抗菌活性的铜和结合乳酸大肠杆菌O157: H7表面在实验室中、生菜和西红柿

文摘

本研究的目的是评估单独使用铜的效果,结合乳酸大肠杆菌O157: H7表面在实验室中、生菜和西红柿。四个种族的大肠杆菌O157: H7分别接种到BHI汤含有不同浓度的铜(5、10、20和40 ppm, w / v),乳酸(0.2%和0.1,v / v),及它们的组合。孵化后,整除的1毫升每个样本被撤回,镀在BHI琼脂细菌数量来确定。明显的生长抑制()联合治疗的观察铜(40 ppm)和乳酸(0.2%)。的人口大肠杆菌O157: H7降低了3.93和3.39登录生菜和西红柿的表面样本,分别当处理相同的组合。这表明铜和乳酸抑制可以作为一种有效的解决方案大肠杆菌O157: H7新鲜农产品。

1。介绍

新鲜农产品是人类饮食的重要组成部分,但其安全性的担忧正在上升。食源性疾病暴发的存在有关大肠杆菌O157: H7的新鲜农产品增加了在过去的几年里(1,2]。受污染的新鲜农产品因此代表食源性疾病的第二大原因(在美国3]。不同化学药剂(氯、过氧化氢、有机酸、臭氧、等等)被用来净化新鲜农产品表面,但这些治疗不能完全抑制致病菌(4,5]。在这些治疗方法中,氯溶液是最常见的和广泛使用的化学食品防腐剂的新鲜农产品的产业。然而,处理生产的氯化水有一个有限的杀菌作用和产生其他问题由于其潜在的形成致癌物质(6- - - - - -8]。因此,有必要进行更安全、更有效的抗菌素治疗水果和蔬菜。

消费者现在更关注人工化学防腐剂的使用控制食源性病原体。食品工业也考虑使用更好的材料作为抗菌化合物,以确保食品的安全。本文研究的两个治疗被认为是铜和乳酸。铜是人类安全证明尤其使用铜宫内设备(9]。这是一个相对较小的组金属元素对人体健康至关重要。铜是必需的微量微生物的生长和功能;然而,更高的浓度可以产生毒性作用[10]。铜离子已报告有抗菌活性与广泛的微生物,包括沙门氏菌血清,空肠弯曲杆菌,大肠杆菌,单核细胞增多性李斯特氏菌,金黄色葡萄球菌(11- - - - - -13]。金属铜表面有潜在应用抑制代理在食品加工操作的不同阶段11]。铜也已被证明能够抑制发芽、营养生长、孢子形成的tyrobutyricum梭状芽胞杆菌的风险,减少了后期吹在奶酪指示其潜在腐败食品添加剂(14]。乳酸通常是公认的安全、被广泛用作biopreservative在自然发酵的产品15]。乳酸的解决方案是应用最广泛的有机酸之一治疗用于净化食物。例如,乳酸被成功应用到净化肉(16- - - - - -19]。乳酸因此被认为有很大的潜力灭活微生物表面上的水果和蔬菜。

尽管信息使用铜和乳酸净化细菌种群新鲜农产品不可用,很多研究都已经证明了协同抑制对微生物生长的影响。硫酸铜(50 ppm)和乳酸(150毫米)液体添加到猪饲料被发现差值的减少导致10倍鼠伤寒沙门氏菌DT104:30 [20.]。在另一项研究中,一个完整的消除Cronobacter得到的铜(50μ克毫升⁻¹)和乳酸(0.2%)21]。在一项研究中使用苹果酒,减少5 log得以实现大肠杆菌O157: H7和单核细胞增多性李斯特氏菌和铜的结合和次氯酸钠声波降解法(13]。同样,易卜拉欣et al。12]报道显著抑制增长大肠杆菌O157: H7和沙门氏菌当两个铜(50 ppm)和乳酸(0.2%)添加到实验室中、胡萝卜汁。

