超顺磁的双官能磷酸盐纳米粒子:一个潜在的核磁共振对比剂对骨质疏松症的治疗和诊断

文摘

骨头目标综合报道这里结合磁性造影剂对磁共振成像(MRI)和治疗代理(磷酸盐)成一个药物输送系统。这个新目标nanoplatform包括超顺磁的纳米粒子结合,5-dihydroxy-1 5 5-tris-phosphono-pentyl-phosphonic酸(di-HMBPs)分子二磷酸盐函数在纳米颗粒表面的外骨靶向。as-synthesized纳米颗粒被评价为一个特定的核磁共振对比剂通过吸附研究羟磷灰石和核磁共振测量。的强烈吸附磷酸盐纳米羟磷灰石及其作为核磁共振对比剂被证明。在人类骨肉瘤细胞的细胞测试执行(MG63)显示@di-HMBP混合纳米材料没有citoxity效应细胞的生存能力,可以作为诊断和治疗系统。

1。介绍

磷酸盐展览一个强大的亲和力,骨骼和通常用于治疗骨吸收和其他骨疾病如佩吉特氏病,骨质疏松症,或肿瘤引起的骨质溶解1]。绑定骨矿物质取决于P-C-P结构和增强了包括羟基(羟基亚甲二磷酸盐,称为HMBP文本)。这可能是由于tridendate绑定羟基取代钙磷酸盐。相反,在缺乏一个羟基,提供钙晶体bidendate绑定,绑定亲和力有显著降低(2]。因此HMBP分子,如Alendronate (4-amino-1-hydroxybutylidene bisphosphonic酸),抑制osteoclast-mediated骨吸收(3]。与近期的事态发展在磁共振,体内研究显示患者和没有,osteoroporotic骨折可以更好的被分离与骨结构参数通过MRI BDM [4]。分子成像、纳米粒子的使用成为非常退出nanoobjects许多功能可以添加到粒子的表面。更具体地说,超顺磁性氧化铁(5)(SPIO,水力直径50 nm)和超小超顺磁性氧化铁(USPIO,水力直径50 nm)介绍了粒子作为磁共振成像造影剂钆螯合物后,目前似乎更相关的代理比Gd螯合物由于高信号先生单位的金属。这些粒子是由成千上万的铁原子,他们击败固有的核磁共振对比剂灵敏度低,从而可以发现在微摩尔的铁的浓度。此外铁离子的毒性远远低于钆和可以重复使用或回收的细胞对铁代谢(使用正常的生化途径6,7]。我们之前的研究表明,二磷酸盐1-phenyl-1-hydroxymethylene-1等1-phosphonic酸(HMBP-COOH) [8()或1-hydroxy-2) - imidazol-1-yl ethylidene-1, 1-bisphosphonic酸(zoledronate) [9]对氧化铁纳米粒子作为非常有效的配体。在季铵二磷酸盐涂层氧化铁纳米晶体,它已经表明,该混合纳米晶体(10]给出足够的血液remanance和弱肝脏捕获的性能。没有明显的解吸涂料分子是钢板上观察到。在最近的工作11)已经表明,预处理的金属合金表面水polyallylamine二磷酸盐溶液(BP -…)导致的形成一个分子bisphophonate层允许附件通过胺终止函数向量粘合剂的治疗基因传递。30天的潜伏期后,层不改变表明BP解吸再吸收的分子机制似乎不太可能。在本文中,提出了一个创新的方法,导致纳米颗粒结构的优化来实现选择性的目标成像和治疗骨质疏松症。超顺磁的纳米颗粒表面钝化使用双官能钝化剂如1、5-dihydroxy-1, 5, 5-tris-phosphono-pentyl-phosphonic酸(文本、打电话di-HMBP方案1)。一个HMBP功能配合物纳米晶体表面,另一个允许骨外表面定位。一个稳定的铁磁流体(@di-HMBP)获得大浓度和pH值范围内。磁芯上的大量HMBP功能粒子有很强的亲和力的羟磷灰石,可用于骨靶向。过程的可行性,证明了混合纳米钙离子的络合和羟磷灰石和使用核磁共振成像。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

红外光谱被记录在一个热的那些时光380电子公司Nicolet FTIR (KBr颗粒)。被记录在一个50瓦里安卡里紫外可见光谱扫描紫外可见分光光度计。透射电子显微镜(TEM)使用飞利浦CM10进行测量。核磁共振光谱在200 MHz瓦里安双子座光谱仪获得化学变化被报告为ppm trimethylsilane作为内部标准。电动电势的大