有效浓度和检测隐孢子虫,贾第虫属,小孢子虫目从环境矩阵

文摘

隐孢子虫spp。贾第虫属spp,小孢子虫目成员是人类和动物的致肠病的寄生虫,生产无症状严重的肠道感染。规避各种障碍与目前的检测方法,我们测试方法提供多级净化和分离在一个单一的、封闭的一步。标准的实时PCR检测方法。样品中掺入c以及和g . intestinalis被分割为比较标准方法1623。结果相当于immunomagnetic程序隐孢子虫,贾第虫属。总体回收率隐孢子虫方法1623年平均26.89% (std 21.44%;min = 0%;max = 73%)和为qPCR相似但不变量方法在估计平均为27.67 (std 17.65%;min = 5%;max = 63%)。为贾第虫属方法1623年有一个整体的平均回收率为27.11% (std 17.98%;min = 1%;max = 58%),而多级净化和qPCR估计降低总体回收率在18.58% (std 13.95%;min = 0%;max = 35%)。小孢子虫目也容易发现,估计恢复46.81%的整体(std 17.66%;min = 18%;max = 70%)大肠intestinalis和38.90% (std 14.36%;min = 13%;max = 62%)大肠bieneusi。

1。介绍

隐孢子虫、鞭毛虫,小孢子虫目是人类和动物的致肠病的寄生虫,生产无症状严重的肠道感染(1,2]。这些病原体的检测仍然是对公共卫生的极大兴趣,和直接检测监测是保证给定一个贫穷的相关标准粪便污染指标(3]。目前,美国和一些欧洲国家授权的使用结合immunomagnetic和microscopy-based (IMS)过程(即。,它统治;方法1623)监测表面和饮用水隐孢子虫和贾第虫属。这些方法受到成本和时间消耗性质(4),需要特定技能区分人类和动物致病性隐孢子虫和贾第虫属物种(5]。问题也会出现错误(积极的和消极的结果6)和穷人离解的卵囊的磁珠纯化步骤(7]。这些方法具体只隐孢子虫和贾第虫属,虽然小孢子虫目和其他水传播的病原体中列出各种污染列表,不存在成本和时效方法检测。

众所周知,分子技术开发更有效的免疫荧光显微镜在探测特定病原体(8]。值得注意的是,娱乐和环境水域,如地表水和地区影响污水排放口呈现复杂的示例矩阵已知含有许多有机和无机溶解和颗粒物质会影响样品收集和净化以及有可能抑制PCR反应(6]。目前很多分子方法依赖IMS来缓解这些问题。IMS技术并非没有困难;高浑浊的样品影响病原体恢复(9)导致低和/或可变利率(7]。此外,非特异性结合的抗体在复杂样品限制检测敏感性似乎是一个因素。因此,需要负担得起的替代方法来帮助提高在水中病原体检测矩阵。

基本方法与IMS相关规避问题,结合滤波器解散和目标在离心分离设备(CFD)评估。过程伴随着下游qPCR快速,成本效益的方法来检测这些病原体。这份报告描述了过程和呈现数据的敏感性和有效性的比较评估使用IMS显微镜中执行NELAC认证实验室。

2。材料和方法

2.1。病原体

灭活隐孢子虫以及卵囊(CpAZ应变)g . intestinalis(H3隔离,组合B)囊肿(gamma-irradiated)用于飙升悬挂在所有试验(方法1623和qPCR)和标准(qPCR)。病原体是流cytometry-sorted和悬浮在0.75毫升的试剂水0.01%渐变20日已灭活和保存(Accuspike-IR;水性Inc .,洛杉矶)。Encephalitozoon intestinalis被提供的净化悬浮液在磷酸盐(PBS)的解决方案(1×10吗⁶孢子;迪迪埃隔离;P103I)和Enterocytozoon bieneusi孢子是提供unpurified悬浮液(水性公司;新奥尔良,洛杉矶)。所有的卵囊,孢子,囊肿是购买前3 - 4周试验和储存在4°C。所有寄生虫一般质量评估和微分干涉差显微镜下未受损伤。

2.2。比较试验

比较评价与IMS-microscopy(方法1623;(10不同浊度的]),大量的水(< 1 - 54南大)被分成单独的20 - 25 L卷,与已知数量的上升c以及卵囊,g . intestinalis囊肿(Accu-spike;水性Inc .新奥尔良,洛杉矶)。标准化治疗浊度,确保没有病原体水样飙升之前,水样卷有浊度> 1是由添加土壤净化壤土Milli-Q纯净水(18 MΩ;微孔,贝德福德,MA)。土壤是热压处理过的两次在121°C每隔24小时20分钟前与水混合。水用于强化与浊度标准< 1南大(饮用水)提供了在坦帕市水利局(杂志。部门)。

