文摘
2010年9月,霍乱爆发从Odisha报道,印度东部。霍乱弧菌从临床分离样本生化和血清学证实血清组O1,生物型El Tor和血清型小川。多重PCR筛选了各种基因的存在,也就是说,ompW,ctxB,zot,rfbO1,tcp,王牌,hlyA,ompU,rtx,和toxR,在所有的隔离。隔离是对复方磺胺甲恶唑、萘啶酸、多粘菌素B,壮观霉素、链霉素、四环素、磺胺甲恶唑,甲氧苄氨嘧啶,和vibriostatic代理2,4-diamino-6, 7-diisopropylpteridine (O / 129)。四环素的最低抑制浓度减少羰基氰化物的存在米-chlorophenylhydrazone (CCCP),表明射流泵的参与。PCR分析证实我类整合子的存在以及SXT元素窝藏抗生素抗性基因在所有隔离。测序揭示的存在ctxB古典生物型基因所有的隔离。El Tor的隔离包庇RS1-CTX原噬菌体数组类型rstR和古典ctxB在大型染色体。研究表明,霍乱弧菌El Tor变异进化在该地区有更好的抗生素耐药性和毒性的潜力。
1。介绍
霍乱仍然是一个主要的全球卫生问题的重要性就是明证最近海地暴发和津巴布韦。在2013年,共有来自各大洲的47个国家报告了129 064霍乱病例,包括2102例死亡,病死率1.63% (1]。产毒素的霍乱弧菌,霍乱的病原体,展出了改变的生物型模式以及耐药性的更好生存和感染(2,3]。古典生物型霍乱弧菌菌株后导致早六个埃尔托型霍乱大流行取而代之的是第七大流行株。的变体霍乱弧菌El Tor应变具有古典生物型霍乱毒素后出现O139菌株的出现,已经成为普遍的全球4]。药敏模式不断变化霍乱弧菌(2]。四环素是一个重要的广谱抗生素用于预防和治疗各种细菌感染,包括上市biothreat代理炭疽杆菌,土拉杆菌内,鼠疫杆菌(5]。它的首选控制霍乱的世卫组织建议的(6]。早些时候,我们报道一种新的突变ctxB基因的爆发2007年从Rayagada隔离(19.09°N 83.27°E), Odisha,后来在同一等位变异在海地暴发分离(7,8]。这些分离株耐药,但对四环素敏感(8]。2010年劳动力,另一个观察霍乱疫情在同一地区Rayagada, Odisha。在这种沟通中,我们报告四环素耐药的出现霍乱弧菌从这个印度东部爆发。
2。材料和方法
2.1。分离和鉴定霍乱弧菌
总共27个霍乱弧菌隔离从随机选择恢复患者在9月的霍乱疫情期间,2010年,从Rayagada Odisha区(19.09°N 83.27°E)。样本收集使用无菌直肠拭子从病人和加工如前所述9]。霍乱弧菌隔离是通过使用标准的生化方法识别和确认。血清学鉴定的隔离是由幻灯片使用商用多价抗血清凝集霍乱弧菌O1群(美国Difco)。Voges Proskauer (VP)测试,绵羊红细胞溶血和多粘菌素B敏测试进行隔离的生物型的确定。其他细菌菌株用于研究参考霍乱弧菌O1 El Tor(写明ATCC 14033),霍乱弧菌O1古典(写明ATCC 11623)霍乱弧菌O139(写明ATCC 51394)。
2.2。PCR检测毒性和种特异的基因
基因组DNA提取从每个使用基因组DNA的分离净化设备(MBI Fermentas维尔纽斯,立陶宛)和筛查的存在两套不同的基因特征的多重PCR (mPCR)所描述的其他地方10]。第一个mPCR检测基因编码外膜蛋白的存在(ompW)、霍乱毒素(ctxB),zonula occludens毒素(zot)、O1 o抗原(rfbO1),毒素coregulated纤毛(tcp)。第二个mPCR放大其他毒性和产毒素的基因编码辅助霍乱肠毒素(王牌)、溶血素(hlyA),外膜蛋白(ompU),重复毒素蛋白(rtx)和毒素调节器(toxR)。
