文摘
四十株h . fennelliae从儿科血液和粪便样本收集在一个18年在儿童医院在开普敦,南非,被PCR 16 s rRNA的放大。两个不同的基因型h . fennelliae确定了基于系统发育分析。这是经测序部分RNA聚合酶(rpoB)的β亚基基因。所有隔离从南非集群与提议的小说幽门螺杆菌应变(加入AF237612)孤立在澳大利亚,而三h . fennelliae型菌株从北半球国家反恐怖主义中心的11612年,液化沼气7546年和18820年CCUG,形成一个独立的分支。大(355个基点)高度保守的序列(IVS)干预16 s rRNA被发现在所有隔离。二级结构预测的静脉注射16 s rRNA和23 s rRNA的特点是主茎的结构由碱基配对形成3′,5′末端和内部循环和茎。这个最大的进行系统发育分析h . fennelliae。南非h . fennelliae隔离是密切相关的一个澳大利亚隔离之前报道可能的幽门螺杆菌的新物种。这项研究表明,后者是紧张的h . fennelliae。
1。介绍
自从发现了幽门螺杆菌(幽门螺旋杆菌沃伦和马歇尔于1983年)(1),30多个非pylori-Helicobacter描述了物种(2,3]。到目前为止,h . bizzozeronnii canadensi年代,h .犬属h . cinaedi h . fennelliae h .猫属heilmannii,h . pullorum h .芜菁h . salomonis h . winghamensis和h . westmeadii都已经在人体中被发现与胃炎、肠炎、败血症(3- - - - - -8]。h . fennelliae在1985年第一次描述了作为一个新的吗弯曲杆菌物种隔离与肠炎和直肠炎(无症状的男同性恋者9]。这种生物随后被重新归类为一个幽门螺杆菌基于23 s rRNA杂交物种研究[10]。h . fennelliae是一个挑剔的有机体,很难文化;因此,很少有报道的临床相关性的有机体。2000年,三通等。11描述了一种新颖的幽门螺杆菌孤立的血一个年轻原住民儿童腹泻和呕吐是最密切相关h . fennelliae。作者提出,这可能是一个新物种幽门螺杆菌。
从1977年到1990年,常规微生物实验室在红十字会战争纪念碑儿童和Groote Schuur医院在开普敦,南非使用各种antibiotic-containing媒体板块和标准微量需氧的大气隔离的生长条件弯曲杆菌和其他Epsilonproteobacteria。h . fennelliae和其他考究H2要求和antibiotic-sensitiveEpsilonproteobacteria从来不是孤立在这些条件下(12]。通过引入“开普敦协议”,一个隔离的方法,使用膜过滤到不需抗生素的盘子和随后的孵化的H2纯度的浓缩铀的微量需氧的气氛,h . fennelliae和其他挑剔的Epsilonproteobacteria是,还经常与儿科凳子和血培养在开普敦12]。在调查的18年中,因为这个协议的引入1990年10月,h . fennelliae被孤立的从5.6%(347/6249)从腹泻患儿粪便样本8]。此外,h . fennelliae独立于15/174(8.6%)的儿科血培养阴性样品吗弯曲杆菌或其他Helicobacter的物种。这是发人深省的事实h . fennelliae可能是一个重要的病原体和可能大大低估了由于不适当的隔离方法(12]。
表型和生化测试通常用来识别细菌分离株在临床设置。然而,这些化验有局限性,因此测序和系统发育分析的16 s rRNA常常利用识别新的隔离。
大量的访问h . fennelliae从开普敦隔离提供了机会来看看这些分离株的遗传多样性和比较基因库数据库中可用的数据。16 s rRNA, RNA聚合酶B亚基的一部分(rpoB)基因进行了分析。
2。材料和方法
2.1。细菌污渍
四十岁以前的特征h . fennelliae从儿科收集粪便和血液样本在18年期间,从1990年至2008年,在本研究进行分析。描述了使用标准的表型和生化方法(12]。临床数据如表所示1。的h . fennelliae参考压力,11612年国家反恐怖主义中心的,也包括在内。
2.2。DNA提取
DNA提取使用CTAB方法(13]或沸腾的方法。短暂,微磁保持在−80°C被删除和添加到100μl的蒸馏水。珠子被煮5分钟,上层清液用于PCR反应。
2.3。PCR扩增
