文摘

常数孕产妇高血糖限制,而悸动的孕产妇高血糖可能加强,胎儿分子胰岛素分泌(GSIS)羊。然而,这些不同模式的高血糖的影响胎儿的发展β细胞是未知的。我们测量的影响慢性持续高血糖(CHG,一周)与脉动的高血糖(PHG,)与控制()的百分比胎儿胰腺胰岛素染色(β单元格区域),有丝分裂和凋亡指数和胎儿的大小β肽,在羊胎儿胰岛素分泌。基线CHG胎儿胰岛素浓度较高(控制和PHG相比)。GSIS CHG组较低(控制和PHG相比)。PHGβ细胞面积增加50% (控制和CHG相比)。CHGβ细胞凋亡增加超过400% (控制和PHG相比)。这些结果表明,妊娠晚期常数孕产妇高血糖导致显著β细胞毒性(增加细胞凋亡,减少GSIS)。此外,悸动的孕产妇高血糖增加胰腺β但没有增加GSIS细胞区域,表明降低了β细胞的响应能力。这些发现证明微分影响孕产妇高血糖对胎儿胰腺的模式β细胞的发展,这可能导致以后生活限制胰岛素分泌。

1。介绍

胎儿暴露于慢性高血糖二级母体糖尿病容易发展β细胞增生和增加胰岛素分泌,从根本上提高产后夸大了分子生物学的风险增加胰岛素分泌(GSIS)和血糖过低(1- - - - - -6]。相比之下,母亲孕期严重的糖尿病血糖控制不佳,复杂的血管病变和进一步降低胎儿宫内生长受限(IUGR)结果胰腺β细胞面积和GSIS [3]。在这两种情况下,不仅有短期并发症对于这些后代,而且长期后果。这些后代的长期后果包括成人发病糖尿病的风险增加(3]。

之前的研究在怀孕的羊已经测试了慢性高血糖对胎儿的影响β细胞功能,使用控制实验操纵的孕产妇和胎儿体内葡萄糖浓度和测量胎儿胰岛素分泌开始确定机制负责不同模式的孕产妇和胎儿的影响葡萄糖浓度,发生在糖尿病妊娠,胎儿GSIS (7- - - - - -11]。这些研究表明,恒定的孕产妇高血糖产生一个初始增加胎儿葡萄糖和胰岛素浓度(9),但在8到10天的常数高孕产妇和胎儿葡萄糖浓度恢复正常胎儿胰岛素浓度(8,9]。此外,经过十天的常数孕产妇高血糖,胎儿GSIS和arginine-stimulated胰岛素分泌()与正常胎儿相比下降(8,9]。

多变量结果当慢性高血糖仅限于每天三小时的脉冲(脉动的高血糖,类似于meal-associated高血糖);在这些研究中类似的一段- 11天,胎儿GSIS增加(9]。然而,随后的研究表明,胎儿GSIS变化后慢性脉动的孕产妇高血糖的程度和持续时间取决于葡萄糖浓度增加(12]。

尽管有这样惊人的差异,胎儿GSIS针对不同模式的孕产妇和胎儿葡萄糖浓度在较长时期内,这些研究没有提供洞察机制负责这样独特的胎儿胰腺功能的变化。具体地说,没有任何形态评价胎儿胰腺等应对不同的高血糖的模式。例如,尚不清楚是否慢性常数孕产妇高血糖,甚至局限于后者部分妊娠,将导致或直接产生其他胎儿的迹象β细胞毒性降低GSIS之外,如增加β细胞凋亡或减少胰腺β单元格区域。现在还不知道如何变化在胎儿GSIS慢性脉动的孕产妇高血糖与胎儿β有丝分裂细胞,细胞凋亡,或大小。

因此,我们进行了本报告的研究来测试是否慢性持续七天胎儿高血糖会减少胎儿胰腺β细胞面积与下降β细胞有丝分裂和细胞凋亡增加。我们还测试了是否慢性脉动的孕产妇高血糖(仅限于七天)将导致增加β细胞面积将增加β细胞有丝分裂和细胞凋亡的减少。

