检测和量化的嗜肺性军团菌从供水系统在科威特住宅设施测试

文摘

的患病率军团菌pneumophilia水系统的住宅设施在科威特进行期间从2007年11月到2011年11月。共有204个水样收集从水龙头和浴室莲蓬头(n= 82),厨房的水龙头(n= 51),水箱(n= 71),从不同位置的住宅设施在科威特进行筛检嗜肺性军团菌通过标准培养法和实时聚合酶链反应(rt - pcr)。的204个样本,89例(43.6%)阳性样本军团菌spp, 48例(23.5%)标准的文化标本进行检测方法,和85年(41.7%)被rt - pcr检测。文化的积极军团菌样品,数量介于10到2250之间CFU / L。血清学打字48军团菌隔离透露,这些隔离属于6 (12.5%)嗜肺性军团菌血清组1,37(77.1%)隔离嗜肺性军团菌血清组3,1隔离每个(2.1%)属于第四种、7和10。的最小抑制浓度(麦克风)46环境退伍军人对10抗菌素常用的隔离军团菌感染的治疗决定。利福平被发现是最活跃的反对退伍军人血清型隔离在体外。

1。介绍

军团病的爆发是全球追踪到各种环境水源如冷却塔、热水浴缸,淋浴喷头,漩涡和温泉,和公共喷泉1,2]。嗜肺性军团菌血清组1负责军团病报告病例的80% (3,4]。的潜在的健康风险军团菌人类在理论上是与细胞密度高于10⁴到10⁵CFU每公升的水(5,6]。

环境监测的常用方法军团菌是标准的文化技术7,8]。虽然标准的文化方法允许隔离和量化的军团菌从环境中,它有它的局限性:它需要选择性的媒体和长时间的潜伏期;细菌损失可能发生在浓度阶段之后,与热或酸净化;背景干扰生物体军团菌增长可能导致一个实数的低估军团菌在样例;军团菌种虫害可能进入一个可行的但noncultivable状态,很难从水样文化9]。

最近,快速和敏感的方法已经被发现是有吸引力的替代传统的培养法等检测细菌生长缓慢的和爱挑剔的性子军团菌。这些方法pcr方法检测和量化的军团菌在水中主要使用5 s和16 s rRNA对巨噬细胞基因和传染性电位器(米兰理工大学管理学院)基因的退伍军人(10- - - - - -15]。一种real-time-PCR-based快速检测和量化的方法军团菌水样的开发(15- - - - - -17]。现在已经出现了一些商业实时PCR包,这些包之间的主要区别是基于标准化的度的三个关键步骤:DNA提取、PCR准备,和数据分析。然而,所有的pcr方法缺乏区分生命和非生命的能力(非传染性的)军团菌细胞。

尽管环境军团菌监控是建议在一些国家,在科威特,环境监测的军团菌不是,没有积极监测程序存在。此外,相关的研究军团菌是稀缺的18- - - - - -20.]。此外,没有报告的现状军团病的患病率和相关的情况下在科威特。然而,年度报告提出的计划表明,死亡的人口比例(27.6/10⁴人口)是由于呼吸道疾病不指定病因代理(21]。

由于以下因素,很可能的流行军团菌被低估了;科威特是一个炎热的气候温和;水安全法规的缺失军团菌监测和净化;和增加使用冷却塔在休闲和卫生保健设施可能会增加军团病的风险。此外,在夏季水箱水温居民区可能会适合军团菌乘法(50°C)。由于环境接触的可能性军团菌,这是第一个研究旨在确定的流行军团菌在选定的住宅设施在科威特。

2。材料和方法

2.1。水样

共204个样本收集从2007年11月到2011年11月。洗脸盆的水样本来自水龙头和浴室莲蓬头,水龙头(从厨房)()和冷/热水箱(),从不同的居住地点在科威特。水样(1升)被收集在一个无菌2 L塑料瓶包含1毫升0.1 N硫代硫酸钠中和氯消毒剂。

2.2。样品浓度

1 L样本过滤器集中在生物安全柜,将样品注入无菌过滤漏斗47毫米组装包含0.2μ聚碳酸酯过滤器(费舍尔科学,3970约翰溪Ct。30024年,500套房,Suwanee, GA)。当样品通过过滤器,过滤器被无菌从持有人无菌过滤钳,折叠外,并放在无菌,50毫升离心管包含10毫升无菌水。然后,离心管涡一分钟自由细菌和有机材料的过滤和离心,享年3000岁g±100g为30分钟±1分钟。使用无菌刻度吸管无菌,除了1毫升的上层清液小心地删除。存款被漩涡resuspended混合。这是最后的集中在螺旋帽存储容器6°C±2°C在黑暗中。

2.3。标准培养法

从最终精矿0.1毫升接种到缓冲charcoal-yeast提取琼脂基地(代码CM0655;Oxoid;SR0118与兆瓦年选择性补充(英国)代码;Oxoid;英国)和0.01毫升被接种到BCYE琼脂BMPA选择性补充(代码SR0111;Oxoid;英国)。随后,0.2毫升热处理在50°C为30分钟,和0.1毫升和0.01毫升接种到兆瓦年琼脂。此外,0.2毫升的样品在相同体积的HCl-KCl酸缓冲酸治疗5分钟(pH值2.2),和0.1毫升是接种到BMPA琼脂。所有的盘子都在35°C孵化有限公司₂孵化器。板块在72 h - 96 h后检查(4 - 7 d)孵化(22]。怀疑殖民地无菌采摘,飞跑到BCYE琼脂板没有半胱氨酸(BCYE (−)]。可以生长在殖民地BCYE琼脂,但不是BCYE(−)琼脂,被认为是假定的军团菌物种。