16 s rRNA是放大使用引物设计的元帅et al。14]。最初的一部分rpoB基因与引物设计的放大Lim et al。15]。提高系统分辨率,额外的反义引物(5′TTGCATCATCATGCTCC)放大一个更大的地区(704个基点)设计,基于序列数据Kuhnert和Burnens [16]。两毫升中提取DNA或boilate添加到50μl PCR混合组成的2 U Super-therm聚合酶,1 x PCR反应缓冲区,1.5毫米MgCl2(JMR控股、肯特、英国),200年μ每个核苷酸的M(罗氏生化药剂,曼海姆,德国)。循环条件1周期95°C 2分钟,40 95°C的周期15秒,52°C 25秒,72°C 35秒之后,最后一个交汇处扩展周期在72°C。PCR产物进行分析2%琼脂糖凝胶电泳和紫外辐照和溴化乙锭染色后呈现。
2.4。测序和系统发育分析
16 s rRNA的PCR产物和rpoB基因纯化试剂盒、希尔登,德国和测序直接使用BigDye终结者ver1.1商业工具(美国应用生物系统公司,CA)。的核苷酸序列与已知序列使用CLUSTAL-X软件(从基因库17]。使用Treecon neighbour-joining系统发育树构建软件(版本1、3 b)与500引导重采样18]。
2.5。静脉注射二级结构
二级结构的16 s rRNA干预(IVS)序列h . fennelliae自由能最低的预测使用mfold版本3.2 (19,20.]。一种静脉注射也被发现的23 s rRNAh . fennelliae隔离CCUG 18820(加入AY596237)21,比较的静脉注射23 s rRNA, 16 s rRNA。
2.6。加入数据
16 s rRNA的加入数字序列h . fennelliae本研究从GQ867137-GQ867176。rpoB序列加入数字GQ867083-GQ867136。
3所示。结果
3.1。PCR检测
所有40的16 s rRNA隔离h . fennelliae成功放大,产生1340 bp的产品。这是更大的比其他幽门螺杆菌物种由于静脉注射的存在h . fennelliae。具有代表性的16 s rRNA PCR产品放大不同幽门螺杆菌临床分离株(图所示1(一))。rpoB基因从32/40(80%)隔离放大,用一些示例(图所示1 (b))。
(一)
(b)
3.2。临床信息
临床和人口数据如表所示1。的平均年龄40岁的孩子谁h . fennelliae是孤立的14个月(范围:1个月)。男:女比例是相似的,1.0:1.1。大多数的孩子出现腹泻的症状(31/40,77.5%)。h . fennelliae从5例血培养分离;2儿童肺炎、腹泻,有一例meningococcaemia。这些孩子的免疫状况还不清楚。双重感染其他肠道微生物在21个样品(52.5%)被发现的多数(19/21,90%)弯曲杆菌物种,在2个样品志贺氏杆菌和贾第虫属物种被发现。在剩下的19个样品,h . fennelliae是唯一的生物培养。样品没有筛查病毒性肠道病原体。
3.3。系统发育分析
序列分析证实了识别h . fennelliae隔离。16 s rRNA系统发育树扎根了空肠弯曲杆菌无性系种群。空肠(加入NC_002163)和显示两个不同的分支H。fennelliae。从南非隔离所有分支和一个澳大利亚人幽门螺杆菌应变(加入AF237612),而从欧洲和美国形成一个独立的分支的引导价值100%(图2(一个))。没有该分支模式使用小rpoB PCR片段(数据未显示),但数量有限的h . fennelliae样品(),更大的片段被成功放大,南非的分离从其他菌株分离观察(图2 (b))。单核苷酸变化(C-T)的位置295 16 s rRNA分化的菌株类型国家反恐怖主义中心的11612年,液化沼气7546和18820 CCUG南非隔离。283.94 16 s rRNA序列的分离,尽管集群与南非h . fennelliae隔离,有57个基点的地区(1039 - 1096元),10个核苷酸的变化。爆炸序列分析显示,最近的同源性(97%)的16 s rRNA弯曲杆菌hyointestinalis无性系种群。lawsonii(加入AB301965数量)。h . fennelliae孤立的从血液中不单独集群粪便样本(图2(一个))。南非的种内的变异株h . fennelliae为0.1 -0.6%,而南非和3型菌株为0.7 -0.9%。
(一)
(b)
3.4。干预序列
