裁剪病原体基因表达的免疫反应通过定制

文摘

大多数的研究集中在建筑和再造的细菌病原体主要依靠毒性因素的击出或删除/氨基酸残基的突变然后观察微生物的表型,对宿主的免疫反应产生的影响。这些基因敲除菌株也被建议作为疫苗对抗细菌性疾病。理论上,基因敲除菌株将无法引起疾病,因为他们的毒力因素已被移除,但他们可能诱发保护性记忆反应。虽然基因敲除菌株有价值的工具来识别宿主免疫毒性作用的因素和细菌病机、他们无法产生临床相关的疫苗。合成生物学的出现和增强的用户定制基因改变了这个二进制淘汰赛的过程,其次是观察。最近的研究表明,研究人员现在可以调整和定制特定微生物的基因表达来产生所需的免疫反应。在这个评论中,我们强调这些研究作为控制炎症反应的新途径以及疫苗开发。

1。介绍Codon-Pair定制的病原体

合成生物学的新兴领域和微生物设计有可能影响许多领域,包括疫苗建筑和宿主免疫反应的控制1,2]。使用rational基因与减毒病毒疫苗株毒力使用电脑软件和定制生产新创DNA合成公司允许修改核苷酸序列(3- - - - - -5]。合成病毒基因一直再造工程基于修改的遗传现象两个密码子的偏差(CB)和codon-pair偏差(CPB)。这两种方法可以被认为是同义的定制的目标基因,因为他们依靠同义密码子替换为给定的氨基酸插入沉默突变病毒或细菌基因呈现氨基酸顺序不变。因此,目标基因是“也”记录产生定制的DNA序列。CB关注插入目标基因的个体,罕见的同义密码子在给定位置控制毒性和翻译效率的手段。例如,稀有的主机密码子是交换到目标病毒基因组,这反过来抑制翻译。CB逆优化已成功应用于脊髓灰质炎病毒的衣壳地区产生减毒活疫苗候选疫苗(4,5]。体独立于CB因为它规范了密码子使用基因组内计算每一对密码子的表现之前,它集中在相邻的配对密码子在一个目标基因。CPB逆优化也被证明是一个手段减弱病毒毒性(如脊髓灰质炎病毒、甲型流感病毒和HIV)和构建候选疫苗通过使用不同的同义词codon-pairs [3,6,7]。重要的是这两个方法可以控制病毒毒性但修改后的基因组编码相同的氨基酸为野生型。这允许一个完美匹配野生型目标,反过来,多产的候选疫苗的免疫反应。两种途径的定制开发冗余基因编码产生的基因改变的翻译。

最近,这个微生物的过程设计应用除了病毒致病细菌(2]。在本文中,我们将关注重点修改,因为细菌病原体的研究链球菌引起的肺炎(SP)演示了使用CPB修改的能力来调节宿主免疫反应的控制除了基因表达(2]。CB和心脏都有极大地扩展了基因的序列空间定制。微生物学家不再受二进制(光开关开/关)野生型或细菌基因敲除菌株的方法修改。CPB修改允许操纵目标基因的核苷酸序列,逐步的方式控制其表达率(2,3]。已经证明,缅共的定制目标基因允许基因表达的滴定,类似光衰减器,即密度记录基因在极少数codon-pairs,慢是翻译这沿着梯度可以控制。一样的心脏病毒疫苗设计的工程方法在科尔曼等人,穆勒等。3,16)是用来修饰毒素ofSP, pneumolysin(厚度)。由此产生的SP pneumolysin基因的应变水平降低(厚度)表达和降低毒性在活的有机体内(2,3]。这种方法的新颖性在于合理设计基因的蛋白表达减少但不能消除。此外,表达在逐步减少滴定允许进步减少毒性因子表达式;的密度厚度在统计上弱势codon-pairs,慢是翻译。先前在细菌毒力基因调控方法依赖淘汰赛中基因的目标和完全消除基因表达,从而清除抗原的免疫系统可能需要提高响应。正如它们的名字所暗示的,毒力因素是基因和基因产物表达的细菌病原体引起损害宿主生物体,疫苗研发目标(11]。毒力因子是一个通用术语,这些致病基因产物包括分泌毒素,pili用于主机依恋和胶囊抑制吞噬作用。虽然毒性因素都归类为致病性细菌(12)体的初始焦点与修改,这个基因设计方法实质上是一种缓慢的速度翻译的目标基因;因此它可以用于所有类型的细菌基因修改。