2。材料和方法

2.1。动物的准备

研究进行了怀孕Columbia-Rambouillet羊胎儿携带单符合机构的动物保健和使用委员会,科罗拉多大学丹佛在极光的围产期研究中心,这个实验室有限公司由美国国立卫生研究院的认证,美国农业部和美国动物保护协会认证的实验室。绵羊妊娠手术118 - 122天(词= 148天)。孕产妇放入到股动脉和股静脉导管是通过腹股沟切口。胎儿导管置于腹主动脉和下腔静脉通过踏板切口如前所述[13]。胎儿和产妇导管是刷新每日1.5毫升(胎儿)或3毫升(产妇)肝素化生理盐水(50 U /毫升肝素钠在0.9%氯化钠在H₂0)动物被允许开始前至少三天复苏实验注入。

2.2。试验协议

动物被随机分配到三个学习小组和管理如前所述:(1)正常与盐水(控制,);(2)连续葡萄糖70% (w / v, D70)输液调整增加孕产妇动脉血浆葡萄糖浓度80%基于平均每天两次产妇动脉血浆葡萄糖浓度测量(CHG持续的高血糖,);(3)基底D70输液速度调整增加产妇血浆葡萄糖20%额外的60分钟注入D70每天三次(早上8点、下午2点和8点)有针对性的增加速度孕产妇动脉血浆葡萄糖浓度高出80%控件(PHG脉动的高血糖,)[9]。这些治疗方法是维持七天。母体葡萄糖浓度是每天至少检查两次,PHG组额外的测量。在七天的输液期间孕产妇和胎儿动脉血液酸碱平衡,氧气(PaO₂、圣₂动脉血液,O₂内容)和二氧化碳(帕科₂)测量。在基线和整个胎儿动脉输注血浆葡萄糖和胰岛素浓度测定。

2.3。体内胎儿的胰岛素分泌

七天的孕产妇注入GSIS测量的方波胎儿高血糖的夹后面跟着一个精氨酸丸测量葡萄糖会使网络(13]。基线动脉血液样本胎儿动脉血浆葡萄糖和胰岛素浓度被吸引在−25日−15日和−5分钟(相对于起始葡萄糖钳的分钟0)。胎儿动脉血液也在25和−−15抽样酸碱平衡,PaO₂、圣₂动脉血液啊₂内容,帕科₂测量。胎儿高血糖的夹具进行了直接胎儿葡萄糖输液调整双胎儿动脉血浆葡萄糖浓度(9,13]。在125分钟注入精氨酸(5毫升261毫克)在四分钟测量网络管理。血液样本被吸引在5、10、20、30、60、90、120、130、135、145和155分钟测量胎儿动脉血浆葡萄糖和胰岛素浓度。血液采样60分钟、90和120年对酸碱平衡,PaO₂、圣₂动脉血液啊₂内容,帕科₂测量。155分钟后胎儿葡萄糖输液停止,母体葡萄糖或生理盐水注入持续一夜之间让胎儿回到pre-GSIS研究条件。

2.4。生物化学分析

全血中收集EDTA-coated注射器和立即离心机(14000克)在4°C 3分钟。中去除血浆葡萄糖和乳酸浓度立即决定使用YSI模型2700选择生化分析仪(黄色的弹簧仪器,黄色的泉水,哦)(13]。等离子体的其余部分是储存在−70°C的胰岛素的测量是通过ELISA (Alpco;国际米兰-和intra-assay简历:5.6%和2.9)[13]。对啊₂、有限公司₂浓度、pH值、红细胞比容全血收集在肝素化注射器,立即和浓度是决定使用一个ABL 520分析仪(辐射计,哥本哈根,丹麦)。血液含氧量计算520 ABL分析仪(13]。

2.5。器官隔离

验尸和器官进行隔离后的第二天测量体内胰岛素分泌如前所述[13]。胰腺的脾部分固定在4%多聚甲醛(w / v)磷酸盐(PBS),然后转移到70%乙醇(v / v)直到石蜡包埋。的方法获得胰腺杜绝测量胰腺重量。

