人类精子与金黄色葡萄球菌:分子生物学方法

文摘

精子固定因子(SIF)导致100%的固定精子隔绝金黄色葡萄球菌当使用质特征(液相色谱-光谱法)显示,这20 kDa蛋白质与hsp - 70蛋白肽序列相似性。它完全被发现(100%)抑制毫克^{+ +}腺苷三磷酸酶活性精子浓度的100μ克毫升⁻¹。精子样本处理SIF还显示减少钙ionophore-induced顶体反应与控制样本(仅接受钙离子载体)。绑定FITC标记的研究SIF精子使用荧光显微镜显示绑定的SIF的精子表面受体SIF绑定。受体被3 m氯化钠提取,通过凝胶渗透色谱法纯化。受体的特征MALDI-TOF (Matrix-assisted激光解吸电离时间飞行)表明,受体与MHC II级抗原共享序列相似性。量热的一项研究表明,纯化的精子受体一半是特定配体受体配体的结合是enthalpically (−11.9 kJ摩尔⁻¹J)以及由熵(21.53摩尔⁻¹K⁻¹)喜欢导致吉布的−18.57 kJ摩尔自由能⁻¹。

1。介绍

金黄色葡萄球菌是人类中最多才多艺的和成功的病原体。它有能力引起各种感染在众多生态区位内的主机。殖民鼻孔,叶腋,阴道,咽或受损皮肤表面,导致各种化脓性感染和toxinoses (pus-forming)在人类身上。除此之外,金黄色葡萄球菌可以说是占据主导地位的有机体与原发性不孕,相似的雄性和雌性之间(1]。金黄色葡萄球菌被观察到的是诱发机体感染占精液的68.2% (2]。这是符合报告Okon et al。,在那里金黄色葡萄球菌分离出62.5%的液体(3]。金黄色葡萄球菌也被报道从宫颈通常孤立的微生物样品(4]。Huwe等人研究了不同uropathogenic微生物的影响对人类精子的运动性参数通过CASA和报道金黄色葡萄球菌阻碍精子的运动性(5]。相似的研究由刘等人在某些uropathogenic微生物对人类精子运动参数的影响,发现显著降低精子的运动性精子coincubated时金黄色葡萄球菌(6]。一些作者认为,细菌和精子之间的直接交互促进精子的固定7- - - - - -9),而另一些报道的证据可溶性杀精子的因素产生和细菌分泌的细胞外介质(10]。

在之前的工作在我们的实验室中,我们也能够隔离的金黄色葡萄球菌从子宫颈的不孕妇女,导致100%的固定精子凝集。固定因素负责精子分离和纯化(11]。此外,它对各种精子参数的影响进行了研究。精子的运动性需要能量的形式ATP (12]提供的精子线粒体权力推动的鞭毛运动精子受精的网站(13]。因此似乎可能抑制精子的运动性与SIF治疗后可能是由于atp酶活性下降或不平衡的分子生物学意义。此外,在人类精子顶体反应的分析建议估计人类精子的受精能力在临床领域(14]。因此,在Mg SIF的效果^{+ +}atp酶活性和顶体反应是评估。然后是尝试隔离SIF的相应受体(15]。进一步描述SIF和SIF绑定受体SIF将有助于更好的理解和受体的相互作用,可以作为一个潜在的候选治疗原因不明的不孕。

2。材料和方法

2.1。精液样本

精液样本来自男性参加政府Multispeciality医院不孕不育诊所,部门16日昌迪加尔,通过自慰到无菌宽口容器中。根据世卫组织标准只有射精精液参数显示正常(16]。样品在室温下进行液化30分钟。实验1 h内获取样本。准备洗的精子样本,在精子细胞颗粒保持在500转离心后10分钟,之后与无菌磷酸盐缓冲盐水洗两次(PBS)(50毫米,pH值7.2)。

