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骨质疏松杂志
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骨质疏松杂志/2012年/文章
特殊的问题

Purinergic信号在骨

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2012年 |文章的ID 637986年 | https://doi.org/10.1155/2012/637986

Susanne Syberg彼得•施瓦兹教授彼得森,托马斯·h·斯坦伯格Jens-Erik贝克Jensen珍妮Teilmann Niklas黑麦Jørgensen, ”P2X7受体多态性和骨骼之间的联系状态在老鼠身上”,骨质疏松杂志, 卷。2012年, 文章的ID637986年, 10 页面, 2012年。 https://doi.org/10.1155/2012/637986

P2X7受体多态性和骨骼之间的联系状态在老鼠身上

Susanne Syberg,1,2 彼得·施瓦兹,1,2 段教授彼得森,1,2 托马斯·h·斯坦伯格,3 Jens-Erik贝克詹森,2 珍妮Teilmann,2 和 Niklas黑麦Jørgensen1,2

1老龄化研究中心和骨质疏松症诊断和医学部门,斯特鲁普大学医院,2600斯特鲁普,丹麦

2骨质疏松和骨代谢,内分泌学和临床生物化学、Hvidovre大学医院,2650 Hvidovre,丹麦

3内科,圣路易斯华盛顿大学医学院和退伍军人医疗中心,圣路易斯,密苏里州63110,美国

学术编辑器:埃琳娜Adinolfi
收到了 2012年3月31日
接受 2012年5月28日
发表 05年8月2012年

文摘

巨噬细胞从老鼠菌株的天然突变P451L purinergic P2X7受体受体激动剂(1)不良反应。因为P2X7受体表达在骨细胞与骨生理学、我们问是否与P451L突变菌株有不同的骨表型。通过测序最常见的菌株纯系小鼠,我们发现,只有几株(NZW BALB,点头,129)是窝藏野外突变的等位基因的版本(P451) purinergic P2X7受体的基因。菌株的比较通过双能x线吸收仪(DXA对),骨标记和三点弯曲。培养破骨细胞被用于ATP-induced孔隙形成试验。我们发现,菌株P451等位基因(BALB / cJ - 129 x1 / SvJ)有更强的股骨和更高水平的骨吸收标记C-telopeptide胶原蛋白(CTX)相比C57Bl / 6 j (B6)和DBA / 2小鼠。在菌株451 l等位基因,产生孔破骨细胞的活动在体外后较低的应用ATP。总之,两株天然的451 l等位基因突变P451L,骨骼和低水平的CTX较弱,建议在这些动物吸收水平较低,这可能与减少ATP-induced孔隙的形成在体外。的重要性的解释这些发现的早些时候报道影响P2X7老鼠了,随着开发的小鼠模型测试策略治疗P2X7受体激动剂和拮抗剂在绝经后骨质疏松症的影响。

1。介绍

在过去的十年中,一些报告表明P2-receptor信号起着核心作用在骨骼生理1- - - - - -5]。骨细胞表达多种类型的P2受体(6),允许他们对核苷酸的反应不同,这取决于类型的核苷酸,浓度和暴露的持续时间(7,8]。长时间暴露于高受体激动剂浓度提升者的形成大孔膜由P2亚型P2X7,特性经常评估ATP-induced染料吸收(7,9]。P2X7受体的激活导致细胞形态学改变和膜起泡10),开始在巨噬细胞坏死和凋亡机制11]。有几项研究指导的角色P2X7受体在介导ATP-induced细胞凋亡在其他细胞类型(7)和相应增加破骨细胞数量在老鼠身上发现的消融P2X7受体(P2X7−−老鼠)(3]。在人类的单核苷酸多态性Glu496Ala与废除P2X7受体的孔隙形成活动(12),与降低ATP-induced破骨细胞的凋亡在体外(13]。P2X7受体表达突起在破骨细胞前体和破骨细胞(8,14,15),因此,除了激活凋亡通路,P2X7受体可能在破骨细胞发展中发挥作用16- - - - - -18)和激活(19]。

在颅顶的细胞在体外P2X7受体的激活增加成骨细胞标记物的表达,提高矿化,并引起膜起泡(20.,21]。P2X7激活的影响也可能是通过激活介导的细胞因子白介素1β(il - 1β)在骨细胞或细胞相邻骨间,导致系统性影响骨(22]。在巨噬细胞的人携带两个C等位基因的Glu496Ala (A1513C)多态性,pro-IL-1的处理β受损,导致降低水平的成熟的血清il - 1β。

Solle生成的P2X7受体的消融(辉瑞P2X7−−)在小鼠体内,导致减少总骨矿物质含量(BMC),由于增加小梁骨吸收,减少骨膜股骨的周长,骨膜骨形成减少(3,不良反应机械负荷(4]。另一个小鼠模型,消融P2X7基因(GSK P2X7−−),是由Chessell教授和他的团队23),有一个不同的骨表型,胫骨轴显示皮质厚度增加,但没有总BMD的变化(15]。矛盾的观察一直归因于不同的样本大小、基因敲除的方法,不同遗传背景的近交菌株用于生成老鼠。

