反向引物和1μL模板DNA。100 ng /μL模板DNA从每个样本(中提取DNA)是用于PCR反应。三组反应与每个样本进行;一组与底漆CINF和CINR(检测隐孢子虫spp),第二个引物组CINF, 1 r(检测c . hominis);第三个引物组CINF, 2 r(检测c以及)。PCR条件初始变性5分钟在95°C,紧随其后的是40变性的周期在94°C 40秒,30秒退火54°C, 72°C伸长了45秒。这是紧随其后的是最后一个伸长一步72°C的5分钟。PCR产品经测序。

放大产品受到在2%琼脂糖凝胶电泳。序列的扩增子都使用各自的特异性PCR引物。序列比较与基因库中可用的数据库与爆炸N计划。

2.4.3。实时聚合酶链反应

放大在实时PCR进行机器Corbett研究6000年Q-PCR仪器(Rotor-Gene 6000软件,悉尼,澳大利亚)使用相同的组种特异的引物用于传统PCR (24]。放大轮进行了总量的20倍μL包含10μL KAPA-SYBR快速掌握混合(通用qPCR设备;Kapa生物系统),包含KAPA-SYBR DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶的工程版本专门为实时PCR, SYBR绿色我染料和优化氯化镁浓度)。模板DNA(有100 ng / mL /样本)的浓度增加了。PCR条件如下:最初在95°C变性10分钟,40周期为45秒95°C,然后退火在54°C 60秒,在72°C和扩展了40秒。荧光扩展一步中收集的数据。判别曲线分析(MCA),最后PCR循环完成后,执行一个快速变性在95°C 1秒,紧随其后的是30秒退一步在45°C缓慢坡道(0.2°C / sec)到80°C。反应混合物没有模板DNA作为消极的控制。

2.4.4。标准图形

标准曲线绘制了DNA提取纯化隐孢子虫以及卵囊,美国亚利桑那大学的商业购买的。卵囊(5×10的浓度⁷卵囊/毫升抗生素溶液)受到DNA提取DNA通过前面提到的协议使用QIAamp迷你包(试剂盒Inc .)、瓦伦西亚、钙、美国)(25,26]。标准图形生成通过连续稀释的卵囊股票(5×10⁷卵囊/毫升)5倍(对应于大约10⁷到10³卵囊/ mL /稀释)。DHFR基因/副本μL对应大约四次卵囊/稀释由于单份的存在这种基因/孢子体或4份/卵囊,卵囊由4子孢子。DNA提取每个系列稀释和100 ng /μL(提取的DNA受到qPCR使用特定的引物c以及估计每个连续稀释的DHFR基因拷贝数的DNA,从而构建标准的图(图2)。

2.5。数据分析

非参数和参数由Mann-Whitney连续变量进行分析测试和未配对以及分别。分类变量通过卡方检验进行分析。当量浓度卵囊的值(寄生负载)变成了日志₁₀和中位数和四分位范围(差)。值< 0.05被认为是重要的。所有统计分析使用社会科学统计软件包(SPSS 15日公司,芝加哥,美国)。

3所示。结果

3.1。人口统计学、临床和实验室的病人和控制参数

70年免疫功能不全的患者阳性隐孢子虫一种虫害显微镜和qPCR和qPCR孤单。虽然这个显微镜下的凳子的卵囊负荷- RT接受者,最初免疫功能不全的对照组中,相对较低,是日志₁₀6.65等效卵囊浓度,他被认为是感染。患者与其他寄生虫感染和致肠病的细菌被排除在分析之外。71的人口统计学和临床参数隐孢子虫病和139免疫功能不全的患者控制如表所示1。隐孢子虫病,腹泻,大便频率增加,水样粪便(表1)。

免疫功能不全的患者(包括艾滋病毒和RT)隐孢子虫病比未感染的CD4细胞计数较低(平均±标准差:细胞/ cumm与细胞/ cumm,)。艾滋病毒感染患者的CD4计数低于患者RT (细胞/ cumm与细胞/ cumm,)。隐孢子虫病感染艾滋病毒的患者的CD4细胞计数低于那些没有(细胞/ cumm与细胞/ cumm,)(图3)。相比之下,RT病人的CD4计数,没有隐孢子虫病,是类似的(细胞/ cumm与细胞/ cumm,)(图3)。此外,艾滋病病毒感染者的CD4细胞计数低于隐孢子虫病隐孢子虫RT感染患者(细胞/ cumm与细胞/ cumm,);嗜中性粒细胞计数在RT隐孢子虫病的患者往往低于隐孢子虫感染艾滋病毒的患者(细胞/ cumm与细胞/ cumm,)。

