文摘
脑瘫是一个主要的新生儿缺陷原因不明。有证据表明,胎儿脑损伤的主要原因是CP。严重的胎盘病理学占很高比例的病例。几个因素使产前脑损伤但当和他们如何尚不清楚。本文的目的是确定怀孕期间缺氧导致损害胎儿大脑和评估这个受伤的本地化。慢性缺氧动物模型慢性管理产生的一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)是用来评估胎儿大脑和本地化凋亡活动最敏感的地区。L-NAME繁殖preeclamptic-like条件增加血压、蛋白尿、增长限制和子宫内的死亡率。凋亡L-NAME大脑活动增加和最敏感的地区是subventricular和苍白球区。这些结果可以解释CP的临床特征,还需要进一步的研究。
1。介绍
每1000个出生的孩子活着将开发两个某种程度的脑瘫(CP)。即使它的病因学是未知的,有越来越多的证据表明,胎儿脑损伤的主要原因是CP大脑而不是peripartum侮辱(1缺血脑病[],特别是产前2]。早熟、缺氧、缺血、炎症的临床因素,使产前脑损伤,但当和他们如何行动还不清楚。
子痫前期(PE)在全世界影响怀孕的8 - 10% (3]。在一些研究中表明,从preeclamptic母亲出生的孩子可能有不同程度的神经发育延迟。长期影响已报告在新生儿生长受限添加到preeclamptic [4,5]。子痫前期胎盘病理严重,占所有病例的21%的脑瘫澳大利亚队列(6]。产妇缺氧引起的脑损伤机制的后代还不清楚。据报道,急性胎儿期缺氧改变细胞膜的结构和功能性质和凋亡基因转录启动7),但大多数先前的研究采用的模型在产后急性脑分动物(8]。
神经损伤的位置应该解释脑瘫的临床特征,但新生儿缺氧缺血性脑损伤影像学表现在高度可变,取决于许多因素,包括大脑成熟、严重程度和持续时间的侮辱,和成像研究的类型和时间9]。德弗里斯等人描述存在的室周的胎儿慢性缺氧出血和PE (10,11]。然而,之间没有明确的对应关系被描述出血和长期结果的位置和缺陷新生儿将开发。
没有一个地区对缺氧最敏感的侮辱还未被阐明。严重窒息在动物词表明,祖细胞在subventricular区内(SVZ)容易受到这种侮辱(12),也在海马体神经元损失产前缺氧被描述(13,14]。
我们研究的主要目的是确定怀孕期间如果缺氧情况导致胎儿大脑的损伤,并评估产前的定位损伤。我们动物模型用于这个目的,我们复制PE-like条件的长期抑制一氧化氮合酶(NOS)在大鼠妊娠期间。它导致病变所观察到的类似与子痫前期的女性,如严重的肾血管收缩,蛋白尿,血小板减少症,宫内生长受限(15,16]。
2。材料和方法
2.1。动物和研究设计
女性Wistar鼠大约10周的年龄和体重200 - 250克,是保持恒定室温(22°C),相对湿度60%,12小时暗光周期与标准喂养。动物被随机分配在两个实验小组。
第一组是动物食品和自来水随意对照组(),另一组是动物收到L-NAME 50毫克/公斤/天,一氧化氮合酶抑制剂,溶解在饮用水从第0天怀孕(E0)命名L-NAME集团()。
研究抑制NOS对胎儿的影响,我们建立了牺牲与第一天,第二,第三,人类怀孕三学期制(17,18]。五组母亲的牺牲在妊娠期天E8, E11, E18和胎儿大脑组织固定进行进一步分析。
执行的研究是符合欧盟指令86/609 /中东欧和指导方针的国立卫生研究院(NIH)的护理和使用实验动物。研究伦理委员会批准的协议使用的Centro de Investigacion普林西比菲利普(CIPF),瓦伦西亚,西班牙。
2.2。收缩压(SBP)
我们获得SBP值使用无创自动血压分析仪(Cibertec NIPREM 564年,马德里,西班牙)附加到老鼠的尾巴此前扩张血管的炉子(36 - 37°C) 5分钟,其他地方描述(19,20.]。5读数的平均值从每个动物被视为个人SBP的价值。测量进行妊娠天E1, E8, E11 E18两组。