,重点描述了一个现象,即编码两个连续的氨基酸的密码子发现彼此相邻或高或低频率比预期的codon-pairing基因随机发生,没有偏好(3,6]。相似之处codon-pairing频率观察到在生命的三个领域,尽管具体codon-pairs表示/偏好不同于物种[13]。体中观察到许多生物的基因,包括人类,可以量化统计(3,14]。心脏会影响翻译的速度(3]。测量和评估每个codon-pair人类基因组密码子使用正常化时,观察到一些成对出现统计上,不到如果配对是随机的。这表明,有一个选择性压力这些弱势对“避免”。体的现象表明,codon-pairs抑制核糖体的功能可能是“弱势”或避免表达基因,因为相应的图示在滑动核糖体发生不良反应,从而减少翻译的效率(2,15]。背后的具体机制如何翻译这些弱势codon-pairs实际上减缓尚未照亮但是是一个非常有趣的大道去追求我们可能会进一步了解codon-pairing偏好,因为它涉及到基本的基因结构。此外,弱势对减缓了翻译在人类细胞中基因(真核生物)和细菌细胞(原核生物),支持假设的能力缓慢的速度翻译跨物种类型。在原始研究CPB定制疫苗建设,相邻的综合改造codon-pairs脊髓灰质炎病毒和甲型流感病毒病毒基因组的翻译效率,减少导致病毒毒力的重要衰减在活的有机体内(3,16]。合成和野生型病毒相同的氨基酸序列;然而,“重新编码”同义的病毒,弱势(即。慢)codon-pairs导致减少毒性(3,17]。有趣的是,另一组在西班牙,表型上使用CPB反优化方法,能够影响和改变复制的hiv - 1的属性7]。这表明反优化体外循环的病毒基因组核糖体翻译慢慢的主机可以改变病毒复制和致病性的通用方法,无论基因组结构(17]。

建立在研究病毒系统、心脏定制扩展到细菌病原体链球菌引起的肺炎全球(SP),肺炎的主要原因(18]。SP是针对CPB修改开始新的途径克服新兴临床现象称为血清型替代(STR) [19]。SP共有92种血清型;然而,只有13日或23种血清型都包含在当前的儿童或成人疫苗,分别为(20.]。STR SP血清型的增长出现未被目前利用anti-SP疫苗,因此这些SP血清型肺炎的主要原因,侵入性疾病、感染和其他并发症SP (19]。因此,寻求的是一个“通用”SP疫苗提供cross-serotype保护和一些SP领域的建议,整个细胞,减毒活疫苗病毒可能会产生一个“通用”SP疫苗(21]。科尔曼等的研究集中于一个STR serotype-3 SP (SP3)体应变特别是修改应用于反优化pneumolysin毒素基因(厚度)表达式。通过综合修改厚度,SP3应变构造(SynSP3)减毒,比野生型SP3和,令人惊讶的是,一个控制Δ厚度SP3敲除菌株(2]。体的初始衰减SP3提供修改是一个小说在细菌疫苗发展可能允许改进的设计在活的有机体内未来的候选疫苗的效果。CPB定制downmodulate表达厚度在SP证明我们可以现在第一次表达野生型菌株毒力因素,来刺激免疫反应。例如,pneumolysin(厚度)是一个已知的免疫激活剂甚至在subhemolytic水平(22),最近,它已经被证明可以激活肥大细胞(尤其是subhemolytic级别)增加了肺炎球菌间隙(23]。肥大细胞激活厚度允许增强早期检测和可能会限制在侵入性肺炎球菌传播肺肺炎球菌病。因此,在未来的疫苗配方包括野生型毒力因素,我们可以利用压力,拥有所有野生型抗原表位主机需要提高免疫反应对我们假设收益率疫苗株与增加在活的有机体内功效。SynSP3引发的免疫反应的性质实验动物管理也提供了洞察底层机制对接受疫苗的免疫反应。