2.2。微生物

宫颈拭子从16岁以下女性的35年,患有不明原因不孕参加政府Multispeciality医院妇产科学系,昌迪加尔部门16日。样本有血琼脂平板和板块在37°C耗氧孵化24 - 48 h。根据Bergey隔离被确定的限定词细菌学手册。微生物鉴定到属水平只有。总共27个隔离。在不同的隔离,葡萄球菌(51.85%)是主要的生物礼物。当24和48 h的影响老细胞培养和细胞自由上层清液颈隔离对人类精子的运动性进行了研究在体外,结果表明,17的27个隔离(63%)显著降低精子的运动性(17]。隔离导致100%的固定的精子被选中作进一步研究。只有这个菌株进一步被生化测试和被发现凝固酶阳性金黄色葡萄球菌。这一毒株已被指定为金黄色葡萄球菌VP2。

2.3。SIF的隔离和净化细菌

SIF提取和纯化从72 h的细胞培养金黄色葡萄球菌以前的方法在实验室标准化(11]。简单的细胞培养金黄色葡萄球菌生长在脑心浸液肉汤(BHI),在震动条件下(220 rpm) 37°C 72 h,离心机在5000 rpm 15分钟在4°C。SIF由硫酸铵沉淀纯化从上层清液,凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法。检查净化状态,聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)。

2.4。液相色谱-光谱法纯化SIF的(质)

2.4.1。处理的乐队和胰蛋白酶的消化

页面后,蛋白质乐队切除和凝胶块是100年洗一次μL高效液相色谱级水10分钟,然后在100年使退色μL使脱色溶液1(100毫米碳酸氢铵在50%乙腈50%)通过孵化为30分钟37°C。使脱色的解决方案是丢弃和凝胶块于100年脱水μL(乙腈(ACN) 37°C五分钟,然后风干为5分钟37°C。这种凝胶块在150年减少μL 10毫米的二硫苏糖醇(DTT) / 100毫米的碳酸氢铵孵化30分钟的56°C。它在100年被烷基化μL 50毫米碘乙酰胺/ 100毫米碳酸氢铵为30分钟在黑暗和烷基化缓冲区被丢弃。凝胶块是用100年μL使脱色溶液、删除与100年再一次脱水μL ACN 5分钟然后风干在37°C为5分钟。凝胶块水化~ 5μL胰蛋白酶溶液(20 ngμl⁻¹在37°C) 10分钟。凝胶块孵化在37°C 16 h。

2.4.2。肽提取

提取肽隔夜孵化后,~ 20μL肽提取溶液(1%三氟乙酸、组织)添加和用水浴超声发生器5分钟。1 - 5μL女士提取肽被用于后续的分析。

2.4.3。质

一个6μL的解决方案是用于分析注射质/女士(美国安捷伦,帕洛阿尔托,CA)。数据分析使用安捷伦离子阱分析软件5.2版本和蛋白质被确定由对吉祥物的数据库搜索数据库。

2.5。在体外SIF对精子的影响毫克^{+ +}腺苷三磷酸酶活性

毫克^{+ +}研究了腺苷三磷酸酶活性精子根据Kielley [18]和Chappel [19用细微的修改。Tris-HCl (0.2 m, pH值7.6)洗精子(1×10⁸在50 Hz /毫升)用10分钟(10周期30年代的1分钟间隔)在4°C。atp酶的反应混合物由0.2毫升Tris-HClbuffer(0.2米,pH值7.6),0.2毫升MgCl₂(5毫米),0.2毫升的ATP(6毫克毫升⁻¹),0.2毫升用精子悬液。不同浓度的SIF (12.5μ25克,μ50克,μ克,100μg)被添加到反应混合物。混合是在37°C的环境1 h。这段孵化后,反应停止通过添加1毫升的冷10%三氯乙酸(TCA),然后一夜之间在4°C的环境对蛋白质沉淀。控制管中包含的所有组件的反应混合物但柠檬酸添加在开始停止atp酶活性。无机磷(Pi)决心根据公布的方法博伊斯et al。20.]。一个单位的atp酶表达μπ的g 1 h孵化后发布。实验重复三次。