2.3。围产期结果
各种方法随访分析不同结构的重量。在妊娠期的日子E8 E11,我们测量的重量的部分之间的孕妇子宫植入网站,其中包括相关的胎儿和子宫壁(20.]。妊娠期天E18 crown-rump (CRL)和occipital-snout长度(OSL)测量。胎盘的重量记录,和胎儿器官进行了宏观上的每组5胎儿排除先天性异常。脑和肝器官提取和加权。
产前和围产期死亡率也进行了研究。子宫内的死亡率计算E8妊娠期天,E11计算吸收数量和E18通过评估萎缩性胎儿的数量在每个母亲的子宫角。
2.4。大脑组织化学染色E18样本
在一天的胚胎18胎儿被斩首,大脑解剖了。六个胎儿每组随机选择从所有获得的胎儿,。PFA 4%后固定的大脑组织,维持在30%葡萄糖溶液在24小时之前cryoprotect组织冻结。连续冠状切片的组织得到每一个20 - 25微米。
然后执行一个免疫组织化学分析检测裂解caspase-3活动和tubuline beta-III在胎儿的大脑。
部分是孵化45分钟屏蔽解决方案包含5%正常山羊血清(门店,σ圣路易斯,密苏里州,美国)和5%脱脂奶粉,一夜之间,然后被孵化在4°C anticaspase-3-activated抗体(1:200年,细胞信号技术)。
一个antirabbit生物素化的二次抗体(1:400)是使用。后来Vectastain精英ABC工具包使用的样本在PBS进一步洗后,裂解caspase-3标记细胞可视化使用diaminobenzidine (DAB) +硫酸镍溶液(Vectastain、向量实验室)产生一个黑色的反应产物。后的可视化Caspase-3免疫反应性,部分在PBS和孵化冲洗15分钟一滴Avidin-D屏蔽解决方案(Avidin-Biotin屏蔽解决方案工具包,向量实验室)和PBS冲洗。然后在4°,一夜之间,部分被孵化主要抗体反tubulin-beta-III (1: 250)。
与PBS,洗后部分被封锁与3%的牛奶洗缓冲和二次孵化1小时antimice抗体(1:250)。病房ABC系统后,使用和tubuline-beta-III标记细胞可视化使用少量的解决方案。
部分是脱水和安装。
定量分析凋亡阳性细胞是徕卡显微镜配备摄像头(6000年徕卡DMR徕卡Microsystems CMS GMBH是一家,位于德国)。积极的领域内,故事在20 x进行分析计算和比较凋亡模式。
领域的中枢神经系统,分析了:subventricular区(B11-B12),苍白球区(b1 b2),前视area-anterior下丘脑(H24-H25),下丘脑神经上皮(H1),杏仁核(A7-A8-A9-A10),和纹状体(B3-B13-B14-B23)。使用图像J进行细胞计数,一个图像分析仪的软件。对于每一个动物,4图像区域进行分析来确定凋亡细胞的数量在这些区域。
2.5。数据分析
结果显示为平均值±标准平均误差(SEM)。比较多个组进行使用方差分析和Newman-Keuls事后测试。一个未配对t以及做了两组之间的比较。被认为是重要的差异。GraphPad Prism 4.0。(GraphPad软件公司。拉霍亚、钙、美国)和SPSS 17.0(美国芝加哥SPSS INC ., IL)软件。
3所示。结果
SBP L-NAME组有显著提高的评价时刻整个怀孕与对照组相比,如图1,这意义是显而易见的,因为天怀孕6 (E6,E11和E18)也显示蛋白尿的存在。
当我们分析体重增加和生物统计学测量我们发现胎儿体重减少E6 L-NAME小组(0084±0003克和0066±0003 g), E11(0313±0015克和0204±0008 g),和E18 (67±0, 11 g和1 87±0,04 g) (,图2)。另外,胎盘重量减少了20%控制观察(0 67±0 03 g在控制和0,54±0,02年g L-NAME组,)。胎儿器官的宏观分析发现,如胎盘,有减少胎儿肝脏L-NAME集团()。