2。用户选择调制的宿主免疫反应:超越基因敲除菌株

以前,减毒活疫苗细菌疫苗的建设主要集中在击出毒性基因产生削弱应变或应变,可以携带其他抗原(24,25]。这是一个直接的、逻辑的方法:淘汰赛(删除)的基因导致宿主损伤产生的污渍仍然提供保护和所有其他保护性抗原表位。然而,这种方法已经被证明基本上不成功,没有knockout-vaccine应变目前在美国市场上。例如,人类肠道细菌感染的主要病原体,在世界是细菌性腹泻产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)。目前,对ETEC没有疫苗。每年有超过十亿贝的疾病和发展中国家的数百万人死亡26,27]。ETEC-induced腹泻是最常见的疾病有经验的国际旅行者和部署的美军士兵28]。到目前为止,所有antigen-based疫苗,以及原型淘汰赛人类ETEC疫苗,显示低保护效果(29日]。自然接触ETEC菌株在特有的设置以及旅游者产生保护性免疫的发展,表明减毒活疫苗疫苗能刺激的适应性免疫反应提供长期免疫(27,30.]。Knockout-ETEC菌株已经进入临床试验(31日,32)测试作为疫苗,但他们一直不成功29日]。我们假设基因敲除菌株对许多细菌疾病有困难会成为减毒活疫苗疫苗,因为通过毒力因子,免疫反应是“太冷”诱导受体,阻止诱导保护性免疫的2]。有多个例子的减毒细菌基因敲除菌株检测作为人类疫苗和/或实验动物(29日,33,34];虽然这些菌株在展示价值这些毒性因素在发病机理中的作用,无法作为商业疫苗突出淘汰赛的缺点与毒性相关的因素。最初的表达和数据显示减少毒素在活的有机体内功效的合成SP染色证明细菌毒素基因的“需要重新编写”是细菌疫苗建设一个创新的新途径。

