艰难梭状芽胞杆菌莫西沙星/克林霉素耐药性蔬菜在俄亥俄州,美国,流行荟萃分析

文摘

我(们)的流行程度决定的艰难梭状芽胞杆菌和抗菌素耐药性六抗菌类、各种新鲜蔬菜在零售销售在俄亥俄州,美国,和(2)进行累积荟萃分析报告的患病率在蔬菜自1990年代。六类抗菌检测他们作为风险因素的相关性梭状芽孢杆菌感染(cdi)(克林霉素、莫西沙星)或临床优先作为详尽的治疗选项(灭滴灵、万古霉素、linezolid和tigecycline)。通过使用一个浓缩协议我们孤立梭状芽孢杆菌125年从三个蔬菜产品(2.4%)。所有隔离产毒素的,起源于65年4.6%的蔬菜种植地面(;外层的叶子卷心莴苣、青椒和茄子)。根菜类蔬菜了没有梭状芽孢杆菌。的梭状芽孢杆菌隔离属于两个PCR ribotypes,一个一个不寻常的抗菌素耐药性的莫西沙星和克林霉素(莴苣和胡椒;027——比如,一个⁺B⁺CDT⁺;国家间的技术合作18 bp删除);其他PCR ribotype(茄子⁺B⁺CDT⁻;经典国家间的技术合作)容易受到所有抗菌素。累计加权荟萃分析的结果(6)研究表明的患病率梭状芽孢杆菌蔬菜是2.1%和均匀自1996年第一份报告(2.4%)。目前的研究是第一次报告的隔离梭状芽孢杆菌在美国从零售蔬菜。公共卫生学院的相关性、抗菌素耐药性莫西沙星/克林霉素(bacterial-associated风险因素严重cdi)表面被生吃的蔬菜。

1。介绍

2013年9月16日,美国疾病控制和预防中心宣布在其抗菌素耐药性的威胁报告中孢子形成的艰难梭状芽胞杆菌威胁与“紧急”关注公共卫生在美国(1)由于抗菌素耐药性(i)识别在人类和食品/动物梭状芽孢杆菌隔离药物常用于人类(特别是氟喹诺酮类原料药,如莫西沙星),(2)增加相关的病人死亡率自2000年代初以来[1]。艰难梭状芽胞杆菌是唯一的孢子形成的生物视为一种抗菌素的威胁,不是因为梭状芽孢杆菌感染(cdi)和anti-CDI-treatments越来越难治疗,而是因为梭状芽孢杆菌抗菌素耐药性增加通常用于治疗其他疾病的人(例如,莫西沙星/克林霉素),它允许吗梭状芽孢杆菌机会主义式的生长在肠道引起弹性和严重的cdi。

尽管频繁爆发的严重感染的识别和新hypervirulent梭状芽孢杆菌压力自2000年代中期(2),感染性孢子的主要来源仍知之甚少。因为相同的动物和零售肉hypervirulent菌株2006年(3,4),食品污染的担忧和食源性传播已经出现。抗菌素耐药性食品中氟喹诺酮类原料药/动物隔离也同时出现(5,6]。

高亮显示,大多数cdi的感染源仍未知,艾尔等人进行基因组测序的孤立的人类起源从医院2013年在英国,发现病人传播仅占一小部分新院内cdi(< 25%),而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌这是高度传染性(7]。最近,一个互补分析药敏和茎肉和人为的序列类型梭状芽孢杆菌隔离在比利时显示肉/人类菌株聚集在同一血统,特别是高度普遍PCR ribotypes 078年和014年(5,8]。在一起这些发现强调了需要改善我们对生态的理解和潜在的病原体传播途径。

艰难梭状芽胞杆菌生存环境中的孢子惰性表面,动物粪便,或污染农业土壤数月甚至数年(9]。梭状芽孢杆菌从零售蔬菜也被孤立自1990年代(10- - - - - -12),他们的消费已被建议作为一个潜在的食源性传播途径(10,12),但没有信息可以在其患病率在美国的蔬菜。同样,蔬菜中隔离的抗菌素耐药性的模式是不清楚。本研究的目标是(1)调查的患病率梭状芽孢杆菌零售蔬菜样品中可用在俄亥俄州,(2)进行最低抑制浓度(MIC)分析孤立的抗菌素耐药性菌株相比,当地referent隔离,和(3)确定池患病率的变化的报道梭状芽孢杆菌1990年代流行以来,蔬菜使用累积的荟萃分析。