之间没有显著差异在CRL和OSL组。然而,当我们计算了OSL / CRL指数,有统计上显著的增加L-NAME集团代表小脑袋在这个集团(OSL / CRL是0318±0009和0476±0040控制和L-NAME组,分别地。)(图3(一个))。
(一)
(b)
关于测量,有显著差异之间的脑重量控制和L-NAME治疗胎儿(0454±0008克和0393±0009,分别地。;图3 (b)),大脑/胎儿体重没有显著差异,虽然有增加趋势指数L-NAME组。最后,在L-NAME组有7倍的子宫内的死亡率高于对照组。(图4,)。
3.1。分析胎儿大脑的细胞凋亡
L-NAME集团增加凋亡的胎儿大脑活动的模式与对照组(,图5)。当我们分析特定的大脑区域,我们发现在胎儿大脑的苍白球区有显著增加凋亡活性检测相比对照组()(图6(一))。subventricular区内也有显著增加凋亡活动()(图6 (b))。
(一)
(b)
(c)
然而,在纹状体区和杏仁核7中有凋亡细胞的数量减少,只有在纹状体区(很重要,图6 (c))。最后,有一个无意义的减少凋亡活动视前区,这对应于下丘脑。
4所示。讨论
本研究检验了慢性缺氧模型如何怀孕以来通过NOS抑制可能产生在胎儿生长受限,增加死亡率,它也会产生一些大脑区域凋亡损伤的分析在怀孕的第三个三个月。我们研究的主要目标是确定的存在凋亡损伤胎儿大脑标本。尽管这产前侮辱可能代表一些临床特征在新生儿或成人,我们集中我们的努力的组织病理学分析损伤。
在这个模型中,我们观察到SBP +增加蛋白尿的存在除了生物统计学的差异测量。这些结果与先前的报道是一致的,表明NOS抑制导致PE-like综合症和减少孕龄胎儿在老鼠16),可能由于血流量减少通过怀孕期间子宫动脉(21]。然而,慢性缺氧作用的机制来减少这血液流动仍然未知22]。
有趣的是,胎儿体重降低,而胎儿长度不受影响。在这个意义上说,也是研究人类胎儿慢性缺氧条件下遭受不对称增长限制,特别是在腹部周长(AC)测量相比,其他的生物统计学参数(23]。同时,交流测量测量midgestation出生体重的最佳预测指标(24]。一个小胎盘和增加死亡率,如在我们的模型中,发现在这样的胎儿也常见。如上所述,它可能是一个好的模型来确定胎儿发育的某些方面在同样的条件下比怀孕复杂与子痫前期。
我们的主要目的是分析宫内胎儿脑损伤的可能性条件下上述独立的劳动损伤。
严重脑损伤后暴露于慢性缺氧。不成熟的大脑暴露于慢性NOS抑制应该仔细考虑,因为L-NAME不是选择性NOS内皮抑制剂。然而,它已经没有对发育中的大脑是有害的,我们必须假定这种物质的总量却降低了我们的模型。
我们有局部严重破坏SVZ和苍白球区(PZ)。我们评估损失的神经细胞通过细胞凋亡,随着近年来越来越多的证据表明,脑分神经细胞损伤发生后不仅通过坏死,但也通过凋亡过程(25]。损伤的主要机制仍然未知。在这个意义上,似乎有一种特殊脆弱性的特定族群的细胞、少突胶质细胞,一直位于SVZ急性围产期脑损伤后(12]。最近还称,慢性缺氧引起的脑损伤并不直接取决于缺氧,但它也是一个适应通过细胞因子反应函数变得不适应。然而,在我们的研究中我们没有分析胎儿大脑中细胞因子的存在,因为它不是我们的主要目标(26]。
对于PZ,这个区域规划和自愿抑制运动的先驱,它没有与围产期缺氧损伤有关。里斯et al。27)发现皮质羊模型中的扰动midgestation以来慢性缺氧。这些障碍被发现在更发达的大脑。nonphisyological下我们研究不成熟的大脑缺氧机制,必须发展在出生后出现,这应该考虑在进一步的研究。
5。结论
总之,我们的研究显示,慢性缺氧怀孕期间产生凋亡损伤大脑组织。这些结果表明最敏感的地区慢性缺氧出生之前SVZ, PZ相比对照组。这种损害的后果和产后表达式受损区域需要进一步具体研究。