基因型表征yersinia eNteCoolitica.利用SE-AFLP、ERIC-PCR和PFGE从猪和屠宰场分离的生物型4/O:3菌株

抽象的

yersinia eNteCoolitica.是一种食虫病，导致人类和动物的疾病。生物型4 / O：3通常与yersiniosis常相关，其特征在于存在染色体和超染色体毒力基因。分子键入方法已成功用于表征Y.肠道罗密亚遗传异质性，研究不同起源的细菌流行病学。在这项研究中，320Y.肠道罗密亚根据毒力分布，Biotype 4 / O：3个源自猪和屠宰静脉的分离物，通过SE-AFLP，ERIC-PCR和PFGE技术键入61个分离物。源自猪的大多数分离物，主要的毒力剖面是AIL.+vir+rfbc.+ystA+，代表83.4%的受试菌株。所有的Y.肠道罗密亚4 / O：3分离物至少为阳性ystA基因。SE-AFLP和ERIC-PCR模式是高度均匀的。SE-AFLP比ERIC-PCR更辨别，并根据屠宰场倾向于簇分离。尽管遗传多样性有限Y.肠道罗密亚4 / O：3，PFGE被证明是考虑一个差异的最辨别技术。肥胖的猪被证明是一个重要的水库Y.肠道罗密亚生物型4 / O：3携带毒力基因。

1.介绍

yersinia eNteCoolitica.是一种重要的人畜共患病病原体，可引起人类和动物的急性腹泻，末端对肝炎和肠系膜淋巴结炎[1那2]．隔离物在很大程度上对人类负责yersiniosis在欧洲，日本，加拿大，美国属于生物型4 / O：3 [1]．这种疾病的流行病学尚不完全清楚。

猪被认为是疾病的唯一储层Y.肠道罗密亚4/O:3型等分离株已被频繁分离[1]．据报道，这种生物型在猪屠宰场中的患病率为56％在芬兰[3.德国南部60％[4.]．O:3型在美国从屠宰猪中恢复的分离株中占主导地位[5.]．Martínez等。[6.]报道，肥育猪似乎是致病性的重要储层Y.肠道罗密亚在比利时，意大利和西班牙。

致病生物型4/O:3的毒性归因于染色体和染色体外基因的存在。的质粒鼠疫毒力（pyv）编码粘合剂a（游泳时）， 这鼠疫外蛋白（yops.）来自III型分泌系统和转录调节因子基因（vir) [7.那8.]．染色体毒力基因包括发票（invasin），AIL.(附件和入侵所在地)，以及ystA（鼠疫稳定的毒素A）[9.]．这些因素的许多因素仅限于致病性PyV轴承株Y.肠道罗密亚如AIL.和YSTA，虽然这一点发票致病性和非致病性菌株都有基因[10]．

分子分型方法已被用于研究遗传异质性Y.肠道罗密亚．获得的大部分数据，特别是那些关于血清型O：3的数据，表明这些菌株很好地保守[11]．尽管遗传多样性有限，Y.肠道罗密亚生物型4/O:3株菌株已通过重复基因外回文(REP)和肠杆菌重复基因间一致序列-(ERIC-) PCR、PCR-核型和脉冲场凝胶电泳(PFGE)等分型方法成功表征[10-14]．

在巴西，流行病学Y.肠道罗密亚不常见。在一些关于细菌的研究之一，Falcão等人。[10]报道了人类和动物分离出的脉搏型高度相似。这些PFGE结果证实了以前其他国家的观察结果，这是猪首次被确定为一种潜在的猪源Y.肠道罗密亚4/O:巴西有3人感染。本研究的目的是鉴定yersinia eNteCoolitica.4/O:通过单酶扩增片段长度多态性(SE-AFLP)、ERIC-PCR和PFGE技术，从巴西圣保罗的猪和屠宰场环境中分离出3株分离物。

2。材料和方法

2.1。菌种保藏菌株

以下菌株作为生化和PCR检测的阳性和阴性对照:yersinia eNteCoolitica.o：3生物型4（Myo-SW / 897/63），Y.肠道罗密亚O：8生物型1B（P311-WF-albany，NY USA），Y.肠道罗密亚O：9生物型2（My79-Nilhén-Suécia），Y.Psudotuberculosis.-IAL1791,Y. Frederiksenii.-CIP8029和Y. Kristensenii.-CIP9993。这些菌株由巴西RJ Oswaldo Cruz研究所(IOC/FIOCRUZ)细菌学部的Ernesto Hofer博士提供。