2.6。在体外SIF对精子的顶体反应的影响

精液液化后样品洗两次(500 rpm, 5分钟)与人类输卵管流体介质(HTFM)含1%人血清白蛋白(HSA) (21]。精子浓度调整到40×10⁶毫升⁻¹和精子悬架分为两个整除(测试和控制)。测试样本孵化3 h与相同体积的SIF在37°C,而控制准备通过添加相同体积的PBS(50毫米,pH值7.2)在相同的条件下。3 h后,精子从测试和控制处理要么0.1% DMSO(自发顶体反应)或10μ米钙离子载体A23187(引起顶体反应)1 h在37°C。随后,精子在HTFM洗没有HSA (500 rpm, 10分钟)。3%戊二醛和孵化的颗粒是resuspended 20分钟在37°C。经过进一步洗丸resuspended 10 - 50μL HTFM,抹到载玻片。干燥后,精子染色在俾斯麦布朗(0.8%,去离子水,pH值1.8)5分钟,用水洗了三次,沾着玫瑰红(0.8%,0.1三羟甲基氨基甲烷缓冲液,pH值5.6)25分钟。第二洗涤过程后,精子被脱水在50%,70%,和96%乙醇与水冲洗,并在1000 x放大光显微镜下检查。

2.7。绑定的SIF研究精子通过荧光显微镜

纯化配体共轭是用FITC FITC标记工具包(GeNei FITC标记工具班加罗尔GeNei(印度)经纪有限公司)。1毫克的纯化配体混合FITC根据F / P比值按照指示的工具包。

液化精液样本被两次与PBS和颗粒终于在500年暂停了μPBS的L。到100年μL精子悬液,200μL共轭配体添加和孵化37°C 1 h。150μL 3%的甲醛添加反应混合物是孵化37°C 1 h。孵化后,反应混合物与PBS清洗三次。球终于溶解在50μL (PBS(50毫米,pH值7.2)。潮湿的山是准备和荧光显微镜下观察到的1000 x放大。

2.8。从人类精子提取SIF的受体

SIF受体是人类精子的方法提取之前在实验室标准化(15]。简而言之,受体被治疗精子洗涤3 m氯化钠提取4 h在震动条件下在37°C。3 m NaCl-treated精子样本在1500 rpm离心机广泛了15分钟,然后透析对PBS(50毫米,pH值7.2)在寒冷的条件下。6000年它集中使用聚乙二醇(PEG)。受体的净化进一步使用凝胶过滤色谱法的纯度由本地页面检查做准备。

2.9。Matrix-Assisted激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)的受体

处理的蛋白质乐队、胰蛋白酶的消化和肽提取做了前面描述的一样SIF的质。MALDI-TOF分析样品制备方法使用干滴。1μL肽溶液(肽提取胰蛋白酶消化后)和1μL的一个合适的矩阵,例如,alpha-cyano hydroxycinnamic酸(HCCA) 1: 2 v / v的乙腈(ACN):组织0.1%,涨跌互现。1μL的混合谱上发现了目标板和允许在室温下晾干。肽校准标准(力量)也准备以同样的方式。谱技术目标板装入Ultraflex MALDI-TOF后续肽谱采集和分析。波长337纳米的激光功率用于电离的样品发现在目标板上。肽峰与峰获得的校准肽校准标准。肽谱后,女士进行了分析使用Flex分析软件(2.2 v,力量)。后续数据分析女士进行了使用Biotools软件(2.2 v,力量)和吉祥物搜索引擎(矩阵科学)与NCBI数据库。

2.10。量热分析Receptor-Ligand交互

配体与受体的结合焓在PBS决定使用微量反应量热计。1.5毫升的受体(200的数量μ克毫升⁻¹)在缓冲被放置在每一个量热瓶和250年μL注射器(速度3μL交会⁻¹与配体(500年)被加载μ克毫升⁻¹)。实验是使用滴定模式进行的。结合常数K,焓绑定,是通过使用迭代非线性最小二乘回归方法计算。