行动的模式底层铜和乳酸抗菌效果不是很好理解。研究在过去提出了几种机制来解释铜和乳酸的抗菌活性22,23)对细菌细胞的形态学变化。几个技术被用来确定治疗细胞的形态学的影响。扫描电子显微镜(SEM)用于研究微生物殖民和附件食品或食品接触表面(24]。扫描电镜是一种常见的技术用于研究微生物细胞损伤所产生的抗菌化合物。革兰氏阴性细菌的外膜通透性增加,细胞处于酸性物质如乳酸(25]。基于这些信息,我们假设这个影响渗透率可以提高铜治疗革兰氏阴性细菌的抗菌效果。本研究的目标是这样(我)建立铜结合乳酸的浓度,有效地抑制的增长大肠杆菌O157: H7等实验室培养基和(2)确定浓度可以用来净化大肠杆菌表面O157: H7人口生菜和西红柿。

2。材料和方法

2.1。菌株

的四个菌株大肠杆菌O157: H7 (H1730, 43895 +, 43895−86.24)用于本研究获得食品科学与技术系的弗吉尼亚理工学院和州立大学(美国弗吉尼亚州布莱克斯堡)。这些菌株被维护在胰蛋白酶的大豆琼脂偏在4°C。菌株被转移到新鲜的脑心浸液肉汤(BHI;正欲Dicksinson火花,医学博士,美国),在37°C孵化12 h。菌株被飞跑到BHI琼脂板和孵化24小时37°C。每个应变被转移到单一的殖民地BHI肉汤和孵化37°C在使用前12 h。

2.2。剂制备

每个菌株被离心收获(10分钟8000克、4°C)。颗粒细胞在9毫升无菌resuspended蛋白胨的解决方案(0.1%),连续稀释,和100年μL接种到每个治疗样本实现初始接种体水平的大约3日志CFU /毫升。确定铜的影响和乳酸细菌种群产生表面,不同文化的每个菌株生长在10毫升的BHI混合在一起(40毫升)产生四个应变的混合物大肠杆菌O157: H7。这种混合物被离心收获的细胞在8000克15分钟在4°C。上层清液提供了,细胞颗粒在400毫升无菌resuspended蛋白胨溶液(0.1%,w / v)给一个细胞的数量大约9日志CFU /毫升。细菌种群的培养液表面镀复制样品测定BHI蛋白胨系列稀释后溶液(0.1%,w / v)。盘子被孵化24小时在37°C,然后殖民地。

2.3。媒体的准备

7毫升批新鲜BHI汤含铜(3.95 g CuSO股票的解决方案₄ 5 h₂O是由溶解在1000毫升无菌蒸馏水给浓度1000 ppm的铜)5、10、20和40 ppm (w / v),乳酸在0.2%和0.1,v / v(热费希尔科学、公平的草坪,新泽西,美国),准备和他们的组合。额外的7毫升的BHI肉汤不与任何化学被用作控制补充。样本包含控制和乳酸在121°C热压处理过的15分钟。铜的解决方案是通过0.2 -过滤消毒μ米耐尔根过滤产品(Nalge Nunc国际,罗切斯特,纽约,美国)并添加到BHI肉汤。

2.4。测量细菌生长

细菌生长监测通过测量浊度8 h潜伏期使用液体21梅尔顿罗伊分光光度计(威斯康星州Madission热电子科技有限公司,美国)的波长610 nm。最后孵化(8小时),一毫升细菌悬液是治疗连续(1:9)稀释在无菌0.1% (w / v)蛋白胨和100的解决方案μL拨款稀释的表面镀重复BHI琼脂板上。板块在37°C孵化24 h,和细菌菌落数。

2.5。pH值的确定

含铜样品的pH值(20和40 ppm, w / v),乳酸(0.2% v / v),测量他们的组合。酸度计(Accument Excel XL15热费希尔科学、匹兹堡,Pa,美国)第一次校准用标准缓冲pH值4.0和10.0,和每个样本的值都被记录下来。

2.6。生产准备

生菜(摘要以l . var.叶)和罗马西红柿(Lycopersicum esculentum)在当地的杂货店购买(格林斯博罗、数控、美国)和储存在4°C的前一天测试。新鲜的西红柿相似尺寸55 - 65 g之间的权衡,没有外部缺陷在皮肤上,选择和用自来水洗净去除外部污垢。两个或三个外叶莴苣和一些植物就被随手丢弃的内心的叶子被选在洗涤过程。叶子的内部unwilted部分切成4厘米的块接种4厘米。西红柿的生菜叶子然后在室温下干燥1 h在生物安全柜(Labanco公司堪萨斯城,密苏里州,美国)从表面去除水分。

