文摘
支被认为是一个投机取巧的病原体能够在降低尿道;在女性相关的感染严重的妊娠和产后并发症,包括流产、子宫内膜炎、早产和低出生体重。致病性的分子机制和毒性效应物特征仍然不佳。许多研究在过去的十年中已经证明了m . hominis可以建立一个共生的关系阴道毛滴虫泌尿生殖寄生原虫,也与不良妊娠结局相关。最近,两个细菌基因(规律和goiB)与羊膜腔入侵和单个基因(goiC)与intra-amniotic感染和早产已确定的风险很高m . hominis隔绝的一组怀孕的患者。在这个工作我们证明大量的m . hominis细胞与t .鞘突有goiC基因,在联系规律和goiB。此外,我们证明灭滴灵治疗m . hominis来华的t .鞘突允许提供可行的细胞内goiC积极的m . hominis从antibiotic-killed原生动物和自由m . hominis可以感染人类细胞培养。结果表明,分子诊断策略来识别病原体和它们的毒性基因怀孕期间应采取防止严重的并发症。
1。介绍
早产是新生儿疾病的主要原因,占围产儿死亡率的75% (1,2]。早产、胎膜早破可以由多个机制,但在大多数情况下无法建立精确的原因。在过去的几年,一些研究已经表明一个重要和强大的协会之间的早产、宫内感染、至少占25 - 40%的病例(3,4]。感染诱导一个健壮的炎症反应,可以刺激子宫收缩,引起自发性早产(5,6]。在大多数情况下,微生物达到子宫和胎盘膜通过提升从阴道或来自不同来源的造血的传播(7]。
支是最常见的微生物之一与早产和被孤立在40%的羊膜液显示感染(8]。
最近的研究表明基因变异的发生在不同m . hominis隔离对他们潜在的入侵羊水和膜。三个基因(规律,goiB,和goiC)已确定m . hominis从羊膜分离液体与早产和胎盘的女性,而不是参考菌株PG21,从人类分离肠(9]。的基因规律编码为丙氨酸消旋酶参与肽聚糖的合成,然而,这种酶的作用在支原体物种并不清楚。goiB(感兴趣的基因B)未知函数和与一个编码一种蛋白质Ureaplasma体假设蛋白质相似身份(41%和63%),goiC(感兴趣的基因C)编码一个55 kDa似乎严格具体的多肽m . hominis。三个基因中,goiC明显与羊膜感染和早产相关的毒性特征,因此,可以认为m . hominis菌株能够在羊膜腔感染,胎盘(9]。
有趣的是,m . hominis可以建立一个共生关系t .鞘突性传播原虫与不良妊娠结局(10]。m . hominis有能力进入细胞质和生存在原生动物,在那里繁殖配合真核宿主(11]。它已被证明了的百分比t .鞘突感染了支无论范围从5到89%的地理起源12- - - - - -15]。最近看到Fichorova et al。16]。的m . hominis-T。鞘突财团强烈影响的病理学原虫和宿主炎性反应导致移植到感染(17- - - - - -19]。
原生动物的阴道毛滴虫也一直与早产,但在这种情况下,阴道感染是有限的,没有到达子宫和胎盘膜(20.]。的有效作用t .鞘突早产的争论,因为涉及的机制仍不清楚。数据保护作用的灭滴灵治疗不良妊娠结果是矛盾的。在一些研究抗生素治疗似乎是有效预防不良妊娠并发症,但数篇论文报告未能阻止灭滴灵治疗早产的孕妇t .鞘突感染(21,22]。
这项工作的首要目标是理解goiC(与规律和goiB)存在于m . hominis能够建立胞内共生t .鞘突临床分离株,因此代表了一个额外的潜在风险因素在滴虫病不良的结果。此外,我们建立了一个在体外模型来评估致命的遗传性(例如,goiC积极的)m . hominis从metronidazole-treated释放t .鞘突来自人体的细胞。结果表明原生动物的积极作用不仅在运输,而且在怀孕期间传播细菌感染的人体组织。
2。材料和方法
2.1。细胞培养条件