提供的结果CPB-modified SP3应变可能揭示到为什么这种基因敲除的方法已经失败,为构建减毒活疫苗细菌疫苗提供一种新方法。毒力基因敲除是一种二进制的方法;毒力因子是目前在野生型水平或完全删除。相比之下,使用CPB逆优化可用于表达逐步抑制基因的表达(2]。不再是研究仅限于一个二进制控制细菌毒力基因表达(野生型和淘汰赛)。现在看来,毒性基因的表达可能需要免疫系统激活和响应(23,35,36]。在野生型水平,这些毒性基因破坏主机服务,导致疾病甚至死亡。毒性基因淘汰时主机,不大可能发生免疫激活和主机可能无法全面和适当的反应(可能是一个原因前敲除菌株作为疫苗不足)(12,23,31日]。损坏反应框架(连接部的一个主机如何回应和病原体毒力因素Pirofski和卡萨德沃尔(被首次提出8,9]。DRF推测人类疾病产生的微生物感染表现在两个方向有一个反应太健壮(有害的主机)或反应不足,允许无节制的入侵和屈服于感染。相关的例子,这两个结果是:(1)“太热”的免疫反应被称为“细胞因子风暴”,被认为是死亡的主要原因之一,1918年流感37),或(2)“太冷”免疫反应,允许逃避某些SP血清型(例如,血清型8 SP)表达nonhemolytic pneumolysin。这些nonhemolytic血清型侵入性肺炎球菌病的主要原因是由于缺乏免疫诱导(38,39]。只有两个点在DRF曲线上可以获得之前科尔曼et al .,“太热”或“太冷”免疫反应的病原体。CPB定制,它提供了进步downregulation表达式的毒素厚度在SP3,开始提供第一个证据支持DRF因为它提供了中间点在曲线上。具体地说,进步downregulation的毒力因子允许“恰到好处”的诱导免疫反应预防疾病感染动物和诱导保护性免疫(图1)。在图1,DRF曲线已经适应证明理论上“恰到好处”引发的免疫反应合成压力像SynSP3-there最小主机损坏,但最大的保护性免疫反应。有实验证据支持这一假设。时的表达厚度在SynSP3显著降低,但不会消除,毒性降低,这是一个函数类型的免疫反应引起的2]。与野生型小鼠感染SP3应变经历了名(控制)炎症反应引起的野生型的毒素pneumolysin水平。这个反应是低水平的CD4细胞的特征⁺和CD8⁺细胞相比SynSP3 [2),以及过度和有害的招聘CD45的肺⁺LY6G⁺多形核白细胞(中性粒细胞)的细菌被pneumolysin间隙函数(图2)[40]。众所周知,野生型SP3造成的有害的免疫反应的特点是重要的(过度)IL-17和其他促炎细胞因子分泌(41]。此外,一个偏重于中性粒细胞的不成比例的细胞反应发生,导致过度主机损坏(42,43]。与野生型小鼠感染SP3分泌的细胞因子il - 10相比,小鼠感染SynSP3(图2)。il - 10是一种已知的抗炎细胞因子和炎症反应的监管机构。高浓度的细胞因子il - 10在SP-infected老鼠(与增加生存44]。由科尔曼等人支持这些发现野生型SP3的假设导致了一个名,“太热”炎症反应,监管不足是由于il - 10的表达不足。相比之下,老鼠感染Δ厚度SP3应变产生了“太冷”的免疫反应,可以描述为平庸,当观察中性粒细胞(图2)以及CD4细胞⁺和CD8⁺细胞(数据未显示)渗透(2]。老鼠感染Δ厚度SP3应变有柔和的招聘的免疫细胞和死于感染以同等速度作为野生型SP3 [2]。野生型SP3应变和Δ厚度SP3代表前面的二进制方法毒性因子工程和疫苗建筑,展示,或平庸的免疫反应引起的,最后,Δ厚度SP3敲除菌株不能作为疫苗。然而,SynSP3诱导的“恰到好处”的免疫反应允许控制炎症(所推断的il - 10的表达),并允许间隙的细菌和记忆的感应反应。

图1

8 9 诱导的免疫反应“刚刚好”,作为解释关于损坏反应框架(连接部。这条曲线,基于主机如何回应DRF的毒力因子和病原体,首次提出Pirofski和卡萨德沃尔,]。DRF推测人类疾病产生的微生物感染表现在两个方面:(1)有一个反应太健壮(野生型),这是有害的主机或(2)响应不足,允许无节制的入侵和屈服于感染。同时,低免疫反应部分的曲线可以对基因敲除菌株作为疫苗的有效性较低。合成压力将最低DRF的因为它们表达低水平的毒素,允许增加免疫反应而击倒,但低于阈值。

图2

链球菌引起的肺炎 厚度 厚度 2 厚度 , 10 ₁₀ 厚度 厚度 调制的免疫应答通过codon-pair偏见滴定细菌毒素的表情。Codon-pair偏见定制提供了表达和调制的滴定宿主的免疫反应。通过减少(SP)毒素表达式(pneumolysin基因,)控制,nondeleterious反应是诱发。支持的阴影三角形数据从科尔曼et al .,,表达显著降低,但没有消除]。野生型serotype-3 SP (Wt-SP3)表示8溶血性单位(胡)每毫升的上层清液从8小时增长文化,而SynSP3产生2胡/毫升和Δsp3产生0胡/毫升(数据没有显示)。Wt-SP3感染的老鼠,它分泌pneumolysin的高水平导致过度,有害的招聘CD45 + Ly6G +中性粒细胞(中性粒细胞)肺postinfection 48小时,一个已知的表现肺肺炎球菌病(]。左边设在是日志规模和对应的中性粒细胞总数与肺部感染的小鼠的菌株。有趣的是Δsp3招募了最少的中性粒细胞和SynSP3中间层数量、对应DRF的假说“恰到好处”的免疫反应。正确的设在是一个线性轴和对应的数量通过ELISA il - 10孤立从肺部感染的小鼠的应变(右轴)表示。il - 10是一种抗炎细胞因子,il - 10的表达增加SynSP3-infected小鼠的肺可能允许“控制”nondeleterious中性粒细胞浸润。SynSP3-infected老鼠招募中性粒细胞减少(左轴)和拥有最高水平的il - 10(右轴)。控制Δ基因敲除菌株分泌没有厚度,未能刺激免疫反应,最少的中性粒细胞(左)和il - 10水平(右轴)。图表已经放在一个图易于比较,而不是阅读同时设在。