2。材料和方法

基于研究样本量估计达到0.8针对7 - 8%的患病率在蔬菜在苏格兰(占据,v13.1) [12),我们收集了125蔬菜产品样本4种不同的零售商在俄亥俄州,美国。单一单位被系统地选择购买包括大多数种类的蔬菜可以在每个零售商抽样的时候(2连锁店,1拍卖市场,1在农业市场,<相隔200公里)。假设下的产毒素的孢子梭状芽孢杆菌可能出现在农业土壤,因为之前报道在英国10)和津巴布韦(13),我们有目的的选择产品单位对其表面产生明显的土壤残留物。起源于美国的产品(CA, PA,噢,小姐,WI,纽约,和FL)和墨西哥;然而,对于20%的测试产生的起源是未知的。

样本运送完整的无菌旋转包袋内冷却器的碎冰,直到处理实验室。部分15克生产的可食用部分,包括表面削减(< 3毫米厚)和/或最外层的叶子,是无菌培养梭状芽孢杆菌enrichment-based文化在24小时内收集的方法。浓缩(50毫升的选择性肉汤和环丝氨酸和头孢西丁)和随后的隔离措施进行描述(6,14]。总之,样本和50毫升的浓缩汤料,准备一个商业成分梭状芽孢杆菌琼脂(Oxoid),而不添加琼脂和补充0.1%的牛磺胆酸盐钠和0.05%半胱氨酸。后7天内的厌氧孵化37°C和离心,沉积物与99%乙醇酒精震惊在1:1 v / v 50分钟23°C。肉汤沉积物被飞跑到梭状芽孢杆菌琼脂和环丝氨酸和头孢西丁补充。因为氟喹诺酮类原料药是最常用的抗生素之一,与人类CDI的风险更大,我们没有使用moxalactam和诺氟沙星(氟喹诺酮类)补充之前已经在其他文化研究,因为它的使用似乎介绍选择偏向fluoroquinolone-resistant隔离早注意到(5,6,14]。

厌氧孵化后5天,365 nm UV-fluorescence被用来屏幕选择性琼脂板怀疑殖民地。生化确认是基于L-proline氨基肽酶活动(美国专业光盘,Remel Lenexa, KS)和基因标记的毒素生产(tcdA,tcdB,cdtA,cdtB,国家间的技术合作),tpi,基督教民主联盟,tcdE,16 s基于Lemee和佩尔森协议(15,16]。应变PCR ribotyping执行使用浴盆方法(17]。抗原确认产毒性验证隔离使用两种ELISA试剂盒,一个用于毒素A / B,另一个用于毒素(TechLab / Wampole),并使用产品和维洛细胞培养试剂完全如前所述[18),确保refrigeration-induced假阳性反应的预防最近报道(19]。

所有防腐措施,以防止交叉污染样品在实验室的必要梭状芽孢杆菌研究食品安全(20.]。此外,在样品处理过程中使用的防火工作台面是按照以下顺序:(i)擦洗每5 - 10与热压处理过的样品无味商业布(Swiffer, 10×15 cm) premoistened 5毫升的磷酸缓冲盐,(ii)与10%漂白剂消毒,然后用70%的乙醇,(3)最后与实验室的火炬速度我们已经证明,消除孢子梭状芽孢杆菌PCR ribotypes 078年和027年(普通菌株中确定食物和动物)。swiffer都储存在4°C 24 h,然后丰富/培养梭状芽孢杆菌如上所述的食物样品。作为一个积极的控制我们使用梭状芽孢杆菌写明ATCC 9689株。为了防止识别偏差,所有样品都记录在盲评和并发测试。

使用商业执行抗菌药物敏感性测试以及带(AB Biodisk、桑纳、瑞典)。中等收入国家反对六抗菌类描述的人类临床相关性被确定为(18)(我)甲硝唑和万古霉素是首选的治疗方法梭状芽孢杆菌人类感染(cdi) (21),(2)莫西沙星和克林霉素,广泛与CDI感应(21,22),(3)linezolid和tigecycline最近治疗抗菌类对CDI [23,24]。总之,24-hour-old梭状芽孢杆菌殖民地种植在血琼脂resuspended布鲁氏菌汤(Oxoid、哥伦比亚、MD)用于草坪预还原布鲁氏菌琼脂板来确定易感性以及带的厌氧培养48小时后37°C,指导方针和断点后的临床和实验室标准协会或中等收入国家从先前的研究报道5,24- - - - - -26]。我们选择使用莫西沙星在这项研究中氟喹诺酮类的代表,因为它是这个类的一个代理(连同氟哌酸),细菌耐药性和行之有效的断点的最低标准(14,27]。