3所示。结果

金黄色葡萄球菌隔绝与不明原因的不孕女性的子宫颈细胞分泌抑制精子能动性的因素。此外,因素和之前报道的分离和纯化。SIF纯化的蛋白质约20 kDa的精子的固定活动。

3.1。质净化SIF的

根据质测量20 kDa乐队,蛋白质肽序列相似性与hsp - 70蛋白质与蛋白质在NCBInr数据库,使用吉祥物搜索程序。搜索获得最高分数143蛋白质等hsp - 70所示的分数分布的直方图的20个最佳匹配的蛋白质。蛋白质分数大于57 ()被认为是重要的。

3.2。在体外SIF对精子的影响毫克^{+ +}腺苷三磷酸酶活性

纯化的SIF的效果金黄色葡萄球菌在毫克^{+ +}三磷酸腺苷酶活动的汇集和用精子从人类进行了研究。从结果(表1),它可以观察到,SIF抑制毫克^{+ +}腺苷三磷酸酶活性精子剂量依赖性的方式。在100年的浓度μ克毫升⁻¹SIF,没有检测到毫克^{+ +}atp酶活性,而在较低浓度的50μ克毫升⁻¹SIF的atp酶活性下降从931.7±1.3单位(控制)195.23±2.3单位。

3.3。在体外SIF对精子顶体反应的影响

当SIF对人类精子顶体反应的影响,研究了两种模式下的染色观察光学显微镜(1000 x)。红色或粉红色acrosomal地区染色显示完整的顶体精子,而白色,棕色,或解释为acrosome-reacted黄顶体精子。的自发顶体反应的精子百分比SIF-treated样本与控制(DMSO)。治疗与钙离子载体,大多数(约。100%)的精子进行了顶体反应。然而,精子孵化与SIF HTFM (HSA) 1%未能发生顶体反应,以应对钙离子载体挑战(图1)。

3.4。绑定的SIF研究精子通过荧光显微镜

当精子样本处理FITC标记SIF荧光显微镜下观察,明亮的绿色荧光被认为在精子与精子描绘了SIF的绑定。这表明可能存在一些受体表面的SIF的精子结合(图2)。

3.5。MALDI-TOF纯化受体

根据MALDI-TOF分析纯化62 kDa乐队,蛋白质肽序列相似性与MHC II级抗原时产生的光谱被用来寻找匹配NCBInr数据库中的蛋白质,使用吉祥物搜索程序。搜索获得最高分数为68 MHC II类抗原(蛋白质分数大于66是重要的;)。

3.6。量热研究Receptor-Ligand交互

结合常数K (1350 / M),和焓的绑定,(−11.9 kJ摩尔⁻¹)实验计算焓的计算配体和受体之间的相互作用,利用迭代的非线性最小二乘回归方法(表2)。自由能和熵的值被发现是−18.57 kJ摩尔⁻¹和21.53 J摩尔⁻¹K⁻¹分别计算出以下方程:

4所示。讨论

金黄色葡萄球菌是积极的,投机取巧的革兰氏阳性病原体殖民皮肤,前鼻孔,叶腋,咽,尿道20%的人类健康。江和陆金黄色葡萄球菌的主要植物不育男性显著降低精子的运动性(22]。

在之前的工作在我们的实验室,金黄色葡萄球菌导致固定的人类精子宫颈的孤立与不明原因的不孕妇女,和一个精子(SIF)纯化固定因素。进一步描述了使用质。质研究中表明,SIF肽序列相似性与hsp - 70蛋白。诺伊尔et al。23)报道,热休克蛋白(HSP)是immunodominant抗原众多微生物病原体,例如,沙眼衣原体,已被公认为不孕的主要原因(23]。