总共有34个t .鞘突菌株被孤立的从1994年到2017年在意大利和莫桑比克。原生动物阴道拭子中分离的女性滴虫病的接种在钻石TYM介质(trypticase,酵母提取物,麦芽糖)补充20%胎牛血清的边后卫,青霉素(300 U.I /毫升),和链霉素(300毫克/毫升),为了消除伴随阴道菌群(23]。原生动物然后1:16每日段落钻石的TYM培养基培养没有抗生素在37°C 5%二氧化碳气氛中至少三个星期在−80°,直到使用和存储。
永生的人类细胞系希望(ECACC目录代码:88102403)是维护在RPMI 1640补充10%的边后卫在37°C 5%二氧化碳气氛,T-25烧瓶内。融合了,细胞培养贴壁细胞单层(每周两次)保持酶的分离与胰蛋白酶和分离的细胞是通过,1/10-1/20,完全RPMI中补充10%胎牛血清。
m . hominis隔绝t .鞘突和细菌参考应变PG21 SP4琼脂板和SP4肉汤培养。
最低抑制浓度(MIC)为甲硝唑和庆大霉素的计算是通过孵化t .鞘突SS-49和m . hominis孤立的从同一个原生动物菌株,用连续稀释药物液体媒体(钻石TYM SP4肉汤,分别)。
2.2。的选择m . hominis寄生t .鞘突隔离
的存在m . hominis在t .鞘突在34株包含在本研究评估特定PCR。对于每个应变,DNA提取106mid-log-phase滴虫细胞如前所述。DNA resuspended在TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8 1毫米EDTA) 0.1的最终浓度μ克/μl和受到多重PCR检测分析t .鞘突和m . hominis(24]。
m . hominis孤立的从每个积极吗t .鞘突在选择媒体。简单地说,原生动物文化在350 x离心机g,t .鞘突通过0.45 -无文化上层清液过滤μ过滤膜,最后接种在SP4琼脂板上。盘子在孵化37°C到可检测煎蛋的外观形状殖民地在琼脂表面。细菌的DNA提取所述。
2.3。毒力基因的识别m . hominis相关的与t .鞘突
基因的存在规律,goiB,goiC在支从原生动物分离菌株进行描述的特定PCR Allen-Daniels et al。9]。肠道m . hominis参考应变PG21,缺乏规律,goiB,goiC的基因,t .鞘突参考应变G3不是寄生m . hominis被用作消极的控制。为了证实PCR结果,所有扩增子测序(BMR基因组学、帕多瓦、意大利)。
2.4。遗传性的m . hominis感染Metronidazole-Treatedt .鞘突来自人体的细胞
细胞内的传播能力m . hominis从支原体来华的t .鞘突来自人体的细胞进行了研究。指数增长的t .鞘突SS-49,自然感染m . hominis阳性规律,goiB,和goiC基因,广泛在磷酸盐缓冲盐水洗(PBS),为了消除不依从细胞外的细胞支原体。原生动物在500年被resuspendedμl (RPMI中补充10%的边后卫,添加到T-25瓶semiconfluent希望细胞的比例为2:1原生动物/人类细胞比率,在37°C和孵化有限公司5%2的气氛。30分钟的孵化后,细胞被广泛用PBS洗净去除原生动物和希望细胞使胰蛋白酶化
灭滴灵的效果支原体传播能力评估在第二个实验:希望细胞,感染t .鞘突如上所述,30分钟,被添加到25瓶μ灭滴灵的g / ml(10倍最小应变SS-49致死浓度,数据未显示)。孵化24小时后,细胞被广泛洗PBS消除原生动物和细胞碎片和死亡使胰蛋白酶化描述。
为了证明m . hominis与t .鞘突可以侵入人体细胞和活细胞,相同的实验进行了进一步的步骤。简单地说,24小时后希望在存在的孵化t .鞘突SS-49灭滴灵、庆大霉素的细胞浓度添加到50μg / ml的最小致死浓度(四次m . hominis应变数据未显示)3小时杀死细菌细胞外。文化被广泛洗在PBS和另外三个星期完成RPMI 1640培养基培养,不需要任何药物。在所有实验的数量m . hominis细胞与希望根据协议所描述的被qPCR量化Ferandon et al。25]。