的遗传背景两个P2X7−−/压力是重要的研究中显示了Adriouch et al。24]描述的自然发生的突变小鼠P2X7基因。一个胸腺嘧啶胞嘧啶核苷酸位置变化是发现1352 (T1352C) B6基因组,但不是在BALB / c和远系老鼠。突变导致氨基酸序列的改变(脯氨酸,亮氨酸)在451位置(P451L)的胞质尾P2X7受体(24]。通过使转染HEK细胞构造的两种基因型,他们发现ATP-induced孔隙的形成降低了大约50%的细胞携带突变451 l等位基因(24]。在小鼠胸腺细胞P451L突变影响细胞凋亡作用通过ATP-induced孔隙形成(25]。减少响应P2X7受体在小鼠与ATP的451 l可能导致低估的影响P2X7−−在骨骼和其他参数。辉瑞P2X7−−小鼠生成129 / Ola×C57Bl / 6 (B6)×DBA / 2遗传背景,和维护B6×DBA / 2背景(3,26]。葛兰素史克的P2X7−−/老鼠上维护B6背景,但源自B6/129混合动力车(15,23]。

两篇论文描述了一种新型的表达(称为P2X7-k)剪接变体的啮齿动物P2X7 [27,28]。的剪接变体首次发现是在淋巴细胞葛兰素史克P2X7−/−老鼠泰勒et al。27]。尼克等人报道后不久,P2X7-k显示受体激动剂的敏感性和慢失活高于正常P2X7受体复合物(28]。P2X7-k的替代外显子剪接变体包括胞内n端和~ 80%的第一个跨膜域,从而逃脱基因失活在葛兰素史克P2X7−−老鼠。然而,P2X7-k剪接变体是组织的表达,而不是表达对破骨细胞的质膜BALB / cJ P2X7−−[/29日]。

没有当前P2X7−−/模型非常适合学习通过P2X7受体激动剂作用的治疗潜力切除卵巢的老鼠。首先,受损的ATP反应P451L突变细胞面具受体激动剂和拮抗剂的“真正的”效应。第二,一些创始人菌株包含在这些动物的遗传背景缺乏响应在卵巢切除术。近交品系小鼠传统上用于骨研究代表不同的骨骼在开发过程中表型和老化30.),可以精确的解释作用的重要性P2X7受体在骨重塑。在目前的研究中,主要目标是调查P451L等位基因的分布在近交品系的老鼠。此外,我们想调查这些动物的骨骼状态为了选择一个合适的应变与遗传背景(即的首选。载有P451等位基因),P2X7−−/基因型。

2。材料和方法

2.1。测序的P2X7

single-coding突变(T1352C)小鼠P2X7基因导致脯氨酸和亮氨酸在451位置变化(P451L)早些时候报告了四个主要菌株纯系小鼠的24]。检查的两个等位基因的分布T1352C (P451L)分析了在实验室小鼠基因组DNA测序外显子13的小鼠P2X7基因。20种不同的DNA内在菌株(摘要HeJ,影响/ HeJCrl NZB / B1NJ NZW / J、SJL / J, AKR / J, BALB / cJ, BALB / cByJ BALB / cAnNCrl, 129 / J 129 x1 / SvJ, SWR / J, C57L / J, C57BL / 10 J, DBA / 1 J, DBA / 2 J, SM / J,点头,DDY / cJ,和CALB / Rk)和远从2株(亩结论/ Ei和m . spretus从杰克逊实验室获得)是(巴尔港,我)。B6来源于查尔斯河(德国)。丹麦害虫侵扰实验室(丹麦),捐赠10野生亩肌肉有明显,从不同的位置。耳机和尾巴部分被用于DNA隔离与QIAamp DNA血液迷你包(试剂盒),用作模板在使用以下引物PCR反应识别外显子13:F-ACT TGA GGG GTT GTC ATT GC和R-TCC亚美大陆煤层气有限公司GGA AGC TGT ATT GTG给595个基点的扩增子。为每个PCR产品两个测序反应是准备特定的测序引物(F-TGC TGA TGG GTC TGG AAA CT和R-CAT手枪GTG GCA GCC GTA)在测序反应BigDye终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司)作为描述Ohlendorff et al . 200713),加载3100年ABI棱镜基因分析仪。重复的扩增和测序反应运行/应变确认序列。

2.2。动物

雌性老鼠的九个近交品种(摘要/ HeJ NZB / B1NJ SJL / J, AKR / J, BALB / cJ 129 x1 / SvJ, SWR / J, C57L / J和DBA / 2 J)在8周内获得的年龄从杰克逊实验室(巴尔港,我)。B6起源于查尔斯河(德国)。

2.3。研究协议

丹麦动物福利委员会批准了所有动物程序提前(协议:2002/561 - 634)。雌性老鼠在一夜之间,120天的年龄被饿死了安乐死的有限公司2。血液由心脏穿刺收集到5毫升注射器。血清收集和储存在−80°C为以后的测量骨标记。动物被扫描PIXImus(月球公司麦迪逊,WI)密度计。

2.4。骨矿物质测量和身体成分

骨矿物质测量和身体成分的动物PIXImus密度计测定。动物被固定在一个标准位置,测量顺序进行,重复的决定。Intraassay简历和interassay CV 0.73% 0.47%。由于大头骨矿物含量,它被排除在计算。

2.5。骨形成和吸收标记

调查可能的骨形成标记基因型之间的差异,骨钙素在血清样本测量重复使用鼠标骨钙素RIA试剂从生物医学技术,Inc .(斯托顿,MA),按照协议提供的试剂。Interassay简历为12%,intraassay简历是6%。

骨吸收I型胶原蛋白的表达的片段在小鼠血清(s-CTX)以重复使用RatLaps Elisa测定(C-telopeptide胶原蛋白I型片段分析)由北欧生物科学诊断(Herlev、丹麦)和以下提供的过程装备。Interassay简历为14.8%,intraassay简历是9.2%。