2.7。生产接种

整个西红柿和块(厘米)的生菜叶子被淹没到400毫升剂混合物(~9日志CFU /毫升),准备如前所述,不锈钢勺子,用手轻轻搅拌2分钟在室温(22°C),以确保统一的接种。每个生产类型在400毫升的培养液分别接种1000 - mL烧杯。增加细胞的数量,样品被保存在4°C 12 h在无菌袋。所有生产然后风干层流罩,无菌培养皿中,在室温下1 h,促进细菌粘附在治疗。

2.8。制备治疗解决方案

新解决方案的铜和乳酸准备当天每个实验。铜库存的1000 ppm解决方案是(3.93 g CuSO准备的₄ 5 h₂O每升)和过滤通过0.2 -消毒μ米耐尔根过滤产品。适当的音量被添加到治疗方案给最后的20和40 ppm铜浓度。解决方案包含铜(20和40 ppm),乳酸(0.2%),和他们的组合(20 ppm铜+ 0.2%洛杉矶和洛杉矶40 ppm铜+ 0.2%)和80 v / v渐变没有0.1%(费舍尔科学、公平的草坪,新泽西,美国),二层80只准备在去离子水。所有的解决方案没有铜在121°C消毒,持续15分钟。

2.9。冲洗治疗

朗等描述的洗涤方法。26),委拉斯凯兹et al。2)是在这项研究中使用轻微的修改。风干后,12片生菜叶子和12整个西红柿被单独放在无菌塑料袋然后冲洗10毫升的治疗。治疗包括20 ppm铜、40 ppm铜、0.2%的乳酸,二层80 0.1%,铜和乳酸和80没有渐变。袋被轻轻摇动,每个番茄手擦了1分钟,以促进润湿的治疗方案。袋用生菜叶子也只手搅拌一分钟和动摇100 rpm(轨道瓶,Lab-Line仪器有限公司麦罗斯公园,生病,美国)为3分钟。两个包包含接种生菜和西红柿的样本没有任何治疗被认为是控制样品。洗后,每个样品(治疗和控制),然后转移到一个新的无菌袋和受到10毫升的0.1%蛋白胨的解决方案和搅拌1分钟释放细菌2,26]。

2.10。微生物分析

洗1毫升的暂停每袋连续稀释了9毫升无菌0.1%蛋白胨的解决方案,和100年μL适当的稀释是镀在重复的BHI琼脂。板块在37°C孵化24 h,和细菌菌落数。典型的奶油白色菌落特征大肠杆菌O157: H7只数。细菌数量报告为日志CFU /生菜叶子或日志CFU /西红柿(2]。

2.11。扫描电子显微镜(SEM)

细菌细胞的形态学变化处理或不铜/使用SEM研究了乳酸。细菌细胞洗了磷酸盐(PBS;50 mM, pH值7.4),与5%戊二醛固定在4°C 2 h,然后在缓冲溶液清洗去除戊二醛。接下来,样本与一系列的乙醇脱水的解决方案(50%,70%,80%,90%,100%)和10分钟的暴露浓度。脱水样本立即干,安装在扫描电镜存根和溅射镀膜(Pello模型3中,溅射涂布机91000年Ted斗篷Inc .,纽约,美国用一层薄薄的金。涂层样品扫描电镜下观察(日立S4800,日立公司、东京、日本)在15千伏的电压。

2.12。统计分析

不同治疗方法对他们的影响进行统计分析大肠杆菌O157: H7的析因方差分析复制样品。每个实验重复三次,以确定单独使用铜的效果,结合乳酸细菌的生存和发展。数据分析使用统计分析软件的一般线性模型过程(SAS研究所卡里、数控、美国)使用邓肯的多个范围来确定治疗之间的显著差异()。