水不同浊度分为单独的聚碳酸酯的广口玻璃瓶(20 - 25 L)。在每个2试验,样品3的水浊度(3复制/浊度)飙升了100 (oo)囊肿c以及和g . intestinalis。代表整除飙升之前,从广口玻璃瓶进行浊度检测用浊度计(2100 n,哈希)。广口玻璃瓶与gamma-irradiated飙升c以及卵囊,g . intestinalis按照制造商的指示囊肿(AccuSpike;水公司,洛杉矶)。此外,广口玻璃瓶与预定数量的上升大肠intestinalis和大肠bieneusi评估使用qPCR通过CFD的分离和检测。估计飙升悬浮液和qPCR标准曲线是通过血细胞计数器计数。标准的悬浮液的小孢子虫目准备每个试验前1周。方法空白,没有补充说,病原体被包括在试验1。

飙升样品评估使用方法1623人透过FiltaMax过滤器(Idexx)流卷使用数字率计记录(模型220/101-8T Flo-Sensor;McMillan)。样本容量评估使用过滤溶解结合qPCR收集在142毫米混合纤维素酯(多国评价;1.2 um孔隙度;微孔膜)使用一个过滤器塔(5毫米汞柱真空)。多国评价过滤器被折叠,放在有拉链袋,并相应地标记。过滤器被运送到了UWF在冰上和加工在48小时。

2.3。环境样品

环境样品收集的彭萨科拉和坦帕湾地区。一些额外的样本来自河流和废水处理设施(WWTF)在圣彼得堡和下,佛罗里达。彭萨科拉地区的样本被收集到聚碳酸酯广口玻璃瓶和运输回实验室进行过滤和处理。未使用的部分样本由常规测试在坦帕市的水处理设施通过qPCR 1623年方法被用于评估。未使用的卷被过滤到1.2μ是一夜之间运往UWF m多国评价过滤器。卷不平等但提供额外的测试材料。

2.4。方法1623

样本处理所述的IMS显微镜方法(方法1623;(10])水质实验室在坦帕市水利局。Dynal IMS过程(Dynabeads G / C组合IMS设备;Dynal A.S.,Oslo, Norway) was performed according to the manufacturer’s instruction. Adhesion slide preparations were immunostained with fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled antibody (Meridian Biosciences) following manufacturer’s instructions and stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.001 mg/mL (Sigma-Aldrich) according to Method 1623. Enumeration of oocysts and cysts was accomplished using an Olympus BX60 microscope with magnifications of 200x–1000x for the examination of immunofluorescence (FA), DAPI staining characteristics, and differential interference contrast (DIC) microscopy according to Method 1623.

2.5。Centrifugation-Filtration净化

研究利用多层centrifugation-filtration (CFD;GenIUL通勤,西班牙)设备(图1)由联锁(不漏气)部分大颗粒的分离和收集的目标生物。过滤解散之前,47毫米耐溶剂过滤器(2“保留”μm;图像比对Track-Etched绘画纸)被放置在较低的部分的筛网(第三节,图1(一)收集目标病原体;47毫米预选(20μm;Nytex)被放置在网格支持去除大颗粒。

解散,多国评价过滤器是用无菌钳和折叠的插入到主燃烧室(部分1;图1CFD (a))。其次是增加~ 30毫升丙酮(95 - 100%)和~ 25氧化锆/硅珠(2.3毫米;BioSpec Inc .)。盖子是固定在主设备,然后把保留容器。单位是彻底激动(手摇晃;~ 1分钟)和离心机~ 2000 - 3600 rcf 3 - 5分钟(Sorvall RC-5B / C GSA转子;杜邦公司)。然后主要单位是远离其保留容器和材料丢弃。两个额外的清洗步骤使用丙酮(100%)和离心(2000 - 3600年rcf 2 - 3分钟)。完成后清洗的步骤,主要单位是检查以确保没有残余溶解液仍保留过滤器。 When necessary, residual fluid was removed via additional centrifugation and/or by application of vacuum to the bottom of the unit by a filtration manifold.