2.2。取样和微生物分析

共320Y.肠道罗密亚生物型4/O:3株。这些分离物是以前获得的，如Paixão等[15]，在扁桃体上，来自屠宰场和市场环境点的拭子，猪肉从2007年至2008年之间进行的12次收集。

将样品用冷富集用磷酸盐缓冲的盐水，山梨糖醇1％和胆汁盐1.5％（Difco-BBL，底特律，MI，USA）进行10至14天。在0.5％盐水溶液中，在选择性琼脂平板上在电镀之前，立即通过用0.5％KOH的碱处理，在0.5％盐水溶液中的碱处理，在0.5％盐水溶液中进行碱。肉汤的等分试样（10 μL)被镀于MacConkey (Difco-BBL，密歇根州，美国)和cefsulodin - irgasen - novobiocin (CIN)琼脂(Difco-BBL，密歇根州，美国)上。培养皿在30°C需氧条件下培养24小时。从每一种选择性琼脂中选择具有暗示形态的菌落，进行克里格勒铁和克里斯滕森尿素生化鉴定，并进行蔗糖、鼠李糖和蜜二糖的发酵。

根据Souza等人提出的生物型模式，生物化学鉴定的分离物是生物化学的。[16，并在巴西RJ的Oswaldo Cruz研究所(IOC/FIOCRUZ)细菌学系使用单价抗血清凝集试验对他们进行了血清分型。

2.3。DNA提取和毒力基因检测

根据Boom等人的说法，纯化的DNA已经恢复。17]提取DNA的方法，并在20°C保存。同时对DNA样本进行扩增AIL.依恋入侵基因;入侵基因(发票）， 这鼠疫热稳定型肠毒素A基因(ystA），O：3-抗原基因（rfbc.）和毒力调节因子基因（vir），如闪白的Lambertz和Danielsson-Tham所描述的[18]．扩增在50-中进行μl含有5的反应混合物 μL的DNA模板，1.5毫米MgCl₂，每个DNTP的200毫米，每个引物20pmol和1u的Taq DNA聚合酶（LGC BioteCnologia，SãoPaulo，巴西），1 x PCR缓冲液和超纯水。

扩增条件为:94℃初始变性3 min, 94℃变性30秒，60℃退火1 min, 72℃延伸1 min，最后72℃延伸5 min，循环30次。PCR产物用蓝绿(LGC, São Paulo, Brazil)染色的2%琼脂糖凝胶分离，并使用100 bp DNA梯子(LGC biotecologia, São Paulo, Brazil)进行鉴定。

2.4。基因分型

从320年Y.肠道罗密亚使用SE-AFLP，ERIC-PCR和PFGE技术选择生物型4 / O：3分离物，61用于基因分型。应变选择基于屠宰场，收集号和阳性动物。

2.4.1。单酶扩增片段长度多态性(SE-AFLP)

根据Mclauchlin等人的描述进行SE-AFLP协议。[19，其产物在蓝绿染色的2%琼脂糖凝胶中28 V电泳24 h检测(LGC biotecologia, São Paulo, Brazil)。使用ImageMaster照片文档系统(GE Healthcare do Brasil Ltda, São Paulo, Brazil)在紫外线照明下拍摄图像。

2.4.2。肠杆菌基因间重复一致序列(ERIC-PCR)

ERIC-PCR按照Versalovic等人之前的描述进行[20.),使用5μL从提取的DNA, 1.5 mM的氯化镁₂， 10 pmol引物ERIC1 (atgtaagctcctggattcac)和ERIC2 (AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG)， 1.0 U Taq DNA聚合酶(LGC biotecologia, Sao Paulo, Brazil)， 1 X PCR缓冲液，水，以完成50个总体积μL.用35个循环进行PCR反应，在94℃下使4分钟的变性，在50℃下退火60秒，并在72℃下延伸2.5分钟，随着20分钟的最终延伸而增加在72°C时，如Rafiee等人所述。[21]．扩增产物在2%琼脂糖1000 (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)凝胶中经蓝绿染色(LGC biotecologia, São Paulo, Brazil)在35 V下电泳20 h检测。