2.3。抗菌素药敏测试
抗菌素的敏感性霍乱弧菌隔离是由Kirby-Bauer盘在Mueller-Hinton琼脂扩散法(11),和最低抑制浓度(MIC)计算了肉汤稀释法根据临床实验室标准协会的指导方针12]。抗生素光盘和抗生素粉是从Oxoid采购有限,英国,和西格玛奥德里奇,美国分别。抗生素光盘使用氨苄青霉素(10μ氯霉素(30克)μg)、环丙沙星(5μg)、复方磺胺甲恶唑(25μ红霉素(10 g)μ萘啶酸(30克)μg)、多粘菌素B (50μg)、利福平(5μg)、壮观霉素(100μ链霉素(10 g)μsulphamethoxazole(100克)μ四环素(30克)μg)、甲氧苄氨嘧啶(5μg), vibriostatic代理2 4-diamino-6 7-diisopropylpteridine, O / 129 (150μ克)。选择抗生素的麦克风是计算羰基氰化物的存在米-chlorophenylhydrazone (CCCP) subinhibitory浓度。参考菌株大肠杆菌写明ATCC 25922,金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,铜绿假单胞菌写明ATCC 27853被用于每个测试内部质量控制。
2.4。移动遗传元素及其基因磁带
第1类整合子和SXT constins被PCR检测为描述Hochhut et al。13]。基因磁带的存在aadA2(编码抗链霉素和壮观霉素),箍(编码抗链霉素),blaP1 (编码的阻力β-lactams),福罗(编码耐氯霉素),dfrA1(编码耐甲氧苄氨嘧啶)是由PCR如前所述14,15]。
2.5。测序的ctxB基因
的ctxB基因从隔离放大使用前面描述的引物(16]。使用相同的PCR引物进行测序96 -毛细管模型3730 xl系统上使用大染料终结者工具包应用生物系统公司(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。seq的序列编辑程序(应用生物系统公司),与序列ctxB参考株的基因霍乱弧菌O1 El Tor,古典和O139。推导的氨基酸序列ctxB基因的菌株一致使用CLUSTAL W。
2.6。分析RS1和CTX前噬菌体的数组
安排RS1和CTX噬菌体是由PCR。RS1元素的存在证实了PCR使用rstC特定的引物(其它地方描述的那样17]。的引物,,被用于rstR打字的RS埃尔托型元素和古典和差异化的霍乱弧菌(18]。数组的位置RS1-CTX前噬菌体的大型染色体,插入CTX前噬菌体的小染色体,RS1的串联重复序列和CTX前噬菌体染色体上测定PCR如前所述[17]。
3所示。结果
3.1。识别爆发菌株
总共27个临床菌株霍乱弧菌从影响病人孤立在Odisha霍乱疫情期间,印度东部。生化测试的基础上,所有的埃尔托型隔离被发现属于隔离VP测试是积极的,羊血琼脂溶血性,对多粘菌素B。
3.2。基因特征
两套复合PCR显示所有疫情隔离总是积极的各种毒性和特有的基因,也就是说,王牌(309个基点),ctxAB(536个基点),hlyA(480个基点),ompU(655个基点),ompW(304个基点),rfbO1(638个基点),rtxC(265个基点),tcpA(805个基点),toxR(779个基点)zot(947个基点)基因(表1)。
3.3。抗生素耐药模式
