但是脉冲场凝胶电泳的出现群体之间的相关性mrp / epf /狡猾基因型的人类猪链球菌血清型2在泰国北部

文摘

猪链球菌感染是一种严重的人畜共患疾病常见在泰国北部,人们经常食用生猪肉或猪的血液。最常见的临床表现是脑膜炎、败血症、心内膜炎和更高的死亡率和听力损失后遗症。澄清之间的相关性pulsed-field凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现)组和mrp / epf /狡猾基因型的猪链球菌血清型2,62病人和健康猪隔离从泰国北部进行了研究。但是脉冲场凝胶电泳的出现分析,同源性66%,大多数人类隔离(69.4%)和1头猪隔离在A组,而14.5%的人类隔离和3的4猪隔离在d组,根据mrp / epf /狡猾基因型,80.6%的人类隔离标识mrp⁺epf⁻狡猾的⁻只有12.9%的人mrp⁻epf⁻狡猾的⁺基因型;相比之下,1和3头猪隔离被发现在这两个基因型,分别。有趣的是,所有的隔离猪链球菌但是脉冲场凝胶电泳的出现组血清型2分类A、B和Emrp⁺epf⁻狡猾的⁻基因型。这些数据显示,但是脉冲场凝胶电泳的出现组和之间的密切关联mrp / epf /狡猾基因型的人类猪链球菌血清型2。

1。介绍

猪链球菌猪和人类公认的重要病原体,主要引起脑膜炎、败血症、心内膜炎、感染性休克(1]。它可以通过接触传染给人类生病或承运人猪,pig-derived产品(2),或者吃未煮熟的猪肉3,4]。荚膜多糖(CPS)是最重要的证明重要的毒力因子,由于其antiphagocytosis活动(5]。35个血清型,血清型2是最经常孤立和相关疾病在动物和人类身上6]。此外,virulence-related蛋白质,如muramidase-released蛋白(MRP),细胞外因子(EF)和溶血素(suilysin,狡猾的),所表达的是一些菌株美国隋“讨论Gottschalk以及和塞古拉(1]。“这些蛋白质编码的基因mrp,epf,狡猾的,分别。MRP / EF /狡猾的表型或mrp / epf /狡猾基因型的猪链球菌血清型2研究主要在猪隔离与人类隔离(非常小的数据1,7),尤其是在泰国北部。Pulsed-field凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现)的DNA限制SmaI被确诊为有价值的遗传多样性的评价猪链球菌(8]。本研究旨在阐明但是脉冲场凝胶电泳的出现和之间的关系mrp / epf /狡猾基因型的猪链球菌血清型2隔离病人在泰国北部。

2。材料和方法

2.1。猪链球菌从人类健康猪血清型2株

总共有66猪链球菌血清型2 (SS2)隔离被纳入本研究。六十二人类SS2隔绝43和19例大师Nakorn清迈医院和Lamphun省级医院,分别。隔离猪链球菌从猪,150下颚淋巴结的健康猪买了从两个城市地区零售市场的清迈省2002年11月和12月之间进行了研究。从每个样品均质,猪链球菌被隔离在禁毒委员会琼脂(叠氮化钠、萘啶酸、colistin-crystal紫琼脂)“被Kataoka et al。9”和选择性血琼脂(羊血琼脂+ SR126E, oxoid)。所有α溶血性革兰氏阳性球菌筛选首先与一个API标准的生化检测和确认20喉炎的症状(bioMerieux)。猪链球菌血清型2被coagglutination测试antiserotype 1(负面反应)和2(阳性反应)抗体”作为讨论Gottschalk以及et al。6]。“P1/7应变,参考菌株血清型2,这是孤立的从患病的猪mrp⁺epf⁺狡猾的⁺基因型,被用作积极控制。消极的控制,我们使用beta-hemolytic链球菌和蒸馏水。

2.2。遗传多样性的特征猪链球菌隔离,但是脉冲场凝胶电泳的出现

这个方法是修改从儿子et al。10]。为每一个猪链球菌血清型2株,两个独立的提取的DNA进行验证模式的再现性。短暂,细胞悬液制备一夜之间从Todd-Hewitt肉汤(Difco)文化和与1%琼脂糖混合形成了琼脂糖插头。细胞和溶菌酶细胞溶解,然后用蛋白酶处理。SmaI及其片段的DNA消化解决但是脉冲场凝胶电泳的出现在1%琼脂糖凝胶电泳年级使用CHEF-DR II系统(Bio-Rad)。凝胶和溴化乙锭染色和紫外光下拍摄。Bionumeric提供的集群分析软件(应用数学)和转换成一个凝结的集群使用未加权的算术平均值(UPGA)两组方法(基于骰子系数)。