在复制小鼠血清碱性磷酸酶活性测定使用碱性磷酸酶试剂盒(σ)。直接在血清碱性磷酸酶活性测定在多井盘子,用轻微的修改标准的临床化学过程。血清副本与碱性缓冲溶液稀释和衬底的解决方案是添加到每个盘子是孵化在37°C为30分钟。最后2.0 n氢氧化钠添加到每个停止反应,吸光度测量之前在盘子里读者在405海里。Interassay简历为5.9%,intraassay简历是2.4%。

2.6。骨强度测量

那天牺牲鼠标股骨标本收集,清洗的组织,用生理盐水纱布,冻结在−20°C到生物力学测试。股骨的强度由劳埃德3-point-bending测试仪器测量压缩装置(英国劳埃德仪器,Fareham),执行后补水股骨在盐溶液在室温下,如前所述[31日]。

2.7。骨Histomorphometry

调查组织学和形态学变化在四个不同的近交菌株histomorphometric分析,如前所述[31日]。简而言之,总刺和胫骨收集和固定在70%乙醇5°C。以下指标测定;骨体积总量的百分比(BV /电视%)、皮质厚度(C.Th,μ米)、小梁厚度(Tb.Thμ米),侵蚀表面的骨表面(ES / BS %)。在荧光灯下骨表面的矿化表面被确定为百分比(女士/ BS %)。此外,矿物同位的速度(3月μ米/天)计算。

2.8。在体外染料吸收试验

破骨细胞从骨髓中分离3 - 4周大长骨头的雌性老鼠的菌株;BALB / cJ 129 x1 / SvJ, DBA和B6(10老鼠/株)被吴et al。32]。骨髓单核细胞/巨噬细胞系的前体被播种αmem (10% FCS, 100 U /毫升青霉素,100μ50 g / mL链霉素,2毫米谷酰胺,ng / mL - csf和pH = 7.35 - -7.4)和镀2×10的密度6细胞/厘米3。超过91%的单核和多核细胞在这些文化彩色正面陷阱(抗酒石酸酸性磷酸酶)使用白细胞酸性磷酸酶工具包(σ)。

研究孔隙形成破骨细胞的四株,成骨细胞的描述柯et al。37天后),改变了媒介文化玫瑰/葡萄糖(20/10毫米)二阶cation-free缓冲和破骨细胞能力的染料YO-PRO(分子探针)在ATP(200海里)刺激评估。9分钟后赫斯特33342 (5μg / mL, BioWhittaker)添加到文化一分钟展示清白的破骨细胞的细胞核。只有多核破骨细胞(3或更多核)指望一个徕卡BZ: 03显微镜和YO-PRO含有细胞的数量与总破骨细胞的数量在10个随机选择的领域。控制文化孵化YO-PRO和赫斯特,但不是ATP。Interassay简历为9.8%,intraassay简历是5.4%。

2.9。吸收试验

分离、培养破骨细胞dyeuptake分析如上所述,但播种在96孔板上牛骨片(北欧生物科学、Herlev丹麦)或玻璃罩滑落。10天后文化在玻璃罩滑破骨细胞的染色陷阱和统计的可见检查10个随机选择的字段。只有陷阱阳性细胞多核被量化为多核破骨细胞。骨片的细胞被清除和吸收坑与苏木精染色,之前与C.A.S.T.量化(计算机辅助Sterological Toolbbox)在奥林巴斯Bx51网格系统。结果计算区域再吸收总面积的百分比。Interassay简历为0.67%,intraassay简历是0.45%。

2.10。统计数据

使用SPSS统计分析软件,v.11.5。标准参数和非参数测试。比较的结果不同的菌株采用单向方差分析,多重比较和事后Bonferroni调整。统计上的差异被认为是微不足道的 ≤ 0 。 0 5 。简单的描述性统计分析数据提出了意味着±标准平均误差(SEM)。

3所示。结果

3.1。近交的P451L突变菌株的分布

P451L突变的两个等位基因的分布中常见的实验室老鼠株菌株在21个菌株和不同等级确定测序基因组DNA。只老鼠从野生种群,远的菌株和一些天生的菌株,其中包括四个主要的菌株,BALB,点头,NZW,到129年,P451等位基因,以下称为原始P451L突变的基因型。其余的调查了451 l等位基因突变菌株和不同等级(表1)。
菌株与P451 菌株451 l
亩spretus* C57BL / 6 j (B6)*
亩骶* C57BL / 10 j*
亩结论:(* C57BL / 6 ncrl
BALB / cByJ* DBA / 1 j*
BALB / cAnNCrl* DBA / 2 j*
BALB / cJ AKR / J
点头* 摘要:HeJ
NZW* C57L / J
129 / J* NZB / BINJ
129 x1 / SvJ SJL / J
SWR / J
DDY / J
SM / J
CALB / RkJ
表1
菌株的分布在两组不同P451L突变的等位基因的版本。菌株用斜体远或老鼠从野生种群。*确认的数据也显示Adriouch et al。24]。
3.2。骨P451L突变表型的关系

