文摘
众所周知,怀孕与频繁的胃肠道(GI)疾病和症状。此外,之前的报告表明,雌激素水平在怀孕期间的变化,参与调节胃肠道能动性和参与各种功能障碍的发病机制的腹部。当前研究的目的是探讨雌激素受体的表达变化(ERs)和检查雌激素对一氧化氮的影响——(没有)环鸟苷酸(cGMP)通路,从而放松在胃平滑肌细胞(GSMC)怀孕期间。单一GSMC抗早孕和late-pregnant Sprague-Dawley老鼠。蛋白质和信使rna表达水平的人测量通过专门设计的酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR),分别。没有和cGMP水平通过专门设计的ELISA试剂盒测定。雌激素对乙酰胆碱的影响(ACh)诱导单收缩GSMC测量通过扫描测微法的存在与否没有合酶抑制剂,N-nitro-L-arginine (L-NNA)或guanylyl环化酶抑制剂,1 h - (1、2、4) oxadiazolo [4 3 - a] quinoxalin-1-one (ODQ)。雌激素的增加没有和cGMP水平和他们的水平都在怀孕早期与晚期。表达的人是更大的在怀孕早期与晚期。乙酰胆碱诱导的收缩GSMC年底怀孕而怀孕早期。雌激素抑制ACh-induced收缩在这两个时期的怀孕。重要的是,预处理GSMC L-NNA或ODQ废除雌激素抑制作用在肌肉收缩。总之,GSMC收缩行为经历翻天覆地的变化以应对孕期雌激素,这也许可以解释一些乳胃紊乱。
1。介绍
各种胃肠道疾病通常报道和遇到的问题在正常怀孕和怀孕期是最常见的症状之一(1]。例如,怀孕通常伴有恶心、呕吐、胃排空障碍的不同程度,不同程度的便秘造成减少结肠收缩活动(2- - - - - -4]。支持中断胃肠道平滑肌肌和运动行为在怀孕期间,孕妇先前的研究报告降低了胆囊收缩活动(5,6)和食管括约肌压力(7- - - - - -9),延迟胃排空(10,11),并降低小肠(12和结肠运输13]。
怀孕的特征是提高循环类固醇激素的水平,即雌激素和孕激素,增加促进孕龄(14,15]。这些激素扮演中心角色在维持妊娠和分娩的启动调节子宫肌层的收缩性和兴奋性。此外,最近的研究表明,雌激素和孕激素目标其他光滑的实力让身体器官,除了子宫肌层,如胃肠道、膀胱和血管16]。
雌激素调节基因表达在estrogen-targeted组织通过绑定两个总科的成员之一的类固醇激素核受体,雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)[17]。这两种亚型的人被单独编码基因(18,19]。表达他们单独或一起在身体的几个不同的组织包括女性生殖系统、脉管系统、胃肠道(19- - - - - -21]。雌激素还发现诱导一些快速信号事件或nongenomic事件在不同的细胞类型给予强大的功能性证据表面膜人队(gp)也参与雌激素的快速放松效应(22]。
雌激素被报道产生松弛平滑肌的胆囊23),气管(24),膀胱(25],血管[26),和结肠(27,28]。此外,雌激素诱导血管平滑肌的松弛过程,涉及NO-cGMP通路的激活(29日]。最重要的是,我们最近报道雌激素,progesterone-induced放松NO-cGMP胃平滑肌细胞通过激活的途径(30.,31日]。
平滑肌生理上是一个关键球员在开发和维护胃肠道正常的运动行为。平滑肌进行收缩和放松针对磷酸化和去磷酸化的20-kDa监管肌球蛋白轻链(多层陶瓷20.),分别32,33]。环腺苷酸(营)和环鸟苷酸(cGMP)产生的关键分子在GSMC最轻松代理(33]。这些放松分子激活两个重要的下游激酶,cAMP-activated蛋白激酶A (PKA)和cGMP-activated蛋白激酶G (PKG),导致平滑肌松弛的针对各种蛋白质和酶的放松途径GSMC [34]。肠道产生的一氧化氮(NO)光滑muscle-expressed一氧化氮合酶(NOS)诱发cGMP的生产通过激活的可溶性guanylyl环化酶(国网公司)33,35,36]。环核苷酸消除途径包括降解磷酸二酯酶(pde)和主动出口到细胞外空间通过多药耐药性蛋白(MRP)的家人(也称为磷酸腺苷盒式转运体家族)(37]。
在这项研究中,我们测试的假设有一个胃平滑肌细胞的收缩变化,孕期雌激素影响肌肉收缩行为可能导致ER的表达和/或活动的不同亚型。我们也试图探索雌激素的变化影响NO / cGMP通路怀孕期间的腹部肌肉细胞。本研究在怀孕的业务继续我们之前报道的雌激素和孕激素的影响妊娠的女性(30.,31日]。我们的发现可能会相当大的重要性在理解各种乳的原因消化道蠕动障碍和将进一步为理解ER-mediated平滑肌contraction-relaxation通路,从而建立治疗胃肠道疾病的新治疗方法。