2.3。检测mrp,epf,狡猾的假定的毒性基因的PCR

染色体DNA分解动作进行“描述Pruksakorn et al。11]。“特定的寡核苷酸引物mrp基因被设计成光(5′-GAGAGGAACTGATACGA-3′)和快速眼动(5′-CCAAGAGCTGACTTAGGA-3′)。放大的片段是515个碱基对。是否用于特定的寡核苷酸引物epf, epf,*和狡猾的基因扩增片段626个基点,1278 - 2993个基点,12,1282个基点,13分别)。

分别对每个基因扩增反应表现在珀金埃尔默鲸鱼座DNA热循环与反应混合物包括四个deoxynucleotide三磷酸腺苷,每个引物,TaqDNA聚合酶。PCR产品运行在2%琼脂糖凝胶(mrp,epf,epf*)或0.8%的琼脂糖凝胶(狡猾的),与溴化乙锭染色,用紫外线透照。λDNA消化EcoRI和HindIII和100年英国石油公司DNA梯标记(从Promega有限公司所有)被用来估计片段大小。

3所示。结果

3.1。隔离猪链球菌从下颚淋巴结健康的猪

150年的下颚淋巴结样本,68猪链球菌隔离(45.3%)恢复。然而,只有6个分离株(4%),发现从4样品(2.6%;3隔离恢复从相同的样本),被证实属于血清型2。因此,四个隔离恢复从4动物被纳入本研究。

3.2。遗传多样性的特征猪链球菌隔离,但是脉冲场凝胶电泳的出现

可再生的结果观察,因为一个相同的模式显示猪链球菌隔离在两个独立的提取DNA(结果未显示)。但是脉冲场凝胶电泳的出现模式与SmaI消化后的特点是6到10大乐队的大小从48.5到436 kb。66年的分离,聚类分析Bionumerics软件显示5但是脉冲场凝胶电泳的出现组(E), 66%相似(图1和表1)。大多数病人隔离(43 62或69.4%)组中表达但是脉冲场凝胶电泳的出现,其次是但是脉冲场凝胶电泳的出现D组(9 62或14.5%)。4头猪隔离了两个不同的但是脉冲场凝胶电泳的出现组(1和3 D)和参考应变P1/7属于pulsotype l C组。

3.3。检测mrp,epf,狡猾的假定的毒性基因的PCR

当三个基因组成mrp / epf/狡猾的基因型,分析了3种不同的类型(表1)。大部分的猪链球菌从人类血清型2隔离(50 62或80.6%),只有1猪隔离了mrp⁺epf⁻狡猾的⁻基因型而3的4头猪隔离了mrp⁻epf⁻狡猾的⁺基因型,还发现人类隔离在8。四个人类的分离mrp⁺epf⁺狡猾的⁺基因型与P1/7参考毒株的基因型。

3.4。但是脉冲场凝胶电泳的出现群体之间的相关性mrp / epf /狡猾基因型

但是脉冲场凝胶电泳的出现群体之间的关系mrp / epf /狡猾基因型显示,但是脉冲场凝胶电泳的出现组中的所有隔离SS2的A, B, E是机密的mrp⁺epf⁻狡猾的⁻基因型。大部分的但是脉冲场凝胶电泳的出现属于D组菌株mrp⁻epf⁻狡猾的⁺基因型,除了1。但是脉冲场凝胶电泳的出现C组属于的所有隔离mrp⁺epf⁺狡猾的⁺或mrp⁺epf*狡猾的⁺基因型(表1)。