十近交品种常用在骨相关的研究中,被测定仪研究了,三点弯曲和血清骨标记揭示骨表型的浓度。总结如表2所有测量参数组间有显著差异,但只有少数相关的不同等位基因的版本P2X7 P451L突变。与现有的遗传背景P2X7−−/老鼠(23,26),129年的近交品种x1 / SvJ和BALB / cJ (P451)与B6和DBA / 2 (451 l)对骨地位和背景这些菌株被histomorphometric分析,进一步研究了吸收活动,在体外dyeuptake化验。
样本大小( ) 129 x1 / SvJ BALB / cJ B6 DBA / 2 j SWR / J C57L / J AKR / J SJL / J NZB / BlNJ 摘要:HeJ 方差分析的一种方法
15 14 16 14 14 15 15 15 15 15
P451L基因型 P P l l l l l l l l
骨参数
弹道导弹防御(g / cm2) 0.0562* 0.0513,维 0.0502,维 0.0468* 0.0477 0.0579 0.0576 0.0548 0.0525 0.0563 < 0.001
(±0.0020) (±0.0018) (±0.0020) (±0.0022) (±0.0013) (±0.0030) (±0.0021) (±0.0015) (±0.0041) (±0.0018)
BMC (g) 0.535* 0.471,维 0.458,维 0.358* 0.394 0.548 0.593 0.459 0.465 0.558 < 0.001
(±0.045) (±0.028) (±0.031) (±0.029) (±0.035) (±0.042) (±0.046) (±0.025) (±0.064) (±0.036)
区(厘米2) 9.53D 9.19D 9.13D 7.65* 8.26 9.46 10.29 8.38 8.83 9.90 < 0.001
(±0.53) (±0.30) (±0.40) (±0.41) (±0.54) (±0.35) (±0.60) (±0.40) (±0.60) (±0.50)
在股骨BMD地区(g / cm2) 0.0798B, D 0.0764B, D 0.0655A、C 0.0639A、C 0.0650 0.0786 0.0782 0.0774 0.0740 0.0826 < 0.001
(±0.0039) (±0.0021) (±0.0033) (±0.0028) (±0.0024) (±0.0049) (±0.0036) (±0.0032) (±0.0052) (±0.0037)
BMC股骨地区(g) 0.0439B, D 0.0402D 0.0364,维 0.0281* 0.0307 0.0464 0.0466 0.0391 0.0378 0.0439 < 0.001
(±0.0044) (±0.0028) (±0.0026) (±0.0026) (±0.0021) (±0.0044) (±0.0029) (±0.0030) (±0.0060) (±0.0036)
股骨的地区(cm2) 0.552D 0.529D 0.558D 0.443* 0.476 0.595 0.599 0.507 0.511 0.533 < 0.001
(±0.035) (±0.031) (±0.027) (±0.035) (±0.031) (±0.046) (±0.026) (±0.032) (±0.053) (±0.028)
股骨长度(毫米) 15.25D 15.06D 15.53D 14.34* 14.29 15.79 16.00 14.08 15.90 15.61 < 0.001
(±0.36) (±0.64) (±0.23) (±0.45) (±0.40) (±0.33) (±0.69) (±0.28) (±0.45) (±0.64)
力量/ Max。负载股骨( ) 31.5* 24.6* 16.3A、C 18.7A、C 16.7 28.0 30.5 20.0 23.3 33.9 < 0.001
(±3.2) (±1.7) (±1.1) (±1.5) (±0.8) (±2.4) (±2.8) (±0.8) (±3.0) (±2.3)
在活的有机体内骨标记
骨钙素(ng / mL) 40.0C, D 55.91* 38.42C, D 71.72* 38.44 36.49 72.37 51.09 48.49 63.22 < 0.001
(±9.48) (±11.78) (±11.11) (±10.89) (±8.97) (±8.75) (±11.25) (±10.20) (±8.06) (±11.38)
高山(nmol /毫升) 266.8 314.2 260.2 317.6 272.5 179.7 190.9 213.7 299.4 270.6 < 0.001
(±56.1) (±41.2) (±63.8) (±60.5) (±39.9) (±48.3) (±62.5) (±59.6) (±36.3) (±56.3)
RatLaps-Telopeptide胶原蛋白(ng / mL) 14.28B, C 19.09* 9.81A、C 12.13C 10.75 9.37 7.07 7.15 8.83 8.76 < 0.001
(±3.45) (±4.40) (±1.86) (±1.88) (±1.62) (±2.53) (±2.62) (±1.83) (±1.95) (±4.02)
表2
骨参数和浓度在活的有机体内骨标记意味着(±SD)。动物的数量在每个应变表示的顶部表( )。骨密度、BMC和骨区域,在整个身体或股地区由DXA对扫描。电子数显卡尺测量股骨长度、股骨的骨强度之前由三点弯曲测试。在活的有机体内骨标记测定血清使用商业上可用的工具。单向方差分析进行测试组之间的差异和事后Bonferroni调整,使用0.05的显著性水平。简单的描述性数据提出了均值和标准差(SD)。129 x1 / SvJ之间的显著差异,BALB / cJ, B6, DBA / 2的动物 < 0 。 0 5 级别是提取Bonferroni多重比较分析和用星号表示不同于其他三个菌株时,当不同于129 x1 / SvJ与B6与B不同,与C不同于BALB / cJ,和D时不同于DBA / 2 j。
3.3。骨的地位背景菌株

当关注BMD / BMC 129 x1 / SvJ明显( < 0 。 0 0 1 )更高的全身骨矿物质(BMD和BMC)相比,其他三个菌株(图1(一))。承载地区股BMC和BMD的菌株129 x1 / SvJ和BALB / cJ B6和DBA / 2 ( < 0 。 0 0 1 。图1 (b))。