说明我们的患病率调查结果进行了分析,报告的患病率梭状芽孢杆菌在蔬菜在过去的20年中,随机效应模型和汇集和累积统计使用DerSimonian Laird方法(占据,v.13) [28]。电子搜索的文献进行了2014年5月在PubMed和斯高帕斯书目数据库建立后指南(29日]。搜索重复了前11月出版。一个搜索算法组成的病原体相关术语(艰难梭状芽胞杆菌)和32个蔬菜使用条款。详细的搜索算法,以及包容、排斥、和数据提取标准可以作为补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/158601。相关研究被鉴定为任何同行评议的出版物报告发病率数据梭状芽孢杆菌在蔬菜。参考搜索验证包括手动搜索列表的最新发表的研究中30.]。筛选的相关性是由两个审稿人。特别的灰色文献是在谷歌的搜索引擎进行搜索。提取的数据包括流行、样本大小、植物类型、地理区域、梭状芽孢杆菌基因型、抗菌素耐药性和文化的方法。允许适当的识别准确的数据并汇集估计,只有发表的同行评审的研究包括(31日]。

我们使用了荟萃分析合成实验室研究成果发表跨区域确定概率的总体患病率和置信区间的估计梭状芽孢杆菌在蔬菜。累积荟萃分析是一种方法,衡量总体估计的变化随着时间的推移,新公布的数据变得可用(28]。患病率和95%可信区间(CI)估计是计算每个研究使用威尔逊方法因为它产生CIs高于零当研究患病率接近于零(32]。因为零值防止汇集估计,对于零患病率的研究,默认值的平滑值为0.1(1/5推荐(28)被添加到事件的数量和总数量的样本对患病率和独联体影响最小,同时允许集中荟萃分析估计(威尔逊和连续性校正方法)28,33,34]。数据正常的假设被log-transforming完成比例估计。研究非均质性进行了测试统计每个within-study偏差的测量分析的基础上从中央集体之间的方差的估计方差分布(28]。尽管发表偏倚是一种常见的荟萃分析(限制35),估计没有追求由于缺少正式出版前的注册中心基于患病率的研究在食品研究开始,不知道有多少研究得到发表。

3所示。结果

浓缩后的协议我们孤立梭状芽孢杆菌125年从三个产品(2.4%;表1)。所有三个隔离来自地上蔬菜(生菜、青椒和茄子,4.6%)。他们都是ELISA阳性毒素A / B和毒素测试和产毒素的维洛细胞。的隔离梭状芽孢杆菌通过浓缩表明孢子负载在受污染蔬菜至少1孢子/ 15克的产品。质量控制孵化17台面拭子是负数表示在样品处理过程中没有交叉污染。

PCR ribotyping显示隔离属于两个截然不同的PCR ribotypes。一个隔离没有匹配的集合梭状芽孢杆菌动物源的隔离,但两个分离株属于同一PCR ribotype(区别参考应变PCR ribotype 0275),图1抗菌素耐药性的),有一个不寻常的组合对莫西沙星和克林霉素相比,我们的历史代表食物/动物身上提取的隔离(图的集合2)。这些耐药菌株被分离从外一卷心莴苣叶子表面样本的青椒(毒素简介:⁺B⁺CDT⁺;国家间的技术合作18 bp删除)。尽管他们PCR ribotyping相似,两个隔离的tigecycline易感性水平略有不同。eggplant-derived隔离(A⁺B⁺CDT^{- - - - - -};经典国家间的技术合作)容易受到所有抗菌素。

总共有34个引用检索通过电子搜索的荟萃分析。重复数据删除后,25项研究筛查相关性,两个额外的引用识别通过搜索验证过程。五同行评议的研究发现,关联筛选后普遍存在的报道梭状芽孢杆菌在蔬菜10- - - - - -12,30.,39]。未发表的一项研究提出了2012年海报零的报道梭状芽孢杆菌只有3即食沙拉和5中发芽样品测试在欧洲(40]。最近,另一个未发表的研究报告梭状芽孢杆菌在医院食品(加工mixed-meal匀浆)提供给病人在我们医院没有胃肠道疾病(0.2%集中分类报告为“蔬菜、谷物和其他类别)”(41]。另两项研究在美国医院的饭菜了42但仍未公开。因为这些研究没有履行同行评议的出版物的标准或提供学习细节,他们被排除在分析之外。