2.4.3。脉冲场凝胶电泳（PFGE）

将菌落转移至10ml的BHI肉汤（DiFCO），并在摇动下在28℃下生长过夜。将细菌悬浮液以1500rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于10ml Pett IV溶液（10mM Tris-HCl [pH 8.0]和1M NaCl，10mM EDTA）中。将细菌悬浮液在1500rpm下进行10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于1ml裂解缓冲液中（1M NaCl，10mM Tris [pH 8.0]，200mM EDTA，0.5％Sarcosyl，以及0.2％脱氧核酸钠）。在0.5 x Tbe中，琼脂糖秀金2％（Cambrex Bio Science Rockland，Inc.，East Rutherford，NJ，美国）准备好。一个400卷 μ将L的细菌悬浮液加热至40℃，加入400℃ μL加热的2%琼脂糖溶液。立即将混合物倒入孔中，在8 - 10°C下冷却10分钟。塞子置于2.5 mL裂解缓冲液中，70μL蛋白酶K（0.5mg / ml; LGC BioteCnologia，Sao Paulo，巴西）在温育之前加入56℃持续20小时。将塞子在1mL TE缓冲液中冲洗一次（10mm Tris，1mM EDTA）。

用5ml 1x TE缓冲液在37°C下清洗插头两次，每次30分钟，然后在4°C下存储在1ml 1x TE缓冲液中。DNA以5u不我酶（新英格兰生物Biolabs）μG 37℃的DNA为4小时。PFGE（厨师III; Bio-Rad Laboratories，USA，USA）是在0.5 x Tbe Buffer的1％Seekee eakem Gold Agarose Gel（Cambrex Bio Science Rockland，NJ，East Rutherford，NJ）中进行了一个将时间切换为7至23秒，在14°C下45小时。凝胶用1 x sybrsafe（Invitrogen Corporation，Ca，USA）染色40分钟，并在紫外线泛温下拍摄。使用Lambda DNA-PFGE标记（New England Biolabs Inc.，USA）鉴定DNA片段。

2.5。统计分析

通过对限制性片段大小的综合两两比较，使用Dice系数来确定分离株的亲缘水平。从骰子系数中获得的平均值应用于UPGMA，使用BioNumeric 6.6(应用数学)生成树状图。

使用90％的截止分析AFLP和ERIC-PCR技术产生的簇。具有四种或更多种不同频段的样品被分类为不同的脉冲型[22]．使用隔离物之间的至少一条差异计算歧视性指标，如猎人和加斯顿所描述的[23]．

结果

320Y.肠道罗密亚生物型4 / O：3分离物，从屠宰场1环境中分离出两（0.63％）。剩余的分离物来自来自两个屠宰场的猪的扁桃体样本。猪肉和屠宰场2或市场环境中没有孤立株。通过320的PCR测试获得的毒力分布Y.肠道罗密亚4 / O：3个分离株在表格中描述1．主要的轮廓是vir+AIL.+rfbc.+ystA+，代表83.4％的测试隔离物，在两个屠宰场中具有相似的高频。这vir-AIL.+rfbc.+ystA+型材是两种屠宰场中最近观察到的入射毒物模式。全部Y.肠道罗密亚4/O:至少有3株菌株为阳性ystA基因;两种环境分离株的所有毒性基因检测均呈阳性。

从320个分离物中，选择61种SE-AFLP，ERIC-PCR和PFGE的基因分型。AFLP Dendrogram分析（图1）显示15种模式高度均匀。使用90％的截止截断鉴定了九簇;观察到，未观察到与屠宰场相关的分离株，并且未观察到与毒力分布相关的聚类趋势。埃里克-PCR模式更加保守（图2），90％相似性切断导致仅两个簇（A和B）。集群A由77.05％组成Y.肠道罗密亚分离含有四种不同的Eric-PCR模式。与起源，分离位点或甚至毒力分布有关的基因型中未观察到聚类趋势。为AFLP和ERIC-PCR获得的鉴别指标分别为0.70和0.36。

PFGE树状图(图3.)透露了35份资料。观察到分离株倾向于按屠宰场分组;这一发现并不适用于所有的档案。毒力谱表现出类似的情况;虽然它们表现出更强的倾向于与同一来源和收集月份的分离物聚在一起，但它们并不是聚集在同一个侧面。PFGE技术的鉴别指数为0.97;然而，使用van Belkum等人建议的标准。[22[所有测试分离株只能形成一个簇或脉冲型。