我们看到SynSP3不是感染的老鼠与一名招募中性粒细胞肺虽然upregulation免疫调制器il - 10的观察(图2)。SynSP3招募CD19的最高数字⁺B细胞的肺感染的老鼠相比其他菌株和我们假设这些CD19⁺B细胞可能是il - 10的来源(45]。此外,老鼠感染SynSP3招募CD4的最高水平⁺和CD8⁺T细胞在活的有机体内和能够激活树突状细胞(dc)当cocultured在体外(2]。激活抗原呈递细胞像DCs已知相关的保护引起的接种疫苗(46]。通过使用基因改造控制毒性因子表达式,这样免疫反应不是“太热”(野生型)和/或不是“太冷”(Δ厚度SP3),而是“刚刚好”(SynSP3)可能允许建设的其他减毒活疫苗疫苗一个健壮的细胞免疫反应的能力。

在病毒系统中,人们认为流感是一个受控的保护性免疫反应,nondeleterious肺部炎症,限制过度的组织损伤。更具体地说,il - 10的生产被认为是防止这种名流感感染的炎症反应(47]。因此,减毒活疫苗流感疫苗也应该允许il - 10表达而复制后接种疫苗。最近的研究表明,il - 10在流感感染源可能是CD4⁺和CD8⁺T细胞生存和il - 10表达高关联/预防流感[47]。科尔曼等人也发现CD8的最高水平⁺SynSP3-infected小鼠的T细胞在肺部。CD8⁺T细胞也需要生存SP3的感染,可能是这个il - 10的来源(41]。此外,il - 10是一个强有力的监管机构名免疫反应,人类临床试验的共生的细菌菌株Lactococcus lactis表达il - 10战斗克罗恩氏病(48]。在这里我们只强调增加il - 10的感应和控制组织中性粒细胞浸润synthetically-modified应变表达“刚刚好”水平的免疫刺激毒素,我们假设基因菌株能够诱导增强设计,nondeleterious免疫反应代表了一个全新的途径应对许多病原体疫苗研发目前影响人类健康。疫苗模仿自然感染(即。,live attenuated) will elicit the most robust response. The user-directed design and titration of virulence factor expression will not only open a new avenue for vaccine development but also provide basic insights into the effects of codon pairing on bacterial gene expression.

3所示。结论

的CPB-modulation依靠DNA合成和基因表达用户选择设计允许更精确的控制与基因敲除和其他传统的基因改造2,5,6]。另外这些发现已经开始强调炎症反应的作用在细菌感染的设置。专门有一个可能的阴阳对毒力因子及其与免疫系统的交互,提供支持DRF [9,12]。总之,低剂量的毒性因素由synthetically-modified基因可能是有益的,因为他们刺激免疫力足以引起病原体清除但不足以引起hyperinflammation并最终宿主发病率和死亡率。这些结果可能是一个重要的发现,因为基因的应用定制的建设与减毒细菌毒力相关和重要微生物发病机理和疫苗研发领域。

利益冲突

博士伦科宣布她没有利益冲突有关的出版。科尔曼博士和Stauft隶属于Codagenix inc .,商业化是一种病毒基因的方法定制。

确认

莉莎伦科博士是支持NYIT机构支持研究和创造力(ISRC)资助。j .罗伯特·科尔曼博士是美国肺协会支持的生物医学研究格兰特(rg - 219190 n)。

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