进一步阐明SIF的贡献生殖失败,纯化的SIF的效果金黄色葡萄球菌在毫克^{+ +}腺苷三磷酸酶活性精子进行了研究,结果表明,SIF atp酶活性下降。没有检测到毫克^{+ +}腺苷三磷酸酶活动精子孵化时SIF在100的浓度μ克毫升⁻¹。任何代理影响精子atp酶活性的影响精子的运动性使其受精的能力。例如,在海胆精子,精子是观察到0.16的atp酶活性μMπ(min×毫克蛋白)⁻¹,而精子所呈现的不动的均质化的活动0.045μMπ(min×毫克蛋白)⁻¹(24),这表明抑制毫克^{+ +}端依赖atp酶可能是精子固定的可能机制之一。

此外,顶体反应的评估可以用来预测成功受精。尽管精子的自发acrosomal反应速率不关联的成功率在体外受精(IVF),可诱导性的指数,衡量不同诱导(孵化后钙离子载体或暴露于低温)和自发的acrosomal反应,是精子受精能力的预后价值25]。当SIF对人类精子的影响进行了研究,发现的百分比acrosome-reacted精子在测试中获得对SIF都低于获得钙ionophore-treated样品(积极的控制)。细菌包括Ureaplasma体和支已经证明有负面影响ionophore-induced acrosomal反应人类的精子吗在体外(26,27]。El-Mulla等人研究的影响大肠杆菌精子的acrosomal反应(28]。结果表明,顶体反应显著低于可诱导性的精液样本使用大肠杆菌比控制样本。结果表明,大肠杆菌顶体反应的影响可诱导性在体外并可能损害人类精子的施肥能力。几项研究已经发现,精子顶体反应诱发反应是减少不育患者(29日]。因此,SIF抑制顶体反应的诱导可能损害人类精子的施肥能力。

从结果看来,Mg的SIF对抑制的影响^{+ +}腺苷三磷酸酶可能独立于离子载体介导的顶体反应,破坏精子是用于估计毫克^{+ +}atp酶活性而完整的精子顶体反应进行评估。

此外,当精子的荧光显微镜孵化与FITC标记SIF,明亮的绿色荧光精子表面。这个绑定SIF和精子给直接证据之间可能存在某种受体表面贴上SIF将精子。因此,在目前的研究中,一个是尝试提取、净化和描述从精子受体,负责与SIF的相互作用产生的金黄色葡萄球菌。MALDI-TOF受体,受体的研究显示与MHC II级抗原序列相似性匹配时NCBInr数据库。这些结果与早期的研究一致,森本晃司等人显然证明了的表达主要组织相容性复合体(MHC)二类分子对小鼠精子细胞通过放射免疫检定法和酶免疫分析法(30.]。精子的研究显示,该网站绑定外源DNA介导的复杂结构的MHC II级分子局部地区后的精子头部。

配体与受体通常涉及分子内和分子间相互作用和动态变化的系统组件。结合交互发生在配体结合的变化反映在反应自由焓和熵,进而确定receptor-ligand协会的自由能。微量热工具和方法是必不可少的工具的一般理解生物大分子结合热力学和特定的生物系统。在目前的研究中,当微观反应量热计是用于确定自由能(ΔG)、焓(ΔH),熵(Δ年代)绑定的SIF纯化受体是观察到的反应是放热产生热量SIF表示特定的受体之间的相互作用和净化。

从上面的初步观察,可以得出结论,SIF隔绝金黄色葡萄球菌可以绑定到精子和精子表面蛋白可能作为绑定SIF的受体。研究还表明,receptor-ligand交互可能负责固定SIF的精子。因此,未来的研究这些receptor-ligand精子固定的详细分子机制的相互作用可能导致改善不孕症的治疗有用的见解,并在尝试创建安全以及有效精子固定避孕药。

确认

这项工作是由基金支持的生物技术(印度生物技术部),新德里。作者还要感谢博士Abha Sarwal, m D。,Pathology, Government Multispeciality Hospital, Sector 16, Chandigarh, India, for her assistance in conducting the studies.

引用

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