隐孢子虫病的RT接受者往往比那些没有收到三重免疫抑制药物,经常收到双或单免疫抑制剂(41/43,95.4%和2/43,4.6%和0/43;)。霉酚酸酯(MMF)、Wysolone和他克莫司被用于患者有无隐孢子虫病(17/43,39.5%和30/80,37.5%;)。历史上经常报道抗逆转录病毒治疗的患者比那些没有隐孢子虫病(21/59和3/29,)。

3.2。的遗传特征隐孢子虫spp。

隐孢子虫hominis,隐孢子虫以及,混合感染被发现在50/71(70.4%),19/71(26.8%)和2/71(2.8%)的免疫功能不全的患者,分别。c . hominis,c以及,混合感染检测中20/28(71.5%),7/28(25%)和1/28(3.5%)的HIV阳性的病人和30/43(69.8%),12/43(28%),分别RT接受者和1/43 (2.2%)。c . hominis显示平均峰值°C时c以及是在°C, MCA(数字4和5)。只有一个显微镜下负样本呈阳性c . hominis,这也证实了测序。提交的数量加入基因库的序列是BankIt1855902 Seq1, KT735247, BankIt1856029 Seq2, KT735248, BankIt1856031 Seq3, KT735249, BankIt1856033 Seq4, KT735250, BankIt1856035 Seq5, KT735251, BankIt1860090 Seq1, KT831947, BankIt1860090 Seq2, KT831948, BankIt1860090 Seq3, KT831949, BankIt1860090 Seq4, KT831950,和BankIt1860090 Seq5, KT831951。

3.3。关系性质、严重程度和持续时间的症状,不同的物种

人口、实验室和临床参数的病人感染隐孢子虫hominis和c以及如表所示2。患者c . hominis感染通常有恶心和/或呕吐和增加卵囊负载(用当量浓度的卵囊在粪便样本)相比,患者感染c以及(;表2)。然而,发热、腹痛、频率和持续时间的腹泻患者之间的可比性c . hominis和c以及感染(表2)。

3.4。关系性质、严重程度和持续时间的症状和寄生虫负载

卵囊的平均负载隐孢子虫种虫害艾滋病毒感染患者和RT相当(日志₁₀5.65差(4.73 - -6.89)和日志₁₀6.37差(5.81 - -6.79),)。患者有腹泻有更高的拷贝数(或等价的卵囊浓度)隐孢子虫比那些没有日志₁₀6.37差(5.8 - -7.05)和日志₁₀4.96差(3.92 - -6.06),))。

4所示。讨论

在当前的研究中,我们发现(a)c . hominis和c以及是只有两个隐孢子虫种虫害检测在免疫功能低下的患者,(b)隐孢子虫病通常伴有腹泻,大便频率增加,水样粪便,(c)c . hominis感染更频繁地与恶心和/或呕吐和卵囊负载比增加c以及,(d)腹泻患者高拷贝数(或等价的卵囊浓度)隐孢子虫比那些没有种虫害。

在目前的研究中,c . hominis和c以及是只有两个隐孢子虫种虫害检测到免疫功能不全的患者。到目前为止,基因分型隐孢子虫种虫害已经完成主要感染艾滋病毒的病人。有稀疏的数据基础上的隐孢子虫种虫害RT接受者之一。在研究来自南非的艾滋病病毒感染者27)、北美(28,29日),南美洲(7,30.),和欧洲31日),c . hominis是最常见的物种。然而,在一些其他的研究中,c以及被发现更普遍比吗c . hominis(32- - - - - -35]。来自印度的研究还揭示了c . hominis是最普遍的物种感染艾滋病病毒感染者(36,37]。最近的一项研究报告从印度北部两三个隐孢子虫隔离从RT接受者c . hominis和一个c以及小亚基PCR-RFLP(四)核糖体rna基因(38]。这表明人类的传播感染的主要来源。我们所知,目前的研究也许是唯一一个来自印度、实时PCR用于检测和遗传特性的隐孢子虫spp。