2.6。胎儿胰腺组织学

石蜡包埋组织部分(5μ米)在100年被削减μ米的间隔从脾胰脏的一部分。β有丝分裂细胞,细胞凋亡,测定与轻微的修改如前所述的脱蜡和抗原检索步骤部分评估β细胞面积只有[14- - - - - -16]。的修改是脱蜡是由洗幻灯片在EZ使脱蜡组织两次deparaffinization解决方案(Biogenex) 5分钟。幻灯片被放置在水冲洗五分钟之后洗在超灵敏的缓冲区(Biogenex) 5分钟。抗原暴露是由放置幻灯片在抗原暴露的解决方案(向量)和加热到95°C 20分钟。其次是阻止1.5%正常驴在PBS (v / v)血清30分钟。成熟的内分泌激素⁺细胞识别与以下主要抗体稀释阻断缓冲区:豚鼠anti-porcine胰岛素(Dako Carpinteria CA 1: 500)或鼠标反人类胰岛素(Abcam英国剑桥1:1000),鼠标单克隆反胰高血糖素,(Sigma-Aldrich圣路易斯密苏里州1:500),兔子反人类生长激素抑制素,(Dako 1: 500),兔子反胰多肽分子,(Dako 1: 500)。一夜之间,部分被在4°C的环境和immunocomplexes发现第二天affinigy净化二级抗血清共轭罗丹明红(杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林PA), 7-amino-4methylcoumarin-3-acteic酸(AMCA,杰克逊ImmunoResearch实验室),和488年AlexaFluor(分子探针,尤金或)[14]。β细胞有丝分裂和细胞凋亡测定胰岛素的百分比⁺细胞磷酸化也阳性组蛋白H3或末端transferate (TdT)介导的dUTP尼克翻译结束标记(TUNEL),分别,如前所述14]。β细胞大小取决于把胰岛素⁺面积内细胞核的数量确定和4′,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI、向量实验室,伯林盖姆CA) [14]。

2.7。统计分析

使用SAS统计分析进行了版本9.1或4.0 GraphPad棱镜窗口。结果表示为±SEM。混合模型与随机方差分析动物词汇占重复测量在治疗组动物进行确定的影响(控制、CHG或PHG)、时间(天的治疗或分钟血糖过多的葡萄糖钳),和治疗时间交互体内测量除了那些只测量结束时葡萄糖钳注入。只测量了一次,包括胎儿体重,胎儿长度和胰腺β细胞面积、大小、有丝分裂和细胞凋亡,比较使用一维方差分析或克鲁斯卡尔-沃利斯检验。

3所示。结果

3.1。母体参数治疗期间

D70的输液速度CHG组的开始通用汽车/人力资源和显著增加在研究期间(7天)。最大速度是5天,通用汽车/小时,此时最后率率略有下降通用汽车/人力资源。PHG集团的长期输注率不随时间变化,取平均值通用汽车/人力资源。一小时的速度丸注入也没有随时间变化和平均通用汽车/人力资源。孕产妇动脉血浆葡萄糖浓度显著增加在CHG和PHG组相比,控制整个输液(,图1(一))。此外,动脉血浆葡萄糖浓度在CHG组相比显著增加PHG集团(,图1(一))。产生脉动的高血糖和模型餐相关的高血糖孕妇,PHG组收到60分钟的葡萄糖输注,增加了动脉血浆葡萄糖浓度的平均mg / dL一天三次。有轻微,但统计上显著的增加动脉pH CHG和PHG组相比,控制(网上,补充表http://dx.doi.org/10.1155/2012/812094),但没有其他变化在孕产妇酸碱平衡,O₂值(PaO₂、圣₂动脉血液,O₂内容),或者帕科₂。

3.2。胎儿参数治疗期间

胎儿动脉血浆葡萄糖浓度显著增加CHG组相比,控制和PHG胎儿在母体葡萄糖输液时期(,图1 (b))。没有胎儿动脉血浆葡萄糖浓度差异PHG和对照组。胎儿动脉血浆胰岛素浓度没有变化的控制和PHG组(图1 (c))。CHG组胰岛素浓度增加的第二天,增加整个注入相比第一天(基线),(,图1 (c))。小但有统计学意义的变化胎儿血液pH值,帕科₂和乳酸浓度(补充表)。

