文摘

镰刀菌素耳朵疫病是一种毁灭性的真菌疾病的谷物,包括小麦和可以用各种单端孢霉烯真菌毒素污染农作物。这次调查已经产生了一个新的β葡萄糖醛酸酶(格斯)记者张力,促进植物感染的快速和简单的评估。表达的结构上gpdA:格斯紧张的镰刀菌素graminearum被用来量化整个殖民模式。组织化学和生物化学方法证实,在敏感小麦耳部感染、无症状的真菌生长的实质性阶段。独立的分析表明,有一个减少的数量在小麦耳朵感染过程中生理活性菌丝。脊柱感染的一个简化的线性系统是利用评估数的表达三由RT-qPCR基因。前沿的真菌基因表达无症状的感染与感染在脊柱的起源。这表明三基因表达是最大的前沿和支持假设的霉菌毒素deoxynivalenol有助于抑制植物防御入侵的胞间菌丝的提前。这项研究还表明,有转录真菌感染的不同阶段之间的差异,这些差异随着感染的进行维护。

1。介绍

镰刀菌素耳朵枯萎病(2月)疾病也称为镰刀菌素头痂(http://www.scabusa.org/)是一种破坏性的真菌疾病,有可能破坏小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米在收割的前几个星期。所有主要的小麦生产国(http://faostat.fao.org/)报道严重,重复2月爆发在过去的十年中,生产的影响镰刀菌素感染一个全球性问题。这世界重新被认为是受气候变化和农业实践。国际玉米和小麦改良中心形容2月全球小麦产量的主要限制因素(1]。在过去的10年中,平均2月英国麦田发生率为39% (http://www.cropmonitor.co.uk/)。镰刀菌素graminearum(teleomorph赤霉菌属菌)是一种丝状子囊菌和2月的主要病原体之一,在欧洲、亚洲和美洲(1,2]。除了产量大幅减少,粮食质量的影响通过选择性的白蛋白和面筋蛋白(3]。受感染的作物收获的谷物也受各种真菌污染真菌毒素常常使他们不适合和/或不安全的供人类食用,动物饲料,或麦芽制造目的4,5]。农民在英国支付工厂,他们的粮食加工,测试的B型单端孢霉烯霉菌毒素deoxynivalenol(唐)和确定水平低于欧盟安全指南(http://www.hgca.com/)[6]。大约每平方米一个耳朵感染的作物将是足够的粮食发现含有不被拒绝。

在开花期,花药自然分割释放花粉,它提供了一个开放的病原体进入小麦植株。花药挤压也暴露了较弱的花括号的内表面,可直接渗透(7]。启动疾病周期,子囊孢子和无性分生孢子雨溅或风力分散,到植物组织的小麦作物8]。因此,流行对小麦发生在温暖和潮湿的天气条件配合开花。感染的小花在每个小穗然后发生(9- - - - - -11]。一旦在小穗的小穗轴,真菌菌丝进步生活小麦细胞之间的细胞间隙。宏观上,小麦耳组织殖民似乎没有症状(12]。在感染的早期阶段,这无症状的发展代表了大多数殖民组织。植物细胞然后死之前或同时,细胞内病原体殖民的开始,这种植物细胞死亡伴随着外部可见疾病的症状出现在小麦的耳朵(12]。后阶段的感染,ascogenous菌丝形成小麦细胞表面之下层准备以后perithecial形成(13]。

f . graminearum产生一系列sesquiterpenoid真菌毒素包括一些B型单端孢霉烯,并和其乙酰化衍生品等15 DON和3 DON,所需的完整的毒性对小麦的耳朵(14- - - - - -16]。并抑制蛋白质合成的起始和延伸的真核生物和防止多肽链绑定到60年代核糖体亚基(17]。第一个单端孢霉烯生物合成的关键步骤是通过转换trichodiene焦磷酸,trichodiene合酶是催化的酶编码的TRI5基因。的角色也在致病性检测通过的施工和使用non-DON生产tri5基因有缺陷的突变体。没有霉菌毒素在小麦生产耳朵感染导致一个增强植物防御反应的形式植物细胞壁增厚,阻碍脊柱殖民(9]。然而,不也被卷入一些小麦防御反应的激活,包括过氧化氢生产和程序性细胞死亡可能援助殖民(18]。