(一)”name=
(一)
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(d)
图1
< 0 。 0 5 骨参数129 x1 / SvJ BALB / c, B6, DBA / 2天生的菌株。菌株在之间的显著差异水平用星号指示不同于其他三个菌株时,当不同于129 x1 / SvJ与B6与B不同,与C不同于BALB / cJ,和与DBA / 2 D时不同。P451L基因型在每个应变表示P、L。(a)在BALB / c和维生素B6全身弹道导弹防御系统没有显著不同,但明显低于129年x1 / SvJ和BALB / cJ。BALB / cJ BMD高于DBA。129年(b)股骨BMD x1 / SvJ和BALB / cJ明显高于B6和DBA / 2。后者没有显著不同。(c)股骨强度评估由三点弯曲试验显示强度明显高于129年x1 / SvJ股骨。股骨BALB / c都强于DBA和B6株。后两个没有显著不同。(d)的血清浓度吸收s-CTX-I标志,显示明显高于吸收在BALB / cJ应变和B6株最低。

确定骨质量的终极方式是测试骨抵抗机械力量的能力。由三点弯曲试验,小鼠股骨骨强度不同的菌株(表2)。的四个背景菌株129 x1 / SvJ和BALB / cJ更能抵抗机械力在股骨DBA / 2和B6株( < 0 。 0 0 1 、表2,图1 (c))。

在活的有机体内骨标记表进行了总结2。骨形成标志物的血清浓度,碱性磷酸酶和骨钙素,没有与P451L P2X7基因突变。BALB / cJ应变有显著( < 0 。 0 0 1 s-CTX)高于所有其他菌株(图1 (d))。129 x1 / SvJ s-CTX小鼠显著高于B6小鼠,但不是DBA / 2(表2)。

3.4。Histomorphometric分析与P451L突变

椎骨骨体积(%)是129年x1 / SvJ高于BALB / cJ和B6 ( < 0 。 0 0 1 ),而BALB / cJ和B6(图之间没有显著性差异2(一个))。在结核病没有发现显著差异。不同菌株之间的。皮质厚度(C.Th) BALB / cJ (102.1μB6 (93.0 m)没有明显不同μ米)和DBA / 2 (104 4μ米)。意思是C。Th是121.5μ129的x1 / SvJ应变,显著高于其他三个菌株。3月和女士/ BS显示任何四个种族之间的显著差异。然而ES / BS %显示129 x1 / SvJ应变ES / BS %明显高于B6,和BALB / cJ, B6, DBA / 2(图2 (b))。

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(一)
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(b)
图2
Histomorphometric分析椎骨的菌株129 x1 / SvJ, BALB / cJ, B6, DBA / 2显示为±SEM手段。P和L指P451和451 L,分别。(一)BV /电视% 129 x1 / SvJ是32%到46%之间,低于BV /电视%其他菌株。(b)侵蚀表面的百分比(ES / BS %)高出近50%在129 x1 / SvJ菌株相比其他菌株。
3.5。体外骨吸收试验

吸收坑/骨片的面积计算总面积的百分比在10老鼠从每个应变。BALB / cJ - 129 x1 / SvJ破骨细胞显示区域再吸收19.1%和18.7%相比,B6和DBA / 2 17.4%和16.3%,无显著差异( = 0 。 4 7 8 之间BALB / cJ和DBA / 2)。的数量TRAP-stained破骨细胞没有显著差异。BALB / cJ 79.5和83.7和129 x1 / SvJ TRAP-positive破骨细胞相比,B6和DBA / 2 93.6和97.4,与无显著差异( = 0 。 1 0 8 之间BALB / cJ和DBA / 2)。

3.6。在体外染料吸收试验

阐明细胞的这些变化,我们检查了ATP刺激染料吸收试验,比较了孔隙形成4文化从10老鼠在每个下面的菌株;B6, BALB / cJ, DBA / 2, 129 x1 / SvJ。一半的细胞培养与染料孵化,但没有ATP刺激。这些文化被用作控制确定自然背景染色,对比分析细胞的总数。破骨细胞的一小部分un-stimulated控制文化表现出自发的染料吸收,菌株之间没有显著差异。有趣的是,破骨细胞吸收染料在ATP-stimulation的比例明显高于单独作用时菌株携带P451等位基因(BALB / cJ - 129 x1 / SvJ)与451年相比菌株l基因(DBA / 2和B6) ( < 0 。 0 5 )(图3)。当校正背景吸收染料,染料吸收的数量从451年P2X7破骨细胞l菌株相比降低了大约30%的破骨细胞P451菌株,表明突变P2X7-mediated孔隙形成的有害影响。


图3
染料吸收129年四大株x1 / SvJ BALB / cJ, DBA / 2, B6,显示为均值差异的染料吸收控制文化和ATP的染料吸收,刺激细胞培养(±SEM)。P L指P451和451 L,分别。

4所示。讨论

P451L P451等位基因的突变P2X7出现在不同的野生老鼠数量,远系繁殖的病毒株亩结论/ Ei和m . spretus四个近交品种,BALB点头,NZW, 129(表1)。在骨表型的研究中,两个菌株的特征,有自然的版本(P451)的突变,其他八个菌株451 l版本。我们发现伟大的多样性在所有检查骨表型参数,但只有少数P451L突变相关。菌株129 x1 / SvJ高BMD,强骨histomorphometric分析股骨和更高的骨吸收,而BALB / cJ, DBA / 2和B6。BALB / cJ较高的股骨BMD更强更高水平的骨吸收标记s-CTX比DBA / 2和B6。

我们发现强有力P451小鼠股骨BMD高。机械应力的承载部分的身体可以诱导释放ATP的隔间。机械刺激骨形成的部分已被证明是通过P2X7受体介导的(4]。然而,我们没有发现任何显著差异在骨形成标志物P451L等位基因相关联。也许ATP的局部作用刺激在股骨不能检测到血清样本的系统性骨标记。histomorphometric分析只是椎骨,更高的BV /电视% P451老鼠被发现。