在这项研究中qPCR检测到隐孢子虫在一个示例所错过的显微镜。负载的卵囊在此示例中是相对低于其他。因此,粪便显微镜由一个专家一样好qPCR检测隐孢子虫。然而,qPCR卵囊负载减少时是有用的。此外,物种识别,这可能有临床意义,可以通过qPCR和显微镜是不可能的36,39]。qPCR PCR扩增子省略的利用实时检测的要求限制消化或序列分析的基因。

目前的研究表明,CD4细胞计数是艾滋病患者更少隐孢子虫比没有感染。众所周知在先前的研究,患者有较低的CD4细胞计数在隐孢子虫病的风险更高。慢性隐孢子虫病通常发生在患者CD4计数低于200细胞/ cumm [18,患者CD4计数低于50细胞/ cumm患有严重感染(3]。事实上,一些研究已经记录之间的关联CD4细胞计数< 200个细胞/ cumm和隐孢子虫病症状,在艾滋病患者11,17]。然而,这样的研究缺乏RT接受者。在我们的研究中,RT患者CD4细胞计数低,在HIV阳性患者隐孢子虫病,建议损耗的免疫细胞和CD4细胞计数负责以外的因素对隐孢子虫病的易感性在RT的病人。亚组分析显示中性粒细胞计数往往更低隐孢子虫RT患者感染艾滋病患者。嗜中性粒细胞计数低RT病人可能归因于一些immune-suppressive药物。因此,不仅形式的免疫恢复HAART疗法,而且管理immune-suppressive治疗可能有助于间隙的寄生虫,在免疫功能不全的主机。

在这项研究中,RT接受者的隐孢子虫病主要是两倍三重免疫抑制药物,免疫抑制剂。霉酚酸酯(MMF)的结合,Wysolone,和他克莫司药物主要是用于病人和对照组。在从巴基斯坦的一项研究中,RT接受者有隐孢子虫病的免疫抑制药物管理组成的环孢霉素/吸收FK506,咪唑硫嘌呤/霉酚酸酯(MMF),类固醇(强的松/ Wysolone) (40]。在另一项研究环孢菌素被用于感染RT接受者(41]。至今没有联系的隐孢子虫感染已被证明与任何免疫抑制药物。事实上,有稀疏的数据隐孢子虫病在RT接受者。大规模的后续研究,解释的类型和剂量免疫抑制剂及其管理隐孢子虫感染RT收件人,可能会进一步澄清这个问题。

在目前的研究中,c . hominis与频繁的恶心和/或呕吐和增加卵囊负载相比c以及。因此,感染所致c . hominis更严重c以及感染。这是按照先前的研究从秘鲁、显示c . hominis与腹泻、恶心、呕吐、全身不适,增加卵囊剥离强度和持续时间。相比之下,人畜共患隔离c以及只与腹泻相关(7]。在英国的一项研究,持续时间c以及感染显著低于c . hominis(,)[14]。同时,c . hominis据报道,导致更严重的感染比吗c以及(14]。在这项研究中提到c . hominis作为一个“专家”,尤其是感染人类宿主,表现出更多的毒性比“通才”特征c以及。来自巴西、儿童c . hominis感染已报告了更多的卵囊在凳子上42]。同样在对儿童来自印度的一项研究中,c . hominis感染是导致更严重的腹泻16]。相比之下,在从印度对HIV阳性病人的一项研究中,人感染c以及和其他人畜共患物种往往比感染发烧更频繁c . hominis(11]。建议免疫缺陷负责变更的易感性隐孢子虫人类物种通常非传染性的(11]。

目前的研究也有一些局限性。这项研究不涉及后续的病人。后续研究在同一将决定实际感染的流行病学和临床表现的异质性。然而,我们的研究结果,添加一些新信息到现有的知识。

总之,隐孢子虫种虫害是肾移植受者的腹泻的常见原因,如艾滋病毒阳性患者。因此,临床医生不应忽视在这些患者中发生的隐孢子虫病的可能性。c . hominis是最常见的隐孢子虫种虫害检测艾滋病毒和RT病人,表明anthroponotic寄生虫的传播方式主要在免疫功能低下的患者,特别是在印度北部。实时PCR是一个重要的和时效的诊断的工具隐孢子虫种虫害以及它的遗传特性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

Ujjala戈沙尔承认美国生物技术(印度生物技术部),印度新德里(参考印度生物技术部圣号102 / IFD /圣1839/2008-09)提供金融援助进行这项研究。Asmita总督也感谢大学拨款委员会(UGC),新德里,发放奖学金。