3所示。结果

3.1。在实验室研究中

表1显示了影响铜单独或结合乳酸的增长大肠杆菌O157: H7紧张BHI肉汤样本。当大肠杆菌O157: H7菌株生长在BHI肉汤(控制样本),细菌菌株持续增长从最初的浊度(~介绍过o。d。邓肯0.03,610 nm)和达到最大吸光度的0.78 - -0.84 8 h内孵化37°C。当铜添加5 ppm和10 ppm,轻微抑制观察以浊度(0.76 - -0.82)。进一步增加20 ppm和40 ppm铜也出现了轻微增长抑制介绍过o。d。邓肯(0.65 - -0.78)。这表明,铜的存在仅轻微影响的生长抑制大肠杆菌O157: H7。当乳酸添加在0.1%或0.2%乳酸BHI肉汤,轻微的抑制增长。添加5 ppm或10 ppm铜结合0.1%和0.2%乳酸没有显示额外的生长抑制。然而,当铜添加(20 ppm或40 ppm)结合0.1%和0.2%乳酸,抑制观察显著增长。添加铜在20和40 ppm 0.2%乳酸引起更高的测试菌株的生长抑制()相比,单独控制或处理样品。嗨肉汤的pH值样本处理20 ppm和40 ppm铜结合0.2%乳酸是5.69和5.48,分别表明酸不是本研究的主要抑制因素。

表2显示的数量大肠杆菌O157: H7菌株(日志CFU /毫升)生长在BHI汤含有不同浓度的铜和乳酸,单独或结合在一起,在孵化37°C 8 h。在控制样本的数量大肠杆菌菌株从初始人口增加3日志CFU /毫升,平均达到9.93日志CFU /毫升。与添加不同浓度的铜的增长大肠杆菌O157: H7没有明显抑制()。因此,铜就不显著抑制测试菌株。增长BHI汤含有0.1%乳酸相比没有明显影响的增长控制或BHI只包含铜。当大肠杆菌O157: H7是生长在BHI肉汤包含四种不同浓度的铜,结合0.1%乳酸细菌种群的增长相比略抑制控制和铜样品。最多减少1.09日志时达到40 ppm相比铜补充0.1%乳酸乳酸只样品。当大肠杆菌O157: H7是生长在BHI肉汤仅含0.2%乳酸,或结合5和10 ppm铜,减少细菌数量为2.91,3.59和3.73日志CFU /毫升控制相比没有显著不同。然而,当结合20 ppm铜和0.2%的乳酸,4.37日志CFU /毫升细菌数量减少实现相比,控制样本。此外,外加40 ppm铜0.2%乳酸细菌数量降低了5.03日志CFU /毫升相比控制日志CFU /毫升(9.93)。因此,20和40 ppm的铜结合0.2%的乳酸是最有效的治疗抑制的增长大肠杆菌O157: H7的BHI媒体。

3.2。影响生产表面

数据1(一)和1 (b)显示的数量大肠杆菌O157: H7生菜和番茄样品表面处理铜单独或结合乳酸的解决方案。最初的培养液浓度的混合菌株大肠杆菌O157: H7大约是9日志CFU /毫升。未经处理的样品的微生物种群(控制)是8.31 CFU /生菜CFU /番茄块和7.01。清洗生菜片西红柿和全铜20 ppm解决方案导致就达0.66 0.07日志和日志减少大肠杆菌O157: H7,分别治疗40 1.12 ppm铜导致日志和日志减少0.13生菜和西红柿面,分别。样品与0.2%乳酸略冲洗时减少了微生物种群的数量在生菜和西红柿比控制样品表面。当食物样本冲洗结合20 ppm铜和0.2%的乳酸,2.89 2.2日志和日志减少了生菜,西红柿,分别。然而,随着治疗40 ppm的铜和0.2%的乳酸,3.23和2.29日志减少大肠杆菌O157: H7是实现从生菜和西红柿面,分别。我们的研究结果表明,添加治疗40 ppm铜结合0.2%乳酸显著()表面上的细菌数量减少了受污染的食物。

我们还观察到的影响铜结合乳酸和80年渐变作为表面活性剂。有不到1日志减少生菜表面处理时仅0.1%补间80年,并没有明显区别对待番茄表面和未经处理的样品。生菜处理铜20和40与渐变80 ppm,产生超过1减少日志。然而,小于1的日志减少实现从生菜番茄表面比接受同样的治疗。的乳酸(0.2%)二层80(0.1%),下降2.25日志CFU /生菜片和1日志CFU /番茄观察。同样,小于1的日志细菌数量达到生菜和番茄样品冲洗的个人治疗铜和乳酸的渐变80与个人相比治疗没有渐变80。生菜和西红柿处理20 ppm铜和0.2%乳酸,二层80 + 0.1%,细菌数量减少了3.77 2.63日志和日志,分别。当样本处理40 ppm铜和80年0.2%的乳酸和渐变,较高的微生物降低产生表面都实现。人群在生菜和西红柿表面减少3.93日志CFU /生菜片和3.39日志CFU /番茄,分别。