4所示。讨论

但是脉冲场凝胶电泳的出现最初是一种高分辨率的基因型的技术证明Allgaier et al。14)是最适合区分单独的隔离,从而使它在流行病学研究和最可靠的猪链球菌。Berthelot-Herault et al。8)证实,但是脉冲场凝胶电泳的出现此类调查分析是一种非常有用的工具。他们报道SmaI限制但是脉冲场凝胶电泳的出现模式(A、B和C) 123猪链球菌隔离从法国猪和人类世界范围内。在目前的研究中,而大多数的猪链球菌血清型2隔离从人类被确认为但是脉冲场凝胶电泳的出现组和D(69.4%和14.5%,分别地。),隔离从健康猪是包含在群和D(1和3隔离,职责)。有趣的是,猪链球菌隔离从人类和健康猪聚集在同一但是脉冲场凝胶电泳的出现子组(“b”和“f”),除了1猪隔离(NL 110.1)。这些证据可能提高健康的载波猪能传输的可能性猪链球菌给人类。

MRP / EF /狡猾的表型和/或mrp / epf /狡猾基因型的猪链球菌血清型2已被用来作为工具来确定遗传多样性在人类和猪隔离以及在流行病学研究。此外,MRP有着明确的联系⁺,英孚⁺,狡猾的⁺或mrp⁺,epf⁺,狡猾的⁺表型和基因型与毒性很大程度上是建立在许多国家。大多数猪链球菌入侵种血清型2株隔绝在欧洲被包含在患病的猪mrp⁺/ mrp^年代epf⁺/ epf*/狡猾⁺基因型(15]。大多数血清型2株分离猪或人类患者这样一个在中国和越南也在场mrp⁺,epf⁺,狡猾的⁺表型(16,17]。然而,Gottschalk以及et al。6)第一次描述了MRP的高频⁻英孚⁻狡猾的⁻大多数猪菌株表型(72%)和两个人类的分离。此外,16株从患病猪MRP (18.8%)⁺/ MRP *英孚⁻狡猾的⁻。这些表型似乎普遍在北美,因为类似的结果被证实与菌株从病中恢复过来的猪在美国(18]。

然而,在泰国情况似乎不同。我们的结果是类似高松等提出的。7)研究mrp / epf/狡猾的基因型19 SS2人类隔离来自泰国,表明他们中的大多数(68.4%)被分配到狡猾的⁻epf⁻mrp^{* * +}基因型。健康猪隔离从这个研究显示人类隔离(相同的基因型mrp⁺epf⁻狡猾的⁻或mrp⁻epf⁻狡猾的⁺基因型)。此外,3隔离从相同的猪的淋巴结都显示相同的但是脉冲场凝胶电泳的出现pulsotype b和mrp⁻epf⁻狡猾的⁺基因型。这通常表明这种动物可能仍然从疾病中恢复。有趣的是,参考隔离P1/7显示高遗传相似性与人类隔离,CSF060544 (pulsotype l和C组但是脉冲场凝胶电泳的出现mrp⁺,epf⁺,狡猾的⁺表型)。这可能说明患病猪分离的可能的传播。

我们的团队,Wongsawan et al。19)的遗传多样性进行了分析猪链球菌从人类但是脉冲场凝胶电泳的出现和孤立mrp / epf /狡猾基因型;然而,他们没有互相比较。在目前的研究中,我们想要解决的不同群体之间的相关性和基因型猪链球菌为未来的流行病学研究血清型2。有趣的是,我们发现所有的隔离猪链球菌但是脉冲场凝胶电泳的出现组血清型2分类A、B和E是包含在mrp⁺epf⁻狡猾的⁻基因型。此外,所有隔离但是脉冲场凝胶电泳的出现组C和D除了一个表达的基因型mrp⁺epf⁺/ epf*狡猾的⁺和mrp⁻epf⁻狡猾的⁺,分别。Kerdsin et al。20.]报道之间的重要联系相约应变和脑膜炎类别();他们没有讨论但是脉冲场凝胶电泳的出现组和临床特征之间的关系。在我们的疾病结果(表2),我们发现,大多数的菌血症(30 - 80.0%)24日和脑膜炎(13 19或68.4%)例但是脉冲场凝胶电泳的出现集团实力雄厚,所有3例中毒性休克综合症也包含在但是脉冲场凝胶电泳的出现为心内膜炎组A,每3分布式但是脉冲场凝胶电泳的出现组10例(30%),D和E。

总之,mrp / epf /狡猾基因型的猪链球菌血清型2从人类分离与但是脉冲场凝胶电泳的出现密切相关的分析。从猪隔离分析研究类似隔离病人。有必要进一步研究更多的猪隔离在泰国从病中恢复过来的动物。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持由兽医和动物科学学院北里大学,日本,和医学院,清迈大学,泰国清迈。

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