2.6。gDNA提取

保留过滤器被从CFD单位用无菌钳和插入单独2毫升,bead-beading管(Powersoil;该款)。裂解缓冲添加和过滤受到3冻融周期(液氮/ 65°C)。管是使用FastPrep激动(ThermoSavant)或PowerLyzer均质器该款使用45第二破裂设置4.5和S3500,分别。基因组DNA提取是根据制造商的指示和储存在−20°C。

2.7。放大和检测

Primer-probe集用于检测g . intestinalis囊肿,c以及卵囊的目标β-Giardin基因和基因隐孢子虫卵囊外壁蛋白(COWP;(11])。pcr进行15μ包含3.0毫米MgCl L卷₂,PCR缓冲(FastTaq 10 x /绿色),0.50μ每个引物,0.04 U(由于“快速上手”项目TaqDNA聚合酶(罗氏),0.2毫米PCR核苷酸MixPlus(罗氏),0.025%牛血清白蛋白(σ,圣路易斯,密苏里州)和0.3μ每个杂交探针的M。循环条件符合的家伙et al . 2003。荧光测量在每个周期。检测大肠bieneusi孢子、引物和探针杂交针对18 s rRNA基因利用的区域(12]。引物和探针用于检测Encephalitozoonspp。(pan -Encephalitozoon从Wolk et al . 2002年)孢子13]。反应检测大肠bieneusi和Encephalitozoon在15种虫害进行μ包含3.0毫米MgCl L总卷₂(罗氏)PCR缓冲(FastTaq 10 x /绿色),0.40μ每个引物,0.04 U(由于“快速上手”项目TaqDNA聚合酶(罗氏)/ l, 0.2毫米PCR核苷酸MixPlus(罗氏),0.025%牛血清白蛋白(σ,圣路易斯,密苏里州)和0.3μ每个杂交探针的M。热两种反应条件包括5分钟在95°C紧随其后50周期15 s在95°C, 30 s 60°C, 30年代在72°C。每个周期的荧光测量在退火步骤。

至少8 - 10复制反应是用于所有样品和结果集中。以确保试剂的纯度,“没有模板控制”(ntc)运行每一次PCR反应级数。标准粒子包含100年和500年1000年和5000年囊肿和卵囊孢子被用来开发标准曲线。标准受到gDNA提取方法如前所述。病原体的预计数量的计算基于部分gDNA分析使用以下公式:病原体的数量(即。在每个样本、卵囊孢子)=(病原体的数量计算)×(gDNA提取总额)/ (gDNA总额分析)。所有运行和数据分析进行使用Rotor-Gene 3000 (Corbett)实时PCR机器和软件。病原体的存在和物种识别未知的验证使用在2%琼脂糖凝胶电泳和后续的测序(大染料;V1.1;ABI 3100音序器)根据制造商的指示。数据一致反对现有的序列已知病原体(爆炸; NCBI).

3所示。结果

使用灭活(gamma-irradiated)c以及卵囊,g . intestinalis囊肿,并行处理的样品1623和qPCR直接比较方法。数据比较,列出(表的方法1;图2)。总体回收率隐孢子虫方法1623年平均26.89% (std 21.44%;min = 0%;max = 73%),为CFD + qPCR相似但不变量方法平均27.67 (std 17.65%;min = 5%;max = 63%)。为贾第虫属方法1623年有一个整体的平均回收率为27.11% (std 17.98%;min = 1%;max = 58%),而CFD + qPCR降低总体回收率在18.58% (std 13.95%;min = 0%;max = 35%)。

Microsporidian孢子,e . intestinalis和E。bieneusi以及孢子被添加到样品c以及和g . intestinalis。估计的数量大肠intestinalis和大肠bieneusi孢子检测使用CFD + qPCR和相关百分比复苏(表列出了每个样本1)。百分比复苏的小孢子虫目qPCR总体为46.81% (std 17.66%;min = 18%;max = 70%)大肠intestinalis和38.90% (std 14.36%;min = 13%;max = 62%)大肠bieneusi(表1)。使用两个142毫米多国评价过滤器是必要的样品有54个南大的浊度。额外的搅拌时间(约2分钟)是必要的,以便完成解散过滤器以及辅助冲洗步骤(2 - 3次)删除额外的纤维素。

下降1623检测方法的能力隐孢子虫和贾第虫属观察囊肿与浊度增加,而qPCR方法被检测浊度的影响较小隐孢子虫和贾第虫属(图3),大肠intestinalis和大肠bieneusi(图4)。

数据从qPCR使用样品卷剩下1623年就业的方法提出了表2。使用qPCR使检测贾第虫属intestinalis和Microsporidian病原体在环境样品评估的80%。隐孢子虫数字低于检测阈值。大多数病原体检测主要是小孢子虫目,大肠hellem在大多数环境和废水样品。

4所示。讨论

发现粪便污染的起源是至关重要的在评估相关的健康风险。然而,微生物源跟踪(MST)通常是昂贵的,耗时的,恐吓那些需要它(14]。大多数方法都不是现实可行的实际情况和困难来衡量效率由于没有监管方法进行比较(15]。这是特别设计的pcr方法检测,验证,和相对量化环境样品中的病原体。MST方法需要选择使用考虑成本、再现性、歧视性的权力,易于解释和缓解的性能(16,17]。显微镜的局限性,包括慢分析时间和不能区分病原体种类和品种,已被分子矫正方法,也表明灵敏度高于法1623和英国的监管方法18,19]。