无症状的感染的识别和评价小麦的耳朵通过光和电子显微镜是费时和昂贵的12]。在这项研究中,我们创建了一个转基因f . graminearum记者紧张,表达了β葡萄糖醛酸酶酶(格斯)由本构3磷酸甘油醛脱氢酶启动子曲霉属真菌nidulans(gpdA)[19]。这个记者应变使无症状的感染的快速评估整个真菌菌落的耳朵。然后,我们探索了不同的表达镰刀菌素三基因在野生型感染的早期没有症状和症状阶段反向transcriptase-quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)分析。这次调查的感染易感小麦基因型的f . graminearum(1)相关的真菌RNA在细胞水平上观察真菌定殖;(2)比较前沿的真菌基因表达无症状的感染的起源在脊柱感染;(3)透露,数的表达三基因是最大的前沿;(4)显示的中心镰刀菌素殖民地在小麦的耳朵只有最小的生理活性菌丝。总的来说,这项研究表明,有不同的阶段镰刀菌素发展中小麦的耳内感染和维护这些阶段感染所得。

2。结果

2.1。转换后的本构GUS表达菌株展品野生型表型

文章共转化在体外比色格斯化验证实,38%的选择抗潮霉素的转化株也包含了gpdA:格斯记者构造(数据未显示)。转化株,演示了一个稳定的高水平的格斯活动当种植马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)肉汤被使用定量4-methylumbelliferyl——确定β-D-glucuronide(杯子)测定。转化株G3产生1153 nmolμ分钟⁻¹毫克的蛋白质⁻¹性病±165 nmol分钟⁻¹使用标准的试验条件。这转化株显示野生型增长率最小(SNA)和丰富的媒体和野生型(PDB)无性和有性孢子形成后增长近紫外线/白光下的系统网络体系结构(SNA)或胡萝卜琼脂。测量平均浓度增长后由ELISA不要诱导玉米粉琼脂显示不生产是不变的(PH-1 (1.6 ppm), G3 (1.5 ppm),方差分析(方差分析)和费舍尔F以及())。

2.2。本构格斯应变显示野生型致病性

产生的高水平的GUS G3应变允许感染过程,其次是解剖和组织化学染色后接种(dpi) 8 - 12天。宏观GUS染色的特异性是证实本土化的真菌菌丝(参见图1在网上补充材料补充doi: 10.4061 / 2011/626345)。8点染色dpi透露菌丝殖民以外的疾病症状(图可见1)。到12 dpi,菌丝生长在整个脊柱接种以下小穗和花梗(图1)。

荧光杯试验更敏感的方法来量化真菌感染。小麦的耳朵感染的程度在个体之间存在着显著的差异,通常由2小穗白天8和4小穗白天16。随后,耳朵代表分别进行了评估,提出了这些结果。对小麦小穗的耳朵都是单独评估8和16 dpi(图2)。结合组织化学染色,大量的无症状的殖民不断先进感染整个小麦耳朵,相对于耳可见疾病的进展。杯试验也证实,一些严重的漂白的小穗对耳朵的小费一般在感染后期缺乏GUS活性,因此一直未感染。有趣的是,有时候个人的小穗完全耳朵出现健康的疾病。例如,在16 dpi,一个小穗(没有。12)否则严重病变耳的开发没有宏观疾病症状。杯子化验证实小穗12是免费的真菌感染,并演示了系统的可靠性监控准确感染的进展。无病小穗被确定在几个接种的耳朵和耳朵可以位于任何位置。也指出,整体有一个15倍减少总格斯活动8 - 16在耳朵的小穗dpi(表1)。确定这是由活性真菌生物量的减少造成的,重新分配资源,积极发展地区的殖民地感染过程,进行了详细的微观分析受感染的耳朵。这表明菌丝细胞内容确实失去了时间点,12 dpi(图3),占格斯活动的减少。