2。材料和方法
2.1。动物
约旦大学动物保健和使用委员会科技所有程序进行批准。约旦的动物屋科技大学提供和安置动物在标准条件下(温度20 - 22°C,湿度50 - 60%,和12 h光/暗周期),并允许自由获取食物和自来水在整个实验。女处女老鼠交配与男性Sprague-Dawley老鼠。第一天的妊娠被指定为观察阴道塞的那一天。怀孕17抗早孕(第十天)和16 late-pregnant(妊娠20天)老鼠被用于这项研究。
2.2。隔离的胃平滑肌细胞
老鼠被公司实施安乐死2吸入至少5分钟。证实了安乐死雕饰隔膜手术刀叶片。胃安乐死后立即被切除。胃平滑肌细胞被孤立的怀孕女性Sprague-Dawley老鼠(12周的年龄,250 - 300 g)的顺序酶消化、过滤和离心前面描述的(38,39]。短暂,肌肉条从胃解剖和孵化31°C 30分钟的消息灵通的缓冲区组成的120毫米氯化钠,氯化钾约4毫米,2.0毫米CaCl2,2.6毫米KH2阿宝4,0.6毫米MgCl2,消息灵通的25毫米(4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸),14 mM葡萄糖,2.1%鹰的必需氨基酸混合物,0.1%胶原酶,0.01%大豆胰蛋白酶抑制剂(pH值调整到7.4)。部分消化条被洗两次50毫升的enzyme-free介质和肌肉细胞被允许过滤然后驱散自发30分钟。到500年μm Nitex网是用来收获细胞随后在350 g离心两次10分钟消除破碎的细胞和细胞器。实验2 - 3 h内完成的细胞集合。
2.3。蛋白质的表达雌激素受体(ERα和ERβ通过ELISA)
GSMCs收集从10 ml肌肉细胞悬液(3 x106细胞/毫升)离心机在4°C (20000 x g 1分钟)和颗粒在液态氮snap-frozen均质使用聚四氟乙烯玻璃杵在400年μl冰冷的蒸馏水。离心后溶解产物在4°C g 20000 x 10分钟,上层清液中的蛋白质浓度确定直流蛋白质化验设备(Bio-Rad实验室,Inc .)。样品含有等量的蛋白质被用来量化ERα和ERβ用ELISA试剂盒根据制造商的协议。
2.4。信使RNA的表达雌激素受体(ERα和ERβ通过实时PCR(存在)
实时PCR进行总RNA的互补脱氧核糖核酸合成样品分离出GSMC使用Quick-RNA迷你准备装备从Zymo研究(美国圣地亚哥杰纳西科学)和处理RNase-free DNase即RNA的光度分析以OD260 / OD280比率在1.8和2.2之间,凝胶电泳的完整性检查。总共500 ng / ul RNA被转换成cDNA实时使用'脚本RT PCR检测试剂盒(豆类;Clontech)。每个引物进行实时PCR使用KAPA SYBR®快速qPCR大师混合(2 x)工具包通过StepOne实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。下面的时间和温度曲线用于实时PCR反应:95°C 3分钟;40个循环组成的一系列3 s在95°C, 30 s 60°C, 30年代在72°C。最佳退火温度测定每个引物组经验。所有的反应进行了一式三份和结果进行了分析与Rotor-Gene问软件(试剂盒)。所有结果规范化GAPDH控制和使用进行分析。特定的引物的序列α向前,5′-GCTTTTGAACCAGCAGGGTGGC-3′和反向,5′-AACAAGGCCATTCCCGAGGC-3′,呃β向前,5′-GGATGGAGGTGCTAATGGTGGG-3′和反向,5′- CACTTCCCCTCATCCCTGTCCA-3′,和GAPDH(内部控制),5′- TGGTGGACCTCATGGCCTAC-3′和反向5′-CAGCAACTGAGGGCCTCTCT-3′。
2.5。测量在分散GSMC收缩
扫描测微法被用来测量孤立的肌肉细胞的收缩如前所述[39,40]。肌肉细胞的整除(0.4包含10毫升4细胞/毫升)与雌激素治疗(1μ米),雌激素和ODQ (guanylyl酸环化酶抑制剂)(1μ米),或雌激素和L-NNA (NO合酶抑制剂)(1μ米)10分钟,然后用乙酰胆碱(ACh) (0.1μ米)10分钟。丙烯醛(最终浓度0.1%)被用来终止反应,一滴细胞悬液是放置在一个幻灯片在盖玻片和使用一个倒置的查看尼康TMS-f显微镜(尼康、东京、日本)。细胞图像获得使用佳能数码相机(佳能公司、东京、日本)和ImageJ采集软件(版本1.45秒;美国国家卫生研究院贝塞斯达的)。细胞长度没有任何治疗为静息细胞长度。收缩是表示为30意味着细胞长度的百分比减少肌肉细胞与静息细胞长度。