4所示。细菌形态

图2显示了影响铜单独或结合形态学的乳酸大肠杆菌使用SEM O157: H7。细菌细胞(大肠杆菌O157: H7)控制样品(不处理)(图2(一个)与光滑表面)显示正常杆形状。形态(形状、大小和外观)细菌细胞的变化没有不同的乳酸处理时(图2b)。相反,细胞生长在铜单独或结合乳酸(数字2 (c)和2 (d)在形状和大小)更不正常显示破坏细胞膜的完整性。事实上,这些细胞的形态学(数字2 (c)和2 (d))发现皱纹异常与众多小石洞分布在细胞表面。图3显示的大小分布直方图处理和未经处理的细胞。未经处理的细胞的平均大小(控制)和细胞治疗乳酸没有发现不同。另一方面,细胞处理铜单独或结合乳酸显示显著差异(在他们的大小)。平均细胞大小从1.44减少μ0.81米(控制)μ米当处理铜结合乳酸。

5。讨论

先前的研究表明,大肠杆菌O157: H7是涉及到几种暴发涉及酸性水果和果汁在pH值为3.427,28]。大肠杆菌O157: H7还存活在牛肉浓浆乳酸(29日),提高公差的担忧大肠杆菌O157: H7低博士因此,是非常重要的控制这些病原体的生长。我们的工作表明,治疗与铜结合乳酸表现出协同效应大肠杆菌O157: H7。也获得了类似的结果大肠杆菌O157: H7 BHI肉汤和胡萝卜汁的铜(50 ppm)和乳酸(0.2%),表明铜和乳酸显著抑制作用[12]。基于这两个研究的结果在实验室中,40 ppm铜和0.2%乳酸可以作为一个潜在的洗手液净化产生的表面。它已被证实之前,铜离子的功效在杀死微生物的使用极大地增强了乳酸。因此,使用铜结合乳酸可能是一个有效的方法来抑制病原菌产生的表面。因此,20 ppm或40 ppm铜结合0.2%乳酸可以用来控制的发展大肠杆菌O157: H7。

结果表明,治疗与二层80单独或结合铜或乳酸独自没有有效降低细菌的减少产生的表面。然而,铜和乳酸加渐变80有效数量的降低大肠杆菌O157: H7的生产样品。尽管用氯化水清洗是最广泛使用的方法灭活病原细菌表面的新鲜农产品,氯化水的功效是最小的,只能实现日志减少原生微生物群落(大约2到330.,31日]。张,法伯32]显示日志cfu / 1.7和1.2 g的减少l。monocytogenes在生菜和卷心菜处理200 ppm的氯,分别。同样,传统的鲜切香菜生产使用氯化水100 mg / L净化芫荽叶(33]。魏等。(34)报道,氯化水到200 ppm是用于减少微生物污染生产加工线。尽管氯的抗菌活性和较低的成本,不断增加的不利影响氯副产物在食品行业的关注33]。此外,氯会导致潜在的致癌和致畸的形成三卤甲烷,简单介绍酸(35]。我们的研究结果表明,40 ppm铜0.2%乳酸的渐变80明显更有效()在去除病原菌产生的表面和可能是一个更安全的选择。略大的数量大肠杆菌O157: H7比西红柿从生菜样品中恢复过来,这可能是由于不同的表面结构。二层80添加到治疗方案时,实现更高的细菌减少表面的生菜和西红柿。渐变80是一个离子表面活性剂通过美国食品和药物管理局(FDA)也通常被认为是安全的(GRAS)产品。添加渐变80年可能会增加铜的杀伤力和乳酸的解决方案通过增加溶液的表面接触微生物,从而最大化的释放病原体接种生菜和西红柿面。我们的结果在表中1和2显示5日志减少细菌数量,可以达到40 ppm铜和0.2%乳酸。这表明40 ppm铜和0.2%乳酸的结合产生了显著减少大肠杆菌O157: H7在媒体实验室实现减少5日志推荐的食品和药物管理局(36]。因此,本研究的结果建议进一步研究应该探索铜结合的抗菌效果乳酸和其他天然成分来达到最低5日志表面细菌数量减少新鲜农产品。