2.3。真菌的菌丝在细胞水平上的识别与检测f . graminearum核糖核酸

殖民脊柱代表一个简化的线性系统的监测和定量感染导致的发展顺序的小穗成为殖民。在脊柱节间、菌丝主要生长在一个方向,使准确的隔离感染的前沿。四个脊柱接种小穗下节间在5 dpi决定切除的程度宏观可见的症状(图4)。疾病症状的出现,在切除脊柱节间(RI),也在细胞水平上评估(补充图2),未发现菌丝在RI-4接种的节间的最远的点。活动前感染中确定RI-3和由一个低数量的皮层细胞胞间菌丝与生活。RI-2拥有更多的比RI-3胞间菌丝,周围的植物细胞。最接近接种,节间RI-1,脊柱感染开始,包含国际和胞内菌丝。植物的皮层细胞和血管的中心元素脊柱节间细胞殖民和死亡。然而,受感染的细胞类型包围住厚壁组织和表皮细胞,占宏观上的轻微的外观可见在这5点节间dpi疾病症状。

总RNA提取15汇集脊柱节间(补充图3和图4)和post DNAase治疗使用PCR分析基因间的引物设计只放大基因组DNA (gDNA)。这些检查确认没有DNA污染(补充图4)。在下面的前三个脊柱节间接种,真菌RNA被确定通过逆转录定量PCR (rt - PCR)使用管家基因的引物γ肌动蛋白和β微管蛋白(见下文)。这个结果与相关的观察菌丝的感染在细胞水平上。

2.4。三基因表达调节的活跃菌丝的面前无症状的感染

五镰刀菌素基因的三集群,即TRI4,TRI5,TRI6,TRI9,TRI14以及两个管家基因,γ肌动蛋白和β微管蛋白,被选为分析(补充表1)。三基因被实时定量PCR筛选(RT-qPCR)转录丰度的变化和正常化真菌生物量在三殖民脊柱节间dpi 5点。这些三基因选择由于他们参与发病机理,和霉菌毒素的生产(4,14,15,20.- - - - - -22]。7 dpi,六个殖民脊柱从每个小麦节间被采样的耳朵,而只专注于分析的表达Tri4,Tri5和两个管家基因。

15汇集耳朵的初步分析显示,在5 dpi,所有5个的记录三基因检测到的最高水平在活跃的虫菌感染和减少前面的距离前沿感染的增加(图5(一个))。所有的三基因显示大于双重RI-3中丰度的变化(无症状的感染前)相比RI-1(疾病的发病症状,脊柱感染)的起源。TRI5表达很低在RI-1急剧增长了11.90倍,表现出丰富RI-1和促进菌丝的前线,RI-3组织,达到适度表达水平(表2)。TRI4,TRI9,TRI14表达显著高于TRI5在RI-1,同时他们的表达水平增加在RI-3更温和。有趣的是,表达的相对水平TRI6远远低于其他四个吗三基因,即TRI4,TRI5,TRI9,TRI14,在所有脊柱节间。

后来7 dpi详细时间点进行了研究,包括45耳朵(3池15耳朵)。选择这个时间点决定是否升高三基因表达在感染的前沿是保留在感染的进展。7点dpi,前两个脊柱节间(RI-1和RI-2)代表完全感染症状,以下两个港口(RI-3和RI-4)疾病的发病症状,而最后两个殖民节间(RI-5和RI-6)代表无症状的感染。的三基因显示的最高水平和表达,最大的变化在5 dpi,选择进行进一步分析。的表达TRI4和TRI5,相对于真菌生物量,再次在无症状的感染(表2)。在完全有症状的植物组织内,三基因表达是非常低的。真菌生物量表现出的数量成反比关系三基因表达(图5 (b);补充图5)。