2.6。测量平滑肌
一氧化氮(不2−/不3−)试验设备是利用间接测量没有浓度平滑肌样品通过确定硝酸盐和亚硝酸盐水平根据制造商的指示。
2.7。平滑肌cGMP的测量
环磷鸟苷水平测定平滑肌样品中使用酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。
2.8。材料
直流蛋白质分析工具包(猫。不。500 - 0116)测量蛋白质含量得到从Bio-Rad实验室,Inc .,赫拉克勒斯,加州,美国。环磷鸟苷比色酶联免疫试剂盒(猫。不。sta - 505)是获得细胞生物学实验室,Inc .,圣地亚哥,加州,美国。一氧化氮(不2−/不3−(cat)分析工具包。不。23479σ)是获得Sigma-Aldrich(默克公司,达姆施塔特,德国)。1 h -Oxadiazoloquinoxalin-1-one (ODQ;猫。不。ab120022)和Nω-nitro-L-arginine (L-NNA;猫。不。ab141312)获得Abcam(英国剑桥)。一个500μ从Sefar AG) m Nitex网购买,Heiden,瑞士。所有剩余的化学物质来自Sigma-Aldrich(默克公司,达姆施塔特,德国)。原液的雌激素在100%乙醇。股票的解决方案ODQ和L-NNA准备在二甲亚砜(DMSO)。最后使用的乙醇和DMSO浓度为1%(体积/体积)。
2.9。统计分析
结果表示为平均值±标准平均误差(SEM)。统计分析的实验进行了使用Prism 5.0软件(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。统计上的差异是由学生的两种方法t以及。统计多个组之间的差异进行了测试使用单向方差分析其次是图基的事后测试。差异被认为是重要的P< 0.05。
3所示。结果
3.1。ER表达
ELISA分析显示更大的蛋白质数量的ERα(2.86折),ERβ(1.94折)(P< 0.05)的抗早孕GSMC相比late-pregnant细胞(数字1(一)和1 (b))。平行、实时PCR显示更大的mRNA的表达ER亚型(P< 0.05)的抗早孕GSMC相比late-pregnant细胞(数字1 (c)和1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。雌激素的变化没有形成
与雌激素治疗肌肉细胞显著增加的水平高于基础水平在两组细胞(P< 0.05)。重要的是,雌激素使细胞抗早孕的没有生产更高的动物相比,细胞late-pregnant动物(2.09折)P< 0.05)(图2)。
3.3。雌激素使cGMP-Formation变化
与雌激素治疗GSMC显著增加cGMP水平高于基底的水平在两组的细胞(P< 0.05)。重要的是,雌激素增加cGMP水平较高的抗早孕细胞相比late-pregnant细胞(1.77折)(P< 0.05)(图3)。
3.4。雌激素的变化影响肌细胞收缩
肌肉长度(即休息。,the length of cells in the control group not treated with ACh) was indifferent in both early- and late-pregnant cells. ACh elicited muscle cell contraction in both pregnancy groups. However, contraction in response to ACh was significantly greater in cells from late-pregnant animals compared to cells from early-pregnant ones (P< 0.05)。重要的是,预处理胃肌肉细胞雌激素明显抑制ACh-induced萎缩细胞的早期,late-pregnant老鼠(P< 0.05)。值得注意的是,雌激素使细胞从抗早孕的放松是大动物减少(~ 41%),而从late-pregnant动物细胞减少(~ 25%)(P< 0.05)(图4)。
3.5。效果没有合酶和国网公司封锁的雌激放松
我们下一个目标探索的影响没有合成酶拦截器(L-NNA)和国网公司拦截器(ODQ)雌激素抑制肌肉收缩的GSMC妊娠组。L-NNA和ODQ显著降低雌激素抑制肌肉收缩的肌肉细胞早期和late-pregnant老鼠(P< 0.05)(图4)。