在所有的实验中,一个整除使胰蛋白酶化细胞接种到培养基分离支,第二个整除受到DNA提取如前所述。所有的实验进行了一式三份。
3所示。结果
3.1。t .鞘突隔离可以寄生goiC积极的m . hominis菌株
我们证明了PCR, 29日34t .鞘突隔离包括在本研究稳定寄生m . hominis。m . hominis从所有被孤立在SP4媒介t .鞘突积极的压力,的存在goiC,陆军研究实验室,和goiB毒性与不良妊娠结局和早产相关的基因被PCR进行评估。在29日m . hominis测试了goiC基因存在于17株(58.2%)goiB和规律被检测到,分别在11(37.93%)和28(96.55%)隔离。的goiC基因是密切相关的规律(16/17),只有部分goiB(6/17)。只有6 29 (20.7%)m . hominis都三个基因。m . hominis参考应变PG21和t .鞘突参考应变G3m . hominis免费的,不具备规律,goiB,goiC基因。结果如图1。
3.2。t .鞘突寄生的毒性m . hominis可以提供细菌能够感染人类细胞吗
我们假设毒性细胞内的大量释放m . hominis从metronidazole-killedt .鞘突后antiprotozoan疗法可以调解羊水和膜的感染。为了证明这个假设,我们建立了体外实验coculturing人为细胞系和愿望t .鞘突感染了m . hominis积极为所有毒性基因(规律,goiB,和goiC)。第一个实验进行了coincubating原生动物和希望细胞在缺乏甲硝哒唑30分钟。由qPCR显示结果m . hominis来自Mycoplasma-parasitizedt .鞘突活细胞可以感染不到0.2%的希望细胞后30分钟的孵化。
相反,m . hominis从metronidazole-killed原生动物大规模交付后24小时的孵化和可行的细菌能够感染人类细胞的感染复数(MOI)对应1.2吗m . hominis/ 3希望细胞。这些数据表明,自由细菌很快坚持人类目标细胞一旦脱离原生动物死亡。在所有的实验中,感染m . hominis通过使用mycoplasma-specific媒体从哺乳动物细胞分离。
进一步实验评估加庆大霉素在媒介文化(庆大霉素保护试验),为了建立m . hominis发布的t .鞘突用灭滴灵治疗也可以入侵并长期生存在人类细胞。qPCR证明m . hominis细胞可存活3周希望细胞暴露在庆大霉素,莫伊对应1细菌/ 4人体细胞。结果也证实了孤立的细菌在媒体mycoplasma-specific庆大霉素治疗人类细胞。
结果表明,m . hominis发布的t .鞘突和灭滴灵治疗后可导致慢性感染在胎膜和羊水,造成不良妊娠结局,失败也可以解释药物在预防不良妊娠并发症利用灭滴灵治疗亚急性滴虫病。
4所示。讨论
早产是新生儿发病和死亡的主要原因,特别是在发展中国家。本地和系统性微生物感染的重要原因是早产,胎膜早破1,26]。m . hominis和t .鞘突感染与不良妊娠结局相关。t .鞘突限制了其殖民阴道(27,28],感染似乎扮演一个角色在不良妊娠结果通过诱导炎症和促炎细胞因子的生产29日,30.]。相反,m . hominis可以入侵羊膜腔,从而直接利用在这个微环境毒性机制。即使致病性和毒力基因的机制参与不良妊娠并发症m . hominis不完全的特点,Allen-Daniels和他的同事们最近发现了两个基因(陆军研究实验室和goiB)菌株分离羊水、胎盘组织和第三个基因(goiC)这是羊水入侵和早产风险显著相关(9]。即使三个基因的有效功能不清楚,作者假设goiC可能导致胎盘和羊水的殖民化而不是阴道(9]。