抗菌盘扩散试验显示所有隔离对复方磺胺甲恶唑、萘啶酸、多粘菌素B,壮观霉素、链霉素、四环素、磺胺甲恶唑,甲氧苄氨嘧啶,和vibriostatic代理2,4-diamino-6, 7-diisopropylpteridine (O / 129)。然而,隔离是敏感,氨苄西林、氯霉素、红霉素、环丙沙星和利福平。表中给出了选择抗生素的麦克风2。羰基氰化物的存在米-chlorophenylhydrazone (CCCP)抑制剂主要主持人总科(MFS)蛋白在肉汤subinhibitory浓度(0.5μg / mL),减少麦克风四环素8倍(16 - 2μg / mL)和隔离变得敏感。从1024年挺也减少了对甲氧苄氨嘧啶麦克风μ克/毫升到256μ克/毫升,而麦克风对萘啶酸、链霉素、磺胺甲恶唑,氨苄青霉素(表尚未受到影响2)。
3.4。耐药发生率元素
PCR分析显示我类整合子的存在以及SXT元素窝藏抗生素耐药性特征对多种药物的隔离。隔离是阳性aadA2(链霉素和壮观霉素)dfrA1(甲氧苄氨嘧啶)基因磁带,但为阴性blaP1(β内酰胺抗生素)磁带14]。压力也呈阳性箍进行SXT constin,对链霉素产生了耐药性。然而,所有的隔离都为阴性福罗(氯霉素)基因。
3.5。序列的分析ctxB
推导的氨基酸序列分析CT-B从代表隔离不同参考CT-B El Tor应变N16961和O139菌株在第39(组氨酸的酪氨酸)和位置68(苏氨酸代替异亮氨酸),但类似于CT-B单元引用古典菌株569 b(图1)。然而,没有观察到突变位置20,被发现的霍乱弧菌隔离从2007年前爆发(图1)。
3.6。噬菌体的数组
霍乱毒素基因ctxAB位于CTX的单链DNA噬菌体是一种丝状噬菌体(20.]。有特定站点集成CTX噬菌体的DNA进入霍乱弧菌染色体。产毒素的菌株含有遗传元素RS1 CTX噬菌体有关。RS1元素发现相邻(5′和3′)CTX前噬菌体。几种类型的CTX噬菌体/ RS1数组中发现了疫情霍乱弧菌压力(21]。在这项研究中,rstC特定的引物组rstCF/rstCR放大DNA,表明染色体RS1元素的存在。PCR产品放大了rstCF/期显示的存在RS1-CTX前噬菌体的数组。相比之下,ctxBF和rstCR一对引物没有给出任何放大,表明缺乏CTX prophage-RS1数组。没有DNA片段使用底漆对放大ctxBF /期和rstCF4 / rstCR4的串联重复序列,表明没有CTX前噬菌体基因组和RS1元素,分别。位置RS1-CTX噬菌体原数组的大型染色体与PCR证实放大产品使用Ch1F/中继卫星和ctxBF/Ch1R引物。隔离产生了PCR产品使用Ch2F/Ch2R引物没有指示CTX前噬菌体或RS1元素在小染色体。RS1-CTX原噬菌体阵列如图2。
4所示。讨论
霍乱弧菌O1 El Tor菌株在环境中应该有更好的适应性和更有效地殖民肠道流明比经典的一个(22]。然而,古典类型的霍乱毒素会导致更大的肠道内腔积液El Tor类型的毒素(相比23]。因此,混合的生物型属性霍乱弧菌提高感染潜在和适应性的环境显示他们的流行病学成功。暴发的变体类型菌株与更多的液体损失和增加病死率(24]。现在已经成为全球威胁,大部分的暴发菌株与变体El Tor菌株在印度和其他国家(3,7,16]。
从这个爆发被认为是所有隔离霍乱弧菌O1生物型El Tor Ogawa血清型。隔离怀有各种产毒素的致病基因(表1)。的存在ompW ctxB,和rfbO1证实了基因霍乱弧菌物种,其产毒性,组1抗原“O”侧链的有限合伙人(血清组),分别。的存在rtxA或rtxC基因决定了生物型的霍乱弧菌O1群(25,26]。所有埃尔托型隔离在这个研究属于基础上重复的毒素基因(rtxC)。