3所示。讨论

3.1。记者应变跟踪的有效性镰刀菌素graminearum感染

我们的目标是创造一个f . graminearum记者应变,将简化的量化的发展在整个耳朵感染。格斯记者应变野生型增长,致病性和毒枝菌素的生产。在足底实验证实,本构GUS表达应变可以用来量化真菌生物量在症状——和symptomless-infected小麦组织。组织化学和生化分析验证的存在没有症状的实质性阶段增长的疾病症状,如前所述,布朗et al。12]。因此,在这种互动中,有一个相当大的组织之间的潜伏期感染和宏观上的发展明显的症状。这些研究还表明,一个小穗(s)在耳朵的顶端和其他地方可以不被感染,即使耳朵是否则严重病变。脾组织的组织化学和显微镜分析确认中检测到GUS活性镰刀菌素菌丝。的分析镰刀菌素使用本构GUS表达菌株感染过程显示相当大的减少GUS活性在感染后期时间点,这被认为是造成的,在某种程度上,减少生理活性菌丝。目前未知什么触发的增加大量的“鬼”菌丝在感染的后期小麦基因型的敏感。在宿主-病原体相互作用,各种其他兼容交互已经使用真菌转化株,包含了定量分析gpdA:格斯记者构造,稳步增加的水平检测杯活动在时间进程通常被报道。例如,在番茄叶片之间的相互作用和细胞间活体营养生长枝孢属fulvum(最近更名为Passalora叶),100倍增加检测观察杯活动在12天的时间发病前孢子形成(23]。最后的发展阶段镰刀菌素小麦耳朵感染过程是孢子形成和资源的再分配领域的孢子形成可能集中活动,这些地区的殖民地。

在镰刀菌素-小麦花互动,几个主要数量性状位点(QTL)定位产生抗性已确定(24]。使用这个新f . graminearum格斯记者应变和现有near-isogenic种质,可以评估、定量、生物量积累动力学与状态/缺乏相关的QTL在不同小麦背景。这应该显示的各种基因源是否1型或2型阻力损失的速率可行的不同影响镰刀菌素菌丝。本构GUS表达转化株可能是特别有用的在这方面,因为它的使用应该简化识别爆发“鬼”菌丝的形成和/或减少真菌生物量授予不同的法时出现在各种小麦背景。也,染色整个小麦的耳朵,然后垂直切片想象整个内部感染过程使用光学显微镜(图1)将极大地帮助小麦种质资源的评价无症状的感染的程度相比,宏观上可见疾病症状。这个相对快速过程可以用来消除线路支持主要是无症状的感染。总的来说,格斯记者压力提供了一个更高的吞吐量系统准确地量化生理活性感染容易组织化学和生物化学手段,而另一种荧光记者蛋白质需要使用共焦显微镜和更高层次的培训。

3.2。霉菌毒素生产在感染的早期阶段

早期感染过程探讨了进一步使用简化的线性脊柱节间系统和RT-qPCR来确定不同的表达镰刀菌素霉菌毒素生产所需的基因。三基因表达被发现最大的菌丝的前5和7天小穗接种。这表明霉菌毒素诱导模式是保持的菌丝的进步通过新殖民小麦组织没有症状。除了upregulation的单端孢霉烯生物合成的基因(TRI4,TRI5,TRI9),这些定量分析还揭示了高架转录的三调节基因TRI6和TRI14在感染的前沿。删除的TRI6基因编码的一种转录因子,会使超过200个基因,包括大多数三基因和许多来自前面的类异戊二烯途径,从而减少不生产和致病性(22]。有趣的是,f . graminearum TRI14删除应变了野生型不生产在体外虽然失去了产生根本的能力在足底导致减少致病性(21]。这些结果暗示的结合TRI6和TRI14监管的三基因是必不可少的生产小麦耳部感染和发病机制建立没有症状。表达式的所有三基因是最小的小麦组织内大量的症状镰刀菌素菌丝与植物细胞死亡有关。这表明,对于这个阶段的感染过程,也生产不需要或组织已经包含了相当大的,因为早期的殖民。

霉菌毒素,不,,由其乙酰化衍生品f . graminearum敏感小麦感染期间,被证明是必不可少的感染扩散的超出了接种小穗(15]。小麦品种美洲鹑和测序f . graminearum应变PH-1 [25),这个结果已经验证(16]。没有不生产,无症状的感染是输了,小麦植株能够放下防御屏障,就像一个棕色的圆环绕在病变(16]。生产不可能因此抑制植物细胞的防御反应入侵附近的菌丝,最小化各种细胞壁加固过程的开始9)通过阻止蛋白质合成(17]。这一战略将协助镰刀菌素感染。事实上,之前详细的微观分析揭示最小变化的外观小麦推进DON-producing周围皮层细胞镰刀菌素菌丝(12]。不生产相对统一整个植物组织在感染的早期阶段,数量有限的胞间菌丝在积极推进面前无症状的感染需要产生一个更高的每真菌细胞相比,真菌细胞数量的不深入的殖民地真菌细胞活植物细胞的比例是持续走高。因此,一旦植物细胞死亡,并生产将不再是必需的。