骨表型的研究中我们发现,与天然菌株451 l基因突变对P2X7吸收低于菌株与野生型等位基因(P451)。激活P2X7受体激动剂在低浓度可以发起破骨细胞形成33,34]。破骨细胞数量的显著差异10天后的文化没有检测到,但是记住,破骨细胞的文化是没有受体激动剂刺激。没有一个P451L突变对破骨细胞的影响发展在体外也可能由于缺少系统性的荷尔蒙,机械刺激,缺乏辅助细胞在文化系统。

下一个步骤是在吸收活动调查是否有差异在体外尽管我们没有发现显著差异在再吸收区域似乎倾向于更高的吸收与破骨细胞文化源自P451菌株。吸收并不是调查的时间在这项研究中,但记住,P2X7受体参与破骨细胞的凋亡13),可能会有不同的长度的破骨细胞吸收阶段相关P451L等位基因的版本。

在人类中,多态性叫Glu496Ala废除的孔隙形成活动P2X7受体(12),与减少有关ATP-induced破骨细胞的凋亡在体外(13]。更倾向TRAP-positive破骨细胞被认为在451 l破骨细胞的文化。在这项研究中,细胞凋亡并不是直接解决在体外破骨细胞来源于检查菌株显示差异ATP-induced染料吸收试验。研究突变P451L在c端P2X7的一部分,这被认为是参与孔隙形成的起始,通过激活pannexin-1 [35,36]。以这种方式451 l突变P2X7受体可以钝pannexin-1依赖染料吸收,并解释我们发现的减少染料吸收B6和DBA / 2破骨细胞。

孔隙形成的生理重要性还有待阐明,但除了有一个角色在细胞凋亡可能与il - 1β处理和通过pannexin-1上映37,38]。Interleukin-1β据报道影响骨吸收和骨形成依赖于政府的持续时间(39]。Interleukin-1β也已被证明能够诱导破骨细胞前体增殖和分化,并增加骨吸收(40]。这表明,il - 1β最初引起骨吸收,但长期影响骨代谢增加,对应于我们的数据。

在巨噬细胞的人携带两个C等位基因的Glu496Ala (A1513C)多态性,pro-IL-1的处理β受损,导致降低水平的成熟的血清il - 1β。理论,减少活动后的胞质尾P2X7(以孔隙形成)具有显著的重要性在确定骨细胞的反应ATP,骨细胞的机械刺激和突变菌株应该受损,从而释放il - 1的成熟β减少了。然后il - 1的水平β诱导吸收会减少与突变菌株和骨改建计划将有利于骨形成,这与吸收测量的水平下降在活的有机体内B6和DBA / 2。

背景的菌株前所述P2X7−−/老鼠港口检查的451 l等位基因突变P2X7。观察到的差异在两个P2X7−−/小鼠模型不能解决P451L P2X7发现在后台的突变株,因为两种模式都保持在遗传背景窝藏451 l等位基因。然而,不同的骨骼DBA / 2的状态和B6可能影响的方向P2X7消融的效果。观察到缺乏机械刺激对骨形成在辉瑞P2X7−−,可能不会被发现以来,纯B6背景DBA / 2显示了B6小鼠改造而增加。不同的观察的最好理由是基因敲除的逃避由于拼接变体P2X7-k [28在葛兰素史克P2X7−−/模式23]。即使没有表情的剪接变体P2X7-k被发现在破骨细胞(29日],葛兰素史克P2X7−−/成骨细胞没有染料吸收,拼接变种P2X7-k仍然可以发现在其他细胞的环境。

潜在的目标是找到一个候选人的老鼠可以作为新的遗传背景P2X7−−老鼠,在寻找的治疗潜力P2X7受体激动剂和拮抗剂在绝经后骨质疏松症的小鼠模型。四株测定P451等位基因的测序,然而点头老鼠患I型糖尿病(期间P2X7表达式改变(41])和NZB小鼠自身免疫性贫血。只有两个菌株的P451等位基因突变了,也就是说,129 x1 / SvJ和BALB / cJ。在这项研究中我们发现,DBA / 2 B6和低BMD(完全和股骨的区域)和骨强度很低,这可能很难检测参数的变化。除了携带P451等位基因,高基线BMD、相对强健的骨骼,高骨小梁体积应该描述选择的压力。所有与129 x1 / SvJ骨表型,但这一毒株的老鼠显示没有松质骨在雌激素消耗损失,据报道在绝经后妇女雌激素减少大鼠(42,43]。相比之下,BALB / cJ相对强健的骨骼和高在股骨BMD,高结核病。Th和数量,和响应预测卵巢切除术(44]。

总之,我们发现P451菌株具有较强的股骨和更高的弹道导弹防御,但无法建立细胞基础研究。本研究的主要发现是,遗传背景可能是重要的在确定重要性P2X7消融的影响,一个最优的菌株为研究的特异性影响P2X7消融可能BALB / cJ老鼠。

确认

作者要感谢巴氏研究所哥本哈根市医院为指导和住房的动物。斯坦Ohlendorff的技术援助和Zanne亨利大为赞赏。丹麦害虫侵扰实验室请提供亩肌肉从不同的位置。这项工作是支持的请欧盟第七框架计划(建议没有。202231)作为一个合作项目执行中ATPBone财团的成员(哥本哈根大学医院斯特鲁普,伦敦大学学院,马斯特里赫特大学费拉拉大学,利物浦大学,谢菲尔德大学,大学(Universite Libre de Bruxelles)和),和是一个substudy主要研究“对抗骨质疏松症通过阻断核苷酸:purinergic信号在骨形成和体内平衡。“此外,这项工作由研究基金会Hvidovre医院H:年代,丹麦在2003年和2006年。