4所示。讨论
我们报告在这项研究更大的ER亚型(ER的表达α和ERβ)和降低抗早孕大鼠的胃肌细胞收缩相比,细胞late-pregnant老鼠。这个动物雌激素使抗早孕的大胃肌细胞放松调节通过更大的释放没有cGMP的和更高的产量。
胃肠道疾病是最常见的一种症状。怀孕期间的因素调节胃肠道功能了解甚少。了解这些过程在细胞和分子水平对发展新的治疗策略至关重要。我们之前发现雌激素影响胃平滑肌细胞收缩,诱发放松30.]。因为荷尔蒙的变化怀孕的不同阶段,我们选择研究动物在怀孕早期和晚期。
血清雌激素水平较高的怀孕女性表明,雌激素可能是一个重要的作用在调节胃肌肉基因表达,从而收缩行为在怀孕期间,类似于它对子宫肌层的基因表达和收缩性的影响41,42]。事实上,很少有研究在胃肠道ER的表达。先前的分析显示北部ER表达在老鼠上消化道43]。两个呃α和ERβ信使rna被发现在胃和肠的上皮细胞通过rt - pcr (44]。人类胎儿midgestational, ERα和ERβmrna coexpressed在胃和小肠结肠较低水平,确定使用rt - pcr (45]。
我们是第一个探索ER基因表达的差异在GSMC怀孕的两个阶段。有趣的是,我们第一次发现GSMC表达大呃,怀孕初期的两个亚型,而怀孕后期。更大的子宫ER的表达被认为有助于植入子宫的准备和妊娠早期decidualization46]。在子宫肌层中,平行于我们的胃里发现,Geimonen等人研究了术语的ER水平样本和被发现是非常低的47]。同样,大鼠胎盘表达两种亚型的发现ER,重要的是他们的表达水平降低怀孕分娩附近的末尾阶段(48]。我们的ER表达结果显示类似的表达模式在胃里。先前的研究已经表明,滋养层生产干扰素τ,妊娠识别激素,在怀孕后期行为以旁分泌的方式抑制子宫内膜ER基因的转录49,50]。这种机制是否存在在胃里还不知道,需要进一步探索。
我们的研究显示胃平滑肌细胞的收缩增加late-pregnant动物乙酰胆碱,M3受体激动剂(51),而细胞抗早孕的动物。最重要的是,雌激素诱导GSMC放松,放松的大小在早孕大鼠比较晚的。ER的表达增加可能解释这种不同的雌激素效应,可能导致胃排空功能中断在先前的研究报告(52]。然而,未来的研究使用特定ER受体阻滞剂将证实ER的作用,如果有的话,在这样的行动。
放松引起的雌激素是由于没有生产所产生的刺激没有合酶随着雌激素放松被废除的存在没有合酶抑制剂,N-nitro-L-arginine (L-NNA)。我们最近确认的生产没有雌激素在女性胃平滑肌细胞(30.]。因为我们使用新鲜分散GSMC(为了避免其他玩家的贡献的多细胞胃室),没有生产是通过发现平滑肌合酶(NOS) [35]。的机制没有原因放松GSMC主要是可溶性鸟苷酸环化酶导致cGMP形成的刺激(30.]。雌激素使放松的封锁guanylyl环化酶抑制剂,1 h -oxadiazoloquinoxalin-1-one (ODQ),支持NO-cGMP通路的作用。雌激素放松和更多NO-cGMP通路的激活胃肌肉细胞的抗早孕动物相比late-pregnant动物细胞可能与ER的表达越高。重复这些实验使用特定ER受体阻滞剂可能解开这样的可能性。NO-cGMP放松通路存在于人类子宫深处,负责维护子宫静止在怀孕期间(53]。减少响应在子宫松弛一氧化氮在术语可能发挥作用的起始劳动(54,55]。我们的发现强烈建议怀孕期间在胃里类似的分子机制。
测量在体外强直性收缩性是本研究的一个弱点正常阶段发生的收缩性在活的有机体内应该以未来的研究考虑真正的集成各种细胞类型和球员参与胃运动活动如壁肌肉,肠和外在的神经系统,卡哈尔间质细胞,和各种荷尔蒙因素。此外,只有固定剂量的药物被用于研究现状。所以重复这些实验通过建立剂量反应曲线更加强我们的发现。
大鼠为动物模型被使用由于其胃肠道甾体激素的敏感性,在怀孕期间胃肠道变化类似于人类。必须小心解释,然而观察大鼠作为一个一致的物种避免有关年龄的差异,体重,种族背景,并发症和其他混杂因素在人类研究中经常遇到。执行类似的研究在人类胃肌肉细胞将进一步加强我们对胃蠕动障碍的机制的理解与怀孕有关。
5。结论
人队的两个亚型的表达(α和β)是随推进怀孕,这是增加胃肌细胞收缩。雌激素诱导胃平滑肌细胞放松是在怀孕的早期,由增强NO-cGMP通路的刺激造成的。进一步了解孕期胃收缩行为的变化将更好地描述乳胃肠道紊乱和将使更有效治疗这样的干扰。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究是由乔丹科技大学,授予数量20180024。