4所示。实验程序

4.1。真菌菌株,媒体,和文化

的f . graminearum野生型菌株PH-1使用在这个调查。系统网络体系结构(SNA)真菌总是培养(合成营养价值琼脂)包含0.1% KH板块₂阿宝₄,0.1%的人知道₃,0.1% MgSO₄×7 h₂O,氯化钾0.05%,葡萄糖0.02%,蔗糖0.02%,2%的琼脂。板在室温和孵化在恒照明从一个近紫外线管(菲利普斯TLD 36 w / 08)和一个白色的光管(菲利普斯TLD 36 w / 830高频)。储存在土壤股−80°C。删除旧的分生孢子和产生新的分生孢子形成,10天的旧系统网络体系结构(SNA)盘子洗的叠加TB3(细菌蛋白胨酵母提取物0.3%,0.3%,和20%蔗糖)。24小时后,分生孢子的悬挂在无菌水提取,过滤miracloth (Calbiochem),然后调整浓度用无菌水/毫升。

4.2。小麦品种、生长的植物和植物接种

敏感小麦(小麦美洲鹑)品种,作为寄主植物在这个调查。植物在温室长大的(如前所述)(26]。第一次出现的花药挤压,5μL的/毫升无性孢子的悬架是放在花空腔的内稃和引理外两个小花中间的耳朵。控制植物接种无菌水。接种植物在潮湿的孵化室72 h的第一个24小时都在黑暗中。接种植物被保存在温室环境湿度。

4.3。生产的f . graminearum本构格斯记者应变

两个质粒被用来创建一个转基因的f . graminearum应变PH-1持续表达GUS的酶。第一,pNOM102、港口GUS基因大肠杆菌(uidA)的控制下gpdA启动子的曲霉属真菌nidulans(19]。第二,pHyg1.4含有潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的控制下trpC启动子。pHyg1.4的质粒是由切断1.4 kb下丘脑-垂体-肾上腺轴的我从pCB1004片段(27到pBluescript II-SK + (Stratagene)削减生态房车。质粒pNOM102和pHyg1.4使直线化欣DIII和Bam嗨,分别在cotransformed成PH-1原生质体后协议所描述的城市et al。28]。真菌转化株受到两轮选择最小的媒体板块(SNA)含有潮霉素(75μg / mL)然后单孢子。

稳定GUS表达转化株被检查为野生型增长率最小和营养丰富的琼脂(SNA和PDB)和无性和有性孢子产量(分生孢子、子囊壳)增长在近紫外和白光的混合物在系统网络体系结构(SNA)或胡萝卜琼脂(如前所述)(26,29日]。小麦耳朵感染分析被用来测定转化株的毒力和野生型PH-1祖应变(28]。并选择转化株的生产水平与亲本菌株相比PH-1由各应变增长一式三份的盘子上玉米粉琼脂(20 g / L玉米面粉,20 g / L琼脂)在高湿度为14天在孵化器28°C。deoxynivalenol(唐)浓度是量化利用r-biopharm RIDASCREEN快速酶联免疫试剂盒不遵循制造商的协议。选择的转化株G3。

4.4。真菌生物量评估通过X-gluc组织化学染色和杯子荧光测定

小麦的耳朵感染了既定的GUS表达菌株纵向与手术刀解剖和被淹没在50 mM Na₂HPO₄/不₂阿宝₄缓冲(pH值7)解决方案含0.5毫克/毫升X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic酸,cyclohexylammonium)(英国σ),特里同x - 100 0.05%, 1毫米K₃[Fe (CN)₆),1毫米K₄[Fe (CNo .淹没的耳朵在室温下真空渗透1 h,然后孵化在37°C 4 h。彩色耳清除了在70%的乙醇30.]。