测序的ctxB基因显示所有霍乱弧菌O1 El Tor隔离在这个研究ctxB序列的古典生物型。埃尔托型古典生物型菌株取而代之的是第七和当前流行的霍乱。两个生物型的霍乱弧菌O1群密切相关的o抗原生物合成的基因。然而,CTXΦ的基因组结构,霍乱毒素基因的控制,古典和El Tor生物型之间的不同20.,27]。CTX前噬菌体的遗传结构的基础上,RS1元素在每个染色体,非典型El tor菌株被分为两个不同的组(17,28]。组1株港古典CTX前噬菌体的串联重复序列的小染色体组II菌株包含RS1和CTX前噬菌体与El Tor类型rstR和古典ctxB在大型染色体28,29日]。在这项研究中所使用的所有菌株属于组II和包含RS1和CTX前噬菌体El Tor类型rstR和古典ctxB在大型染色体。
Odisha位于孟加拉湾海岸和一般的爆发在与洪水和飓风(10,30.]。El Tor变异株中循环Odisha Rayagada地区自2000年以来,出现在2002年,但在2007年首次爆发是由于这段应变(10,31日]。我们所知,这是第一次当四环素耐药克隆变异El Tor应变导致Odisha爆发。最近,四环素耐药霍乱弧菌菌株从其他几个印度部分地区已报告32,33]。四环素是控制严重的霍乱病例的首选药物(6]。因此,耐四环素进一步限制的列表的成本有效的一线药物控制霍乱。
所有的霍乱弧菌隔离在这个研究怀有第1类整合子和SXT constins。在这个地区,qacEΔ1和sul1基因提供抗铵化合物和磺胺类,分别。所有的隔离是积极的aadA2和dfrA1基因,分别给予抗链霉素和甲氧苄氨嘧啶。然而,所有的隔离PCR阴性blaP1参与抵抗的β内酰胺抗生素(表1)。的SXT constin共轭,self-transmissible,提供抵抗sulphamethoxazole综合元素,甲氧苄氨嘧啶、氯霉素、链霉素。在这项研究中,所有隔离都容易氯霉素和PCR阴性福罗基因。此外,链霉素抗性的基因(箍)总是存在于所有的隔离。
整合子自然基因工程提供平台,结合基因磁带和将它们转换为确保正确表达功能基因的细菌。目前的研究表明,现在霍乱弧菌暴发菌株携带移动抗生素基因元素和这些基因的水平转移是多药耐药性菌株的出现的主要原因。印度的常用抗生素治疗腹泻的氟喹诺酮类原料药(DNA损害药物),从而诱导SXT元素的水平转移导致国米,种内的多药耐药性的传播(34]。因此,使用这类药物应该密切关注最近的爆发菌株携带这些元素(16,19,35]。
麦克风的四环素CCCP的存在减少了8倍,表明射流泵在四环素抗性的作用36]。然而,对萘啶酸(32麦克风μg / mL)仍未受影响的挺指示的参与一些其他机制也对抗生素耐药性。四环素耐药性革兰氏阴性细菌发生由于收购射流泵和核糖体保护基因编码的蛋白质。大部分的射流泵属于主要主持人总科(MFS),出口四环素从细胞和交换质子浓度梯度(37]。此次疫情的隔离PCR的负面报道核糖体保护蛋白质春节(M)的弧菌属(数据没有显示)。射流介导耐四环素(春节基因)的弧菌属主要表现为非霍乱弧菌物种(37]。因此,详细调查的机制是必要的。近年来,临床菌株抗菌素耐药性是一个严重的问题,因为它妨碍了疫情控制策略(10,19,35]。因此,抗菌素耐药性爆发可以增加大小,持续时间、病死率。持续监测抗菌药物敏感性以及strain-tracking霍乱控制是重要的适应政策在国家和全球水平。
加入核苷酸序列号码
的基因库加入数字ctxB VCR4序列,VCR5, VCR6, VCR7, VCR8,和VCR9 JX846970 JX846971, JX846972, JX846973, JX846974和JX846975分别。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者感谢主任,国防研究与发展机构(DRDE),瓜廖尔,为本研究提供必要的设施和资金的工作。m . Jain是感谢印度医学研究理事会()提供高级研究奖学金。