过去许多研究报道,各种抗菌药物细菌细胞的形态学改变。透射电子显微镜(TEM)显示大肠杆菌O157: H7细胞暴露于乳铁蛋白和溶菌酶变大,hypodense指示细菌杀死通过渗透破坏37]。在另一项研究通过TEM观察,细菌治疗精油(Eos)显示气泡的形成,凝固的细胞质成分,破坏细胞结构,缺乏胞质材料(38]。同样,SEM对细菌细胞的研究显示损伤细胞的外膜和形态变化,当处理二十碳五烯酸(EPA)和共轭亚油酸盐钾(CLA-K) [39,40]。细菌细胞暴露于香芹酚和百里香酚显示外膜的解体大肠杆菌O157: H7和沙门氏菌沙门氏菌感染。破坏细胞壁的粗糙度和缺乏细胞质已报告单核细胞增多性李斯特氏菌当处理百里香Eos (41]。Turgis et al。42]显示生理和形态变化通过电子显微镜观察大肠杆菌O157: H7和伤寒杆菌芥末EO所致,表明细菌细胞的渗透性。SEM、TEM和拉曼光谱图像表明,氧化锌纳米颗粒可能会损害细胞内的细菌细胞膜造成损失组件和最终的死亡细胞(43]。在我们目前的研究中,形态的变化大肠杆菌O157: H7由铜和乳酸的作用在某种程度上类似于观察之前的研究(39- - - - - -42]。细菌种群的研究在实验室中铜独自对抗没有任何影响大肠杆菌O157: H7。然而,仅扫描电镜研究表明,铜可以改变细胞形态,这可能被认为是抑制的初始阶段,可能会导致最终的死亡细胞。显著减少()的细胞大小与联合治疗可能是由于酸性对细胞膜渗透性的影响。这种效应对渗透率可以进一步提高铜对细菌细胞的抗菌功效。

铜和乳酸的分子机制影响抗菌活性的原因还不是很清楚。不同作者假设有机酸可能损坏外或细胞质细胞膜变性蛋白质和DNA (44,45]。Alakomi等。(25)报道,细菌细胞膜的渗透性的增加可能会加强其他抗菌药物的作用与乳酸钠laurylsulphate所示。微生物包括细菌需要铜在低浓度作为必不可少的微量元素,但是,在高浓度时,铜能引起抑制细胞生长甚至死亡的细胞(11]。Helander和Mattila-Sandholm46)发现,增加细胞壁和等离子体膜透性可以使敏感细菌的抗菌剂就无法渗透更深的细菌的目标。因此,细胞死亡的一个可能的解释可能是,这是由于膜透性的变化引起的酸的使用。有可能是乳酸permeabilized细胞膜,使铜离子进入细菌细胞,从而产生毒性作用。然而,我们的SEM研究并未显示任何类型的内在细胞膜损伤或变性的蛋白质。我们只观察到细胞的形状和大小的差异。这一发现表明,进一步研究微生物细胞内可以提供额外的了解损伤的程度和铜的作用方式和乳酸大肠杆菌O157: H7。可以使用透射电子显微镜(TEM)观察细菌超微结构的改变。此外,我们相信,这项研究是首次出版工作证明铜结合的抗菌活性乳酸溶液消毒代理。铜结合乳酸可能产生协同作用,减少了病原微生物的数量,包括大肠杆菌O157: H7,表面的生菜和西红柿。这个解决方案可能是一个潜在的净化剂新鲜农产品。总之,我们的研究在实验室中、SEM表明,铜结合乳酸具有抗菌活性对革兰氏阴性细菌等大肠杆菌O157: H7。生长抑制测量证实了细菌生长和形态变化在细胞大小从SEM观察图像显示的潜在使用铜和乳酸大肠杆菌O157: H7。因此,铜结合乳酸可能会被认为是一种有效的抗菌剂增强农业和食品安全。

确认

这个项目是由美国农业部国家食品与农业研究所孵化项目数控。x - 234 - 5 - 09 - 170 - 1在农业研究项目在北卡农业技术州立大学。作者想表达自己的感激之情的k . j . Grubar博士北卡罗来纳州t州立大学农业研究计划为他的审查和评论。部分赞助国家食品保护中心所提供的工作和国防(NCFPD)。

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