3.3。胎儿的胰岛素分泌

胎儿胰岛素分泌测量方波胎儿高血糖的夹在七天。通过设计,胎儿葡萄糖浓度在每组增加了一倍。这导致更大的绝对增加胎儿葡萄糖浓度CHG组相比其他组(,图2(一个))。对所有群体,胎儿动脉血浆葡萄糖浓度明显大于基线开始在5分钟和持久的高血糖的夹时期(补充图)。胎儿动脉血浆胰岛素浓度增加在所有三组在高血糖的夹子(图2 (b))。然而,胰岛素浓度CHG组才成为统计大于基线浓度90分钟的高血糖的夹(补充图),尽管明显高于血浆葡萄糖浓度在高血糖的夹和葡萄糖浓度增加大大增强基底和高血糖的夹之间的时期。基底CHG胎儿的胰岛素浓度高于PHG和对照组。CHG组的胰岛素分泌,确定之间的区别意味着基底和夹期胰岛素浓度,低于其他组在高血糖的夹(,图2 (b))。然而,意思是胰岛素浓度在高血糖的夹子没有不同的三组中。胰岛素分泌PHG胎儿并不不同于控制胎儿。Arginine-stimulated胰岛素分泌并没有统计学上不同的三组。所有组最大的胰岛素浓度在五分钟post-arginine丸(ng / mL的控制,ng / mL CHG,ng / mL PHG)。虽然胎儿酸碱平衡,血氧值(PaO₂、圣₂动脉血液,O₂内容),帕科₂改变了高血糖的夹在所有组,组之间的差异最小(补充表)。

3.4。胎儿测量、器官重量、胎儿胰腺组织学

胎儿测量和器官重量没有不同的组(表中1)。没有差异β细胞之间的控制和CHG胎儿胰腺,但有一个显著的增加β细胞面积PHG胰脏器官(,图3(一个))。β细胞有丝分裂组织(图中没有不同3 (b)),但凋亡CHG组显著增加(,图3 (c))。β细胞大小(μ米²控制,μ米²CHG,μ米²PHG)没有不同的团体之一。

4所示。讨论

孕产妇,因此胎儿慢性高血糖的模式基本确定胎儿的规定β细胞发育和功能在整个妊娠期间下半年发展正常的成熟。为了确定慢性常数的微分效应与脉动的高血糖,旨在模拟模式的葡萄糖浓度普遍患有糖尿病的孕妇,胎儿胰腺形态和功能上的发展β肽,我们注入葡萄糖产生不同模式的孕产妇高血糖在妊娠晚期孕妇一周的羊。有几个重要的小说研究发现。首先,慢性常数孕产妇胎儿GSIS高血糖减少和增加胎儿β细胞凋亡,即使胎儿β细胞大小、胎儿的程度β细胞有丝分裂,胎儿成比例β在胰腺细胞面积不减少。这些独特而重要的观察结果表明,细胞凋亡和减少GSIS胎儿的早期表现β细胞glucotoxicity,减少胎儿β独立于减少细胞葡萄糖响应性β细胞面积和先于基础胰岛素分泌的减少以前观察到后十天慢性常数孕产妇高血糖(8,9]。其次,胎儿胰腺慢性脉动的高血糖增加了β细胞区域,表明这种细胞变化可能会增加GSIS背后,已经在其他研究慢性脉动的孕产妇高血糖(9]。然而,因为我们没有发现增加了GSIS PHG胎儿尽管增加β单元格区域,目前的结果表明一定程度的β细胞功能障碍在这个PHG组与GSIS下降是一致的在最近的研究长期的慢性脉动的孕产妇高血糖(12]。这些独特的观察,因此,证明细胞形态和发展变化,不同的胰岛素分泌模式之前,可以由脉动的产生与持续的高血糖,异常的发病机制提供新的见解的胎儿胰岛素分泌模式可能发生在人类1型和2型糖尿病怀孕。

在我们的研究中,慢性常数孕产妇高血糖(CHG组)一周增加基底胎儿胰岛素浓度。这些数据与先前的研究一致表明,在一个星期内,胎儿最初胰岛素浓度增加常数胎儿高血糖(7,9,11]。这是紧随其后的是一个变量,但进步的胰岛素浓度下降。在一些胎儿胰岛素浓度回到基线白天6到7,为别人这回到基线需要好几天9]。更长期持续胎儿高血糖最终导致基底胎儿下降胰岛素浓度更低的值比正常胎儿(见8,9]。