引用

  1. s·j·迪克森和s·m·西姆斯,”P2 purinergic成骨细胞和破骨细胞:受体对药物开发潜在目标,“药物开发研究卷,49号3、187 - 200年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  2. m . w . Grol n . Panupinthu j . Korcok s·m·西姆斯和s·j·迪克森,”表达、信号和P2X的函数7受体骨。”Purinergic信号,5卷,不。2、205 - 221年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  3. h . z Ke, h . a . f . Weidema et al .,”P2X删除7核苷酸受体在骨形成和吸收,揭示了其监管角色”分子内分泌学,17卷,不。7,1356 - 1367年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  4. h·j·李,d . Liu z Ke, r·l·邓肯P2X和c·h·特纳7核苷酸受体介导骨骼转导。”生物化学杂志,卷280,不。52岁,42952 - 42959年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  5. a . Gartland k·a·巴克利r . a . Hipskind et al .,“多核破骨细胞的形成在活的有机体内和在体外缺少7 P2X受体的老鼠们注入了。”真核基因表达的关键评论,13卷,不。2 - 4、243 - 253年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  6. w·b·鲍勒k·a·巴克利a . Gartland r . a . Hipskind g . Bilbe和j·a·加拉格尔“细胞外核苷酸信号:集成本地和系统性反应机制的激活骨重塑,”骨,28卷,不。5,507 - 512年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  7. r . a .北“P2X受体的分子生理学,”生理上的评论,卷82,不。4、1013 - 1067年,2002页。视图:谷歌学术搜索
  8. l . n . Naemsch s·j·迪克森和s·m·西姆斯”P2X依赖性活动发展7当前和Ca2 +进入兔破骨细胞,”生物化学杂志,卷276,不。42岁,39107 - 39114年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  9. a . Surprenant f . Rassendren e .川岛r . a .北和g .过活”细胞溶解的P2 z受体细胞外ATP标识为P2 x(P2X受体7),“科学,卷272,不。5262年,第738 - 735页,1996年。视图:谷歌学术搜索
  10. d·法拉利,p . Chiozzi s Falzoni et al .,“细胞外ATP触发il - 1β发布通过激活purinergic P2Z人类巨噬细胞的受体,”免疫学杂志,卷159,不。3、1451 - 1458年,1997页。视图:谷歌学术搜索
  11. d·法拉利·m·洛·m·k·a·鲍尔·凡s Wesselborg和k . Schulze-Osthoff”P2Z purinoreceptor结扎诱导激活还存在与不同的角色在细胞死亡的凋亡和坏死改变,”2月的信,卷447,不。1,第75 - 71页,1999。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  12. r·A·沃辛顿b . j .顾w . Zhang et al .,“glu - 496 Ala多态性导致人类P2X损失函数7受体。”生物化学杂志,卷276,不。14日,第11142 - 11135页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  13. s . d . Ohlendorff c . l . Tofteng戈尔。b . Jensen et al .,“P2X单核苷酸多态性7基因相关骨折风险和雌激素治疗的影响,“药物遗传学和基因组学,17卷,不。7,555 - 567年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  14. n . r . Jørgensen z系列,o . h . Sørensen e·f·埃里克森r . Civitelli t·h·斯坦伯格,“人类成骨细胞和破骨细胞之间的细胞间发生钙信号,需要激活破骨细胞P2X7受体。”生物化学杂志,卷277,不。9日,第7580 - 7574页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  15. a . Gartland k·a·巴克利r . a . Hipskind et al .,“多核破骨细胞的形成在活的有机体内和在体外由P2X7receptor-deficient老鼠。”真核基因表达的关键评论,13卷,不。2 - 4、243 - 253年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  16. l . C . Denlinger j·a·萨默k·帕克et al .,“二氨基酸的突变在P2X C末端的主题7核苷酸受体导致走私缺陷和功能受损,“免疫学杂志,卷171,不。3、1304 - 1311年,2003页。视图:谷歌学术搜索
  17. j . f . Hiken和t·h·斯坦伯格ATP会使P2X7在原始细胞,抑制破骨细胞形成美国生理学杂志》上,细胞生理学,卷287,不。2,C403-C412, 2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  18. a . Hoebertz t·r·阿奈特,g . Burnstock”监管嘌呤和嘧啶的骨吸收和形成,”药理科学趋势,24卷,不。6,290 - 297年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  19. m·s·莫里森l·b·f·王,g . Burnstock都灵和t·r·阿奈特”ATP是一种潜在的刺激激活和啮齿动物破骨细胞的形成,“生理学杂志,卷511,不。2、495 - 500年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  20. n . Panupinthu j·t·罗杰斯P2X l .赵et al。。7成骨细胞受体夫妇生产lysophosphatidic酸:信号促进骨生成轴”,细胞生物学杂志,卷181,不。5,859 - 871年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  21. n . Panupinthu l .赵f . Possmayer h . z Ke, s·m·西姆斯P2X和s·j·迪克森。7核苷酸受体调节成骨细胞通过途径涉及lysophosphatidic酸起泡,”生物化学杂志,卷282,不。5,3403 - 3412年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  22. r . Sluyter a . n . Shemon和j·s·威利,“Glu496 P2X Ala多态性7受体损害ATP-induced il - 1β从人类单核细胞释放。”免疫学杂志,卷172,不。6,3399 - 3405年,2004页。视图:谷歌学术搜索