m . hominis感染可以介导在活的有机体内通过t .鞘突自两个微生物能够建立共生关系,和大多数原生动物隔离是稳定被细菌感染10]。在意大利进行的一项研究中,78.6%的女性和滴虫病也受到影响m . hominis(24]。到目前为止,的存在规律,goiB,和goiC基因只验证m . hominis隔离病人没有滴虫病的历史。我们调查的存在规律,goiB,和goiC基因在m . hominis住在共生的菌株鞘突。我们的数据显示,不仅免费m . hominis而且那些生活在共生t .鞘突能拥有的三个基因与羊膜殖民和不良妊娠结局。
的能力m . hominis隔离定位细胞之前已经证明了几个作者,在不同人为细胞系和精子31日- - - - - -34]。Hopfe等人表明,支原体的感染宿主细胞是由细菌cytoadhesins [31日]。此外,亨利克先生等几个特点m . hominis基因参与海拉细胞胞内感染(35]。
我们证明m . hominis发布的t .鞘突能够感染希望细胞在体外。然而,由于t .鞘突是高度细胞病变,引发大规模杀伤性细胞的单层在不到2个小时,我们不得不限制coincubation很短的时间。为了防止目标细胞溶菌作用,我们添加了甲硝哒唑coincubation细胞30分钟后,证明m . hominis发布的t .鞘突被药物可以有效地和稳定地入侵人体细胞。qPCR的量化m . hominis(即有关。,membrane associated and intracellular bacteria) with human cells after 24 hours of coincubation of metronidazole-treatedt .鞘突和希望细胞显示,大约40%的哺乳动物细胞被细菌感染。
结果通过庆大霉素保护化验证明的能力m . hominismetronidazole-killed发布的t .鞘突在哺乳动物细胞定位细胞。事实上,自从庆大霉素杀死细胞外m . hominis检测细菌感染的愿望后三周的培养在庆大霉素的存在表明,人类细胞可以通过细胞内慢性感染细菌,正如前面证明了Hopfe利用海拉细胞(31日]。这些数据证实公布的支原体的能力t .鞘突感染人类宿主细胞和定位细胞,暗示的作用t .鞘突感染的传播m . hominis。类似Fichorova等。报告的结果是:在一个优雅的论文作者证明metronidazole-killedt .鞘突可以提供细胞内endobiont dsRNA病毒(TVV)免费的病毒,即使他们无法直接感染人类细胞,能刺激大量的促炎反应:细胞毒性细胞因子的生产会导致严重的并发症在怀孕期间(36]。
这些结果表明,原生动物感染的作用不良妊娠结果不能局限于阴道炎症的感应。事实上,特有的t .养狐场/ M。hominis共生关系不良的结果代表了一个额外的潜在风险因素,早产在滴虫病。t .鞘突可以携带m . hominis拥有的规律,goiB,和goiC基因,保护他们从宿主细胞免疫反应和抗菌治疗,从而使他们的乘法和传播。细菌的胞内定位t .鞘突细胞可以解释一些作者描述的矛盾的结果,报告的失败灭滴灵治疗亚临床滴虫病预防早产孕妇(21,22]。在这个场景中,反t .鞘突治疗用药物选择性地对滴虫病有效,可能与细胞溶解的原生动物由宿主免疫反应,可能诱发大规模的释放m . hominis从死亡t .鞘突,导致细菌入侵胎盘和羊水膜。
5。结论
之间的共生联合体t .鞘突和m . hominis意味着一个角色在怀孕期间感染:我们可以假设一个主要角色t .鞘突“特洛伊木马”,能够运输致命细菌,保护它们不仅从当地大规模主机先天和适应性免疫反应,但也从十字架antimycoplasma抗生素无法原生动物膜。因此,分子诊断策略来识别病原体和它们的毒性基因也可以防止怀孕期间严重的并发症。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Trung Tran Thi星期四和瓦伦提娜玛格丽塔同样这项工作。
确认
MIUR提供的金融支持这项工作(Ministero戴尔'Universita e德拉Ricerca,意大利),2012,没有。2013年2012 wjsx8k_004, PIA RAS。