也与之前的研究一致,我们发现慢性胎儿GSIS常数降低孕产妇高血糖7天。我们已经延长这些观察表明胰腺癌β细胞面积和个人β细胞大小不变。这些结果显示,首次下降β细胞葡萄糖响应性是设定一个机制,减少胎儿GSIS后慢性常数孕产妇高血糖。我们也有增加β胎儿的细胞凋亡,另一个指标β细胞glucotoxicity。未来的实验确定较长的接触CHG也减少了β单元格区域,这将会增加β细胞凋亡在这个模型中,并将有助于解释CHG更长时间后,基础胰岛素浓度降低(8,9]。

减少GSIS的另一种解释CHG胎儿可能有一个高原胰岛素浓度,代表一个高原在胎儿胰岛素分泌和/或胰岛素分泌和胰岛素间隙之间的平衡,不能超过不管胎儿葡萄糖浓度的进一步增加,最近演示了在正常胎儿(15]。然而,慢性胎儿高血糖持续超过八天的结果在一个明确的减少GSIS和ASIS,只可意会不能言传的高原分子胰岛素浓度(8,9]。这些结果从长期实验,以及增加β细胞凋亡在当前的研究中,强烈支持胎儿的毒性β后细胞常数孕产妇高血糖持续时间只有七天。

PHG胎儿中我们发现增加胰腺癌β细胞面积而不是增加GSIS,以前观察到后十天(9]。除了慢性高血糖持续时间的差异之间的当前和先前的研究中,有胎儿葡萄糖浓度差异研究。在当前的研究中葡萄糖浓度增加了大约15%,并没有统计学意义,尽管显著增加20%产妇等离子体动脉血糖浓度。在前面研究胎儿等离子体动脉葡萄糖浓度增加约20 - 25% (9]。胎儿胰岛素浓度也高在前面研究[9]。也许一个更重要的区别是脉动的高血糖的大小,这在当前的研究中是77%大于控制相比高出60%集中在前面的研究(9]。虽然这种差异很小,最近的一项研究测试了高血糖的脉冲的大小对GSIS的影响,发现高脉动的葡萄糖浓度导致抑制胎儿GSIS [12]。在当前PHG GSIS胎儿正常,尽管他们增加β单元格区域,表示一定程度的β细胞功能障碍,虽然不如CHG胎儿的严重。

尽管增加βPHG胎儿细胞区域,我们没有观察到的变化β细胞大小、有丝分裂、细胞凋亡。有丝分裂可能增加或减少细胞凋亡可能是之前我们获得胰腺可能解释这些观察。此外,利率的变化β细胞有丝分裂可能杜绝展示一个显著更高的利率在PHG胎儿尽管意味着利率控制胎儿相比高出40%。我们也没有测量的速度β细胞再生,如果增加,尽管是非常低的短期内,可能会增加β细胞数量(14,16]。未来的研究需要从PHG动物高血糖的早些时候获得胰腺组织灌注期间确定的相对贡献减少细胞凋亡,增加的有丝分裂,或新生,来确定这些过程直接和机械化影响胎儿β细胞胰岛素分泌,在基线和其他促分泌素葡萄糖刺激和刺激。

5。结论

总之,慢性持续高血糖七天GSIS降低,增加胎儿β细胞凋亡,但胎儿成比例β胰腺细胞区域内保存。相反,慢性脉动的高血糖增加了胎儿成比例β在胰腺细胞区域。基于这些结果,以及之前的研究(8,9,12),我们推测差异后发现人类新生儿GSIS妊娠糖尿病是由于胎儿葡萄糖浓度的细微差别(17- - - - - -20.]。此外,这些研究表明微分效应,孕产妇和胎儿高血糖对胎儿的模式β肽,塑料的发育和功能能力甚至在妊娠期的结束。这些变化可以使独特的编程β细胞可能导致以后生活的命运(甚至终生)限制功能。

确认

m . s .霜被NIH资助T32HD07186支持。s . w .灰砂由NIH资助R01DK084842支持。p . j . Rozance由国家卫生研究院的基金支持R01DK088139 K08HD060688,青年教师研究开发奖的女性健康研究中心,科罗拉多大学丹佛,奖和一个飞行员和可行性的糖尿病和内分泌学研究中心,科罗拉多大学丹佛(P30DK057516π:Hutton)。组织提供的支持是糖尿病和内分泌学研究中心,科罗拉多大学丹佛(P30DK057516π:Hutton)。内容是完全的责任作者,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

补充材料