三个小麦耳朵感染本构GUS表达或野生型病毒疾病症状得分,然后解剖。个人的小穗与钢铁珠子500毫升GUS NaHPO提取缓冲(50毫米₄二硫苏糖醇(pH值7),10毫米,1毫米EDTA (pH值8),0.1%月桂醇肌氨酸钠盐,0.1% Triton x使用Retsch混合器厂200 - 100)。离心后的上层清液收集在10000 rpm(5分钟);随后,50μL是由杰斐逊用于描述的杯试验(30.]。

4.5。准备个人组织的光学显微镜的小麦的耳朵

选择接种小麦耳朵抽样前拍摄。连续脊柱节间接种点下面分别成像在徕卡立体显微镜之前被切除。组织样本分别固定16 h和4%多聚甲醛(σ)2.5%戊二醛(σ)0.1索伦森的磷酸盐缓冲剂(不₂阿宝₄:Na₂HPO₄,pH值7.2)然后洗3 x 0.05索伦森的缓冲和用无菌水一次。样本随后分级乙醇系列脱水中,嵌入在硬年级LR白色(TAAB)和聚合60°C的24小时(31日]。

横向半薄1μ米部分是用玻璃刀切割的超微切片机(Reichert-Jung Ultracut)。部分收集玻璃幻灯片和干上一套热板在40°C。与水0.1%甲苯胺蓝染色后O(31)四硼酸钠pH值9 1%,部分是安装在DPX(σ),然后检查使用蔡司Axiophot光学显微镜成像。在这项研究中介绍的图片代表的三个生物复制为每个实验进行。

4.6。提取的RNA从脊柱节间

四、七叶轴节间(相对于下面的dpi收获时)的接种小穗每只耳朵都有单独的液氮切除和冷冻5 dpi和7 dpi。目视检查后,总共15个具有代表性的小麦为每个治疗耳朵被解剖,mock-inoculated或f . graminearum来华,节间段收集。在液氮冻干样本用杵和臼。总RNA提取使用试剂盒试剂(英杰公司)与制造商的指令进行小的修改。总RNA沉淀−20°C 16 h与8 M氯化锂。纯化RNA被吸光度在260 nm量化。

4.7。定量RT-qPCR基因表达分析

总RNA与DNA -治疗免费的^TM工具包(Ambion)去除污染DNA和缺乏基因组DNA PCR证实了使用基因间的引物。互补脱氧核糖核酸合成了1μ总RNA的g使用500 ng Oligo-dT底漆和200 U上标III(英杰公司)根据制造商的指示。RT-qPCR进行实时PCR系统7500(应用生物系统公司)。使用的感觉和反义引物补充表1中给出。gDNA的标准曲线与已知浓度从25 ng为每一对引物0.025 ng成立。合成互补脱氧核糖核酸在无菌稀释1/50 H₂o .最后一卷的PCR分析20μL和由10μL(启动Taq准备混合加火箭(表达载体),5μL的1.2μM的底漆,5μL相关核酸模板。热循环条件如下:[95°C 2分钟(95°C 15秒,62°C 20秒,72°C 45秒)×40]。解离曲线如下:[95°C 15秒,60°C 1分钟,95°C 15秒)×1。每个样本的平均周期阈值计算的技术复制一式三份。真菌看家基因γ肌动蛋白和β微管蛋白是正常化RT-qPCR数据用于真菌生物量。

确认

所有实验中f . graminearum隔离PH-1,转基因记者进行了应变在生物学屏障设施得到执照号码PHL 174 g / 6222。h·陈是由六个月访问中国政府提供的奖学金。p·w·c·Carion由英国社会支持对植物病理学(BSPP)夏季奖学金。f . Massot花了四个月在洛桑进行最后一年的研究项目从Agrocampus西部省,法国雷恩。n .布朗要感谢Drs。Rohan劳和梅勒妮Jubault建议成立RT-qPCR实验。洛桑研究接收受补助的生物技术和生物科学研究委员会的支持(BBSRC)的英国。这项工作是欧盟外交政策的一部分,6综合项目Bioexploit (ct - 2005 - 513959)。NB和结核病都由BBSRC工业案例与先正达的人数。n a·布朗和c·巴斯本研究同样起到了推波助澜的作用。

补充材料