所有识别研究发表在1990年之后。每个研究的起源和日期在图所示3。整体的估计梭状芽孢杆菌患病率与荟萃分析蔬菜估计为2.1% (95% CI = 1.6, 2.8;图3(一个))。累积的荟萃分析显示梭状芽孢杆菌在蔬菜随时间不断低患病率(2.1%;图3 (b))。虽然没有明显的异质性在研究患病率值5/6研究(除了尼日利亚研究[39];卡方;7.7%的异质性;和学术研究τ平方= 0.0034),metaregression没有进行量化关联变量之间由于有限数量的研究和抽样和文化差异。

4所示。讨论

因为微生物食品污染可能发生集群生产或加工现场,目前筛选研究的主要目标是确定梭状芽孢杆菌可以从样品分离各种零售蔬菜在俄亥俄州和不是一个单独的产品类型,这是先前研究的目的致力于沙拉在苏格兰(12]。与我们的报道方法,类似于以前的研究(10,11),我们有孤立的产毒素的梭状芽孢杆菌从外部的叶子一卷心莴苣,一个茄子和青椒的表面在俄亥俄州。的患病率梭状芽孢杆菌在我们抽样蔬菜是2.4%,这类似于最近发表在加拿大、法国和苏格兰和早些时候在英国(2.4 - -7.5%)10- - - - - -12,30.]。我们发现也类似于估计集中荟萃分析加权的患病率梭状芽孢杆菌2.3%的蔬菜(2.0 - -3.2%;五个研究)。累积荟萃分析表明,普遍存在的报道梭状芽孢杆菌在蔬菜均匀和类似的(2.3%)。与预期相反,知识梭状芽孢杆菌孢子在土壤、生存的根菜产品覆盖土壤污染的碎片在目前的研究梭状芽孢杆菌。因为在一起,我们的患病率调查结果应该是小心谨慎的解释梭状芽孢杆菌孢子可以达到蔬菜通过各种渠道如受污染的肥料,土壤、灌溉用水(43)以及下游的蔬菜产业链通过工人的手,在运输过程中污染和零售,从存储显示或客户。此外,大多数研究,包括我们的,只有一个浓缩复制使用。增加培养法复制的数量可能会产生较高的C固执的在蔬菜已经被证明可以有效检测的能力梭状芽孢杆菌和应变多样性肉(14]。

无论我们PCR-genotyping发现,抗菌素耐药的存在的意义梭状芽孢杆菌孢子在蔬菜仍不确定,因为食品安全相关性对孢子负载在受到人类食物和CDI的链接仍不清楚。然而,由于CDI往往造成的梭状芽孢杆菌抗菌素耐药性菌株高常用抗菌素,是有关强调2/3的隔离在这项研究来自即食蔬菜(生菜、胡椒),对莫西沙星和克林霉素,广泛用于治疗人类的。抗菌素耐药性的梭状芽孢杆菌是很重要的,因为抗菌素的使用增加了风险CDI破坏肠道菌群,增强实验对殖民的孢子数量较低(44]。

抗菌MIC值,常用作为决策工具,经常被报告为一个参数列表(麦克风₅₀,麦克风_90年,意思是/ SD和%测试药物的耐药株)没有阶级之间的相关性。进行一个断点MIC-annotated线图分析在这项研究中我们能够想象的截然不同的抗菌素耐药性的莫西沙星和克林霉素梭状芽孢杆菌隔离从蔬菜相比,动物衍生株来自俄亥俄州的孤立我们的实验室和其他州在美国18)(图2)。分析数据从先前的研究以及麦克风梭状芽孢杆菌在苏格兰的即食沙拉(灭滴灵、万古霉素、克林霉素和莫西沙星)(12]匹配我们的莫西沙星/克林霉素的发现,表明这样的临床相关的耐药模式可能是频繁的蔬菜。

因为大部分蔬菜的研究报道梭状芽孢杆菌有关人类cdi(相同的基因型,毒素毒性和抗菌素耐药性),预防和教育措施需要减少无意暴露易感人群的风险,建议(45]。适当的清洁和去除外叶层的原始的新鲜蔬菜消费和足够的烹饪和处理(46,47的相关产品可能有利于减少食源性接触。总之,的患病率梭状芽孢杆菌在蔬菜仍然很低。我们的报告主要强调抗生素莫西沙星的存在/克林霉素抗性组合梭状芽孢杆菌孤立的形式在美国即食蔬菜。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

亚历克斯Rodriguez-Palacios和Sanja大型相等贡献者。

承认

研究的联邦基金分配给俄亥俄农业研究与发展中心,美国俄亥俄州立大学。

补充材料

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