  23. i . p . Chessell j.p.孵卵,c . Bountra et al .,”P2X中断7purinoceptor基因破坏慢性炎症和神经性疼痛。”疼痛,卷114,不。3、386 - 396年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  24. s . Adriouch c·阿霉素、诉Welge m·西曼f . Koch-Nolte和f . Haag前沿:自然P451L突变在胞质域损害鼠标P2X的功能7受体。”免疫学杂志,卷169,不。8,4108 - 4112年,2002页。视图:谷歌学术搜索
  25. h . Le Stunff r .钻、j . Kanellopoulos和m . n . Raymond“pro - 451在P2X c端尾部的低浓缩铀多态性7受体细胞死亡,但不激活磷脂酶D小鼠胸腺细胞,”生物化学杂志,卷279,不。17日,第16926 - 16918页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  26. m . Solle j . Labasi d . g . Perregaux et al .,“改变小鼠的细胞因子的生产缺乏P2X7受体。”生物化学杂志,卷276,不。1,第132 - 125页,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  27. s . r . j .泰勒,m . Gonzalez-Begne d·k·索伊卡et al .,“从P2X淋巴细胞7有缺陷的小鼠表现出增强的P2X7反应”,《白细胞生物学,卷85,不。6,978 - 986年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  28. 答:尼克,y . h . Kuan m . Masin et al .,”功能P2X7剪接变体与另一个跨膜域1逃P2X基因失活7淘汰赛老鼠。”生物化学杂志,卷284,不。38岁,25813 - 25822年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  29. r·r·汉森c·k·尼尔森P2X纳赛尔et al。。7receptor-deficient老鼠易患骨癌疼痛。”疼痛,卷152,不。8,1766 - 1776年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  30. w·g .投影机l·r·多纳休c·j·罗森和d . j . Baylink”遗传变异性在成人骨质密度近交品系的小鼠中,“骨,18卷,不。5,397 - 403年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  31. f .可•福尔兰正c . Galbiati n r·约根森et al。”尿激酶纤溶酶原激活物受体影响骨骼内稳态通过调节成骨细胞和破骨细胞功能,“骨和矿物质研究杂志》上,22卷,不。9日,第1396 - 1387页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  32. 吴x m·a·麦肯纳x冯,t·r·纳吉和j·m·麦克唐纳”破骨细胞凋亡:Fas的角色在活的有机体内和在活的有机体内”,内分泌学,卷144,不。12日,第5555 - 5545页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  33. a . Gartland k·a·巴克利w·b·鲍勒和j·a·加拉格尔的“封锁造孔P2X7受体抑制人类多核破骨细胞的形成在体外”,钙化组织国际,卷73,不。4、361 - 369年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  34. j . Korcok l . n . Raimundo h . z Ke, s·m·西姆斯和s·j·迪克森,”细胞外核苷酸通过P2X行为7受体激活NF -κB在破骨细胞,”骨和矿物质研究杂志》上,19卷,不。4、642 - 651年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  35. r·伊格莱西亚斯s Locovei P2X罗克et al。。7receptor-Pannexin1复杂:药理学,信号。”美国生理学杂志》上,细胞生理学,卷295,不。3,C752-C760, 2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  36. s . Locovei大肠scem f .秋d . c .喷雾和g·达尔,“Pannexin1 P2X的孔隙形成单位的一部分7死亡受体复杂。”2月的信,卷581,不。3、483 - 488年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  37. d·布拉夫·Pelegrin和n·j·罗斯韦尔Pannexin-1-dependent caspase-1激活和il - 1的分泌β是由锌。”欧洲免疫学杂志,39卷,不。2、352 - 358年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  38. p . Pelegrin和a . Surprenant Pannexin-1介导大孔隙的形成和interleukin-1β释放的ATP-gated P2X7受体。”EMBO杂志,25卷,不。21日,第5082 - 5071页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  39. d . n .生鱼片”Interleukin-1和骨代谢:回顾”,牙周病学杂志》,卷64,不。5、补充,416 - 431年,1993页。视图:谷歌学术搜索
  40. h·l . Uy m .达拉斯,j·w·卡兰德b·f·博伊斯g·r·芒迪的观点,和gdp卢德曼,”使用在活的有机体内模型确定interleukin-1对细胞的影响在不同的阶段在破骨细胞谱系,”骨和矿物质研究杂志》上,10卷,不。2、295 - 301年,1995页。视图:谷歌学术搜索
  41. r . Coutinho-Silva t·罗布森、p .比尔和g . Burnstock”P2X表达的变化7受体在NOD小鼠胰腺的糖尿病的发展,“自身免疫,40卷,不。2、108 - 116年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  42. b·l·里格斯、美国科斯拉和l . j·梅尔顿”性类固醇和成人骨骼的建设和保护,”内分泌检查,23卷,不。3、279 - 302年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  43. 路特,美国t . d .元,r . a .权力和t . j . Wronski”Strain-dependent松质骨的反应的变化在小鼠卵巢切除术,”骨和矿物质研究杂志》上,21卷,不。7,1068 - 1074年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
  44. m . l . Bouxsein k . s . Myers k·l·舒尔茨l·r·多纳休c . j . Rosen和w·g .投影机”Ovariectomy-induced骨质流失不同近交品系的小鼠中,“骨和矿物质研究杂志》上,20卷,不。7,1085 - 1092年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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