4.讨论

本研究采用AFLP、ERIC-PCR和PFGE三种分子分型方法进行鉴定Y.肠道罗密亚生物型4 / O: 3隔离。毒力谱的特征也通过研究AIL.那ystA那rfbc.,vir基因。大部分分离株来源于猪扁桃体样本，并呈现了所有研究的毒力基因，提示育肥猪是一个重要的毒力库Y.肠道罗密亚生物型4/O:3携带毒性基因的圣保罗州屠宰场。

yersinia eNteCoolitica.是一种重要的肠道病原体;据推测，主要感染途径为食源性，猪肉是人类感染的一个潜在来源[1那4.]．在欧洲，Y.肠道罗密亚生物型4 / O：3已被证明是无症状猪中的主要存在[24]．据报道，曾在贫困猪中的生物型4 / O：3的患病率在芬兰和德国的50％上升[3.那4.]．

我们的结果证实了这些以前的数据，显示较高的患病率Y.肠道罗密亚生物型4 / O：3在猪中，不会在猪肉或肉类市场环境中分离这种生物型。我们的结果也将猪肉的古典知识与人类感染的重要来源相矛盾[1那25]．的高隔离率Y.肠道罗密亚生物型4 / O：3在农场和屠宰猪中是一个重要的公共卫生问题，特别是当他们是水库时Y.肠道罗密亚携带毒力基因。

超过80％的学习分离物呈现了毒力基因AIL.那ystA那rfbc.,vir，所有分离物至少为阳性ystA基因。唯一呈现可变结果的基因是vir那rfbc.,AIL.．转录调节因子基因（vir）是一种血型胞菌毒力基因，其存在归因于致病生物型[7.]．Falcão等。[10]报告了变量的发病率vir基因Y.肠道罗密亚质粒基因表达的动物来源和可变结果的分离物。

染色体AIL.基因被认为是一种与毒力高度相关的毒力标记Y.肠道罗密亚[26]．由于其作为毒力标记的稳定性，AIL.曾用作致病性的检测方法吗Y.肠道罗密亚．Tadesse等人。[27报道了Y.肠道罗密亚serogroup o：3隔离为负AIL.基因。在这项研究中，只有十个分离物呈现毒力剖面vir-AIL.-rfbc.+ystA+．这rfbc.基因是致病的标志Y.肠道罗密亚生物型4 / O: 3 (18那28]．关于这个基因的文献信息有限，如前所述vir和AIL.，对这些基因的缺失或其表达缺失对毒性的影响所知甚少Y.肠道罗密亚生物型4 / O: 3。

分子打字Y.肠道罗密亚4 / O：3至AFLP，ERIC-PCR和PFGE显示出高均匀性，在本研究中测试的61个分离物中具有超过80％的相似性。基于DNA的分子方法已成功用于表征Y.肠道罗密亚生物型和血清型[10那29]．生物型4 / O：3分离物目前有限的遗传多样性。我们的结果说明了这一事实，特别是在Eric-PCR分析中;虽然这种技术被认为比REP-PCR更辨别，但对于分离不同血清型之间的分离物看起来更有用[11那13]．

AFLP比ERIC-PCR具有更高的鉴别指标，且菌株倾向于按来源屠宰场分组。这种技术似乎能更好地区分Y.肠道罗密亚根据生物型和血清型，和生物型4 / O：3分离物被认为是最克隆的[27那29]．

PFGE是最佳的鉴别技术Y.肠道罗密亚生物型4/O:3株菌株，差异为1个带，但相似性均大于91%，差异不超过4个带。生物型4/O:3脉冲型的同质性已被报道[12那25]，尽管使用三种宏限制酶可以有效区分不同脉冲型的4/O:3个分离物[14那30.]．用一种酶进行宏观限制分析被证明是有用的，对实验室常规分析更实用[10]．

尽管分子打字方法似乎评估了克隆性Y.肠道罗密亚生物型4/O:3分离株，关于是否存在与来源、分离位点甚至毒力谱相关的聚集趋势，信息很少。因此，这些方法在流行病学研究中的益处有限[24]．因此，基于dna的分型技术必须辅以额外的流行病学信息以及表型和基因型特征，以加强对这方面的知识Y.肠道罗密亚生物型4 / O: 3隔离。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了Fapesp-sãoPaulo研究基金会，研究项目06 / 55501-0，以及Coordenaçãodeaperfeçoamentodevesoaldednível上级（斗篷）。

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