在发生大的疫情,众多领域的分析样品提供空间和时间评估是必要的(20.]。可以说,成本高(> 400美元/样本;EPA-certified实验室)与基于IMS-microscopy检测禁止使用和限制等实施常规监测。费用在本研究中大约40美元/过滤器的示例,包括成本,gDNA提取和qPCR试剂和杂交探针。CFD方法在成本的一小部分(12%)和时间(6倍),基于评价膜过滤和IMS方法([21];这项研究)。检测的方法被证明是有效的病原体在中等浓度(≥5 (oo)囊肿/ L)或更高。隔离的病原体存在于环境在低浓度可能仍然被证明是变化无常的,虽然qPCR很高的特异性较低的时间消耗与视觉的方法。另外,所使用的方法可以帮助各种病原体的检测作为商业IMS工具不允许集体隔离多种病原体从单一样本和尚未开发的其他已知病原体(例如,环孢子虫cayetanensis)。无论如何,分子的结合和microscopy-based分析应该最终提高水性病原体检测的有效性。

净化方法在本研究中是一个适应的醋酸纤维素过滤解散,在先前报道的复苏从复苏的70 - 79%隐孢子虫种虫害卵囊(22,23]。回收率为50.2%隐孢子虫卵囊,为63.1%贾第虫属囊肿也被报道(24]。方法已用于显微镜(25)以及PCR (26)和荧光原位杂交(鱼)27]。然而,损失归因于多个离心机和愿望的步骤,以及一个硬球的出现使病原体的检测过程更加困难。这些步骤已经在这项研究中,规避减少过程的步骤和绕过需要吸气和成粒样品材料和相关溶剂蒸汽接触。

担忧提供可行性和原生动物的传染性病原体的信息了(24,28]。然而,c以及后小鼠的卵囊被报道是可行的使用方法(29日]。这些问题可以通过使用propidium monoazide丙酮溶解和PCR(之前30.]。在任何情况下,持续高浓度的病原体的检测样品中尽管能力确认致病性或可行性应该关注的。

多路复用primer-probe集(11)启用评估CFD方法和允许同时放大的目标在一个反应管。检测~ 5 (oo)囊肿/ L的水样浊度为3.8 -54南大是可行的;提供检测敏感性,属于可接受范围对ID-50s的报道G。intestinalis(25 - 100囊肿;(31日,32])和C。以及(10 - 132卵囊,33- - - - - -35])和估计的平均消费娱乐的水洗澡(~ 79.7毫升,36];~ 50毫升,37])。

方法成功检测病原体的上升以及环境样品样品。c以及样品中检测出使用qPCR未经处理的污水,污水和污水处理厂废水和其他样品被qPCR小孢子虫目阳性。大肠bieneusi收集的样本中,检测出各种淡水来源。这种病原体是流行在世界各地和存在于各种主机包括猪、人类和其他哺乳动物(38,39]。他们的存在,与水源性疾病疫情和休闲和河水,不断记录(36]。

样品的数量和分析影响复制检测病原体在水中的显微镜和PCR (20.]。至少10复制qPCR反应池来提高分析灵敏度的丢失的目标序列的概率占整除取自gDNA提取解决方案(40]。增加PCR反应的数量增加灵敏度。针对检测各种额外primer-probe组合隐孢子虫(41),贾第虫属(42]目前,某些primer-probe组合可能是更好的工作。更重要的是,最新进展像digital-droplet PCR应该最终提高整体检测灵敏度。减少从20μ米到12 - 15μm预选可能改善的总体性能的方法。Nytex使用,因为在那个时候,没有可用的不锈钢网预选。此外,gamma-irradiated cytometry-sorted流动c以及和g . intestinalis悬浮液(AccuSpike-IR水性Inc)被用于提供精度对矩阵飙升也提供一定程度的安全的在开发和评价分析。PCR的辐照性能的影响是一个未知的因素。

5。结论

这份报告表明相结合的能力过滤溶解与qPCR人类肠道病原体的直接检测结果与IMS显微镜,在大幅减少时间和费用。试验时间大约3 - 3.5小时(1技术员/ thermocycler, 1 - 6样品)的初始过滤qPCR样本来完成。该方法简单,最小化样本操作。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究的部分资金由新佛罗里达州立大学研究援助赠款。作者感谢Fitzpatrick和杰克Ziglioli的帮助和专业知识。

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