2.4。血清和隔离的子群

退伍军人隔离是血清组与乳胶凝集试验商业工具(代码DR0800;Oxoid;英国)根据制造商的指示。进一步确认血清组进行单克隆抗体的德累斯顿面板(23]。

2.5。实时定量聚合酶链反应

实时PCR系统(7500实时PCR系统,应用生物系统公司;美国)和TaqMan嗜肺性军团菌检测试剂盒(应用生物系统公司P / N ED 000833;美国)被用于检测和量化。所有样本运行实时PCR仪器使用他们的DNA使用干净的水从最终精矿中提取DNA提取工具包(应用生物系统公司P / N ED 000849;美国)根据制造商的指示。

2.6。抗菌药物敏感性试验

敏感性测试执行10抗菌素使用E测试麦克风可用最低的范围。测试抗菌素莫西沙星、头孢噻肟、Tigecycline、克拉霉素、利福平、阿奇霉素、红霉素、左氧氟沙星、强力霉素、环丙沙星。药敏测试进行了描述熊先生et al ., 201224]。总之,隔离recultured 2 - 3天在35°C,湿度增加。殖民地被悬浮在无菌水的浓度为10⁷麦克法兰CFU /毫升和调整到0.5。当时棉签蘸暂停和用于接种BCYE补充酮戊二酸。E试验片应用在擦洗表面,和盘子被孵化35°C与湿度增加2天。麦克风是阅读使用立体显微镜从加沙地带的规模的增长抑制截获的椭圆地带。

3所示。结果

共有204个水样收集来自不同地区的住宅供水设施在科威特。所有样品都测试通过标准培养法和rt - pcr检测退伍军人。的204个水样测试,只有48样本阳性标准培养法(23.5%),而85年(41.7%)样品通过rt - pcr(表是积极的1)。实时PCR检测能力较高的文化方法相比之前报道(25- - - - - -28]。

(CFU /毫升)的范围军团菌种虫害和流行血清型隔绝水样本如表所示2。使用标准的培养法,所有阳性样品显示数小于10⁴CFU每升,代表了一种潜在的健康风险的上限对人类[5,6]。血清组的48军团菌隔离也表所示2。退伍军人占所有的孤立军团菌物种。在46退伍军人隔离,隔离的大多数属于血清组3(37隔离),其次是血清组1(6隔离),血清组7(1隔离),血清组10(1把),血清组4(1把)。所有六个分离株的血清组1 OLDA /牛津的子群。

的敏感性退伍军人隔离(麦克风的范围mg / L)到10抗菌素如表所示3。一般来说,隔离都被低浓度的大环内酯类和氟喹诺酮类原料药。作为一个例子,对于血清组1,最低抑制浓度为大环内酯类、红霉素麦克风范围从0.19 - -0.25,0.094 - -0.75对阿奇霉素、克拉霉素和0.125 - -0.19 mg / L,氟喹诺酮类原料药的分别,而中等收入国家从0.38到-0.5不等μ为环丙沙星g / mL, 0.25 - -0.38 mg / L对左氧氟沙星,分别-1.0和0.50 mg / L为莫西沙星。利福平的麦克风是确定为0.008 - -0.016,0.047 - -0.38为头孢噻肟,并为Tigecycline 2 - 3 mg / L,分别对强力霉素和2。类似的易感性模式也观察血清组3。抗菌药物利福平被发现是最活跃的抗菌素对所有退伍军人血清型。

4所示。讨论

在这项研究中,我们审查的流行嗜肺性军团菌在当地住宅供水系统在科威特。rt - pcr进行并行与标准培养法在分析204个水样。我们的研究结果表明,rt - pcr更为敏感,更少的时间消耗,并提供可重复的结果使它更适合作为一个筛选试验来检测和量化退伍军人在环境水样。然而,pcr方法不能区分生活和死亡的细菌。因此,培养法仍然是临床和流行病学比较必要的环境压力和确认但是脉冲场凝胶电泳的出现的疫情分析。因此,定量实时PCR将补充参考标准培养法。

这项研究还显示,频繁的隔离退伍军人血清组3与血清组1。尽管军团病是最常见的原因军团菌血清组1、血清组3也在最近报道引起社区获得性和医院内肺炎(29日,30.]。虽然在本研究分离的数量很小()的优势退伍军人血清组3从环境样本可能是有用的在解释这个血清组在临床流行病学和环境的爆发。

这项研究还显示所有隔离测试对抗菌剂的抗菌易感性经常用于治疗军团病。大环内酯类抗菌药物治疗最常用的军团病(31日]。特别是,利福平,大环内酯类展示了良好的活动退伍军人血清组1和3。据我们所知,这是第一个调查的患病率和药敏军团菌隔绝环境水系统在住宅设施在科威特。

5。结论

军团菌是一种常见的致病性殖民者的配水系统和冷却塔导致严重的健康风险和相当大的法律和企业的经济损失。尽管如此,环境军团菌监控是建议在一些国家,在科威特、环境军团菌没有被监控。这项研究证实了的存在退伍军人血清组1和3在科威特国内commonbeing最多的水系统退伍军人血清组3 (77.1%)。的优势退伍军人血清组3水系统在科威特住宅设施需要进一步调查预测的风险,这种血清组在任何未来的军团病的爆发。

承认

本研究项目是由科威特科学研究所(KISR)。

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