所有h . fennelliae隔离包含355个基点的静脉注射。DNA序列插入到175(基于核苷酸位置幽门螺旋杆菌模式菌株国家反恐怖主义中心的11637年,加入数字Z25741)。静脉注射序列是相同的菌株类型国家反恐怖主义中心的11612年,液化沼气7546年和18820年CCUG除了隔离327 - 92,249 - 92,355 - 93,274 - 94,334 - 94。这5个隔离C-T过渡在307位置。该地区是一个t丰富的核苷酸组成(64.5%)。爆炸分析表明,122个基点的静脉注射高相似度的23 s rRNA的79%和77%h .犬属国家反恐怖主义中心的12743和幽门螺杆菌sp。麻省理工学院01 - 5592 b,分别有相反的极性。此外,有70个基点的地区显示显著的同源性(90%)h . mesocricetorum写明ATCC 700931。没有指出开放阅读框架。
16 s rRNA静脉注射的二级结构预测构造见图3(一个)−166.3千卡的自由能。摩尔在37°C。没有找到理想的结构。5′和3′末端的16 s rRNA静脉注射补充导致24 bp杆结构。271年英国石油公司23 s rRNA的静脉注射h . fennelliaeCCUG 18820有一个类似bp茎结构(图213 (b))。区域之间的相同(bp) 26日两个静脉注射序列(盒装区域图3)。
(一)
(b)
4所示。讨论
本研究确定了2个不同的基因型h . fennelliae基于16 s rRNA和rpoB基因的系统发育分析。所有隔离从南非的集群幽门螺杆菌应变AF237612孤立的三通等。11),而从北半球3隔离,国家反恐怖主义中心的11612年,液化沼气7546年,18820年CCUG,形成一个独立的分支与引导价值的100%。三通等。11]提出,他们的小说幽门螺杆菌压力可能是一个新物种基于16 s rRNA序列分析和序列相似度≤97%h . fennelliaeCCUG 18820(加入M88154)22]。我们的分析的序列不支持这一观点。这些观测结果之间的差异可能是由于一个事实,即原始M88154序列,存入1993年由Dewhirst基因库和贴纸23),随后在2004年由同一作者所取代。这是论文后三通等人于2000年出版。在前面M88154序列,没有现在的静脉注射。我们的研究结果表明,幽门螺杆菌应变AF237612可能是一个h . fennelliae物种。
看家基因的测序,rpoB,越来越被用于确认16 s rRNA-generated系统发育树和识别细菌和密切相关的物种在临床设置(24]。这个基因的分类解析是3倍以上16 s rRNA的许多不同的细菌,包括弧菌,杆菌,和假单胞菌(25- - - - - -27]。在这项研究的系统发育分析大rpoB片段证实的分离h . fennelliae分离成2基因型。
干预变量序列长度和序列可以在找到小(16 s rRNA)和大亚基很多细菌的核糖体RNA (23 s rRNA) (28]。这些茎环结构二级结构形成稳定28]。静脉注射的描述Campylobacter (c .杆菌c . curvus胎儿c, c . helveticus c . hyointestinalis空肠c, c . sputorum c .腹直肌和海欧,),幽门螺杆菌(h .胆汁,h .犬属,h . fennelliae h . mustelae和h . muridarum)物种(29日- - - - - -37]。静脉注射发现的16 s rRNAh . fennelliae隔离检查在本研究中是高度保守的。这个地区的t丰富自然也是保存(28]。C-T过渡指出在5隔离并没有改变静脉注射的二级结构(数据没有显示)。虽然静脉注射的23 s rRNA小于16 s rRNA,同源性表明可能有一个地区的共同祖先元素。的二级结构预测23 s rRNA, 16 s rRNA包含21 bp和24 bp形成的茎,分别由5′和3′反向重复。这些可以作为识别网站切除的核糖核酸酶III在rRNA成熟(28,34]。
大多数幽门螺杆菌物种引起腹泻也可以从血液中分离(6]。h . fennelliae是很少报道引起菌血症,这可能部分是由于挑剔的大自然的生物11,36,38- - - - - -40]。在这项研究中5的15h . fennelliae菌株分离血液检查。没有序列之间的差异h . fennelliae菌株分离血液或粪便样本。
总之,这个分子系统发育研究是最大的h . fennelliae结果表明2基因型的存在。南非隔离更密切相关的澳大利亚幽门螺杆菌应变,可能h . fennelliae物种,孤立的三通等。11比3型菌株。
承认
这项工作是由一个奖项(436194)从健康科学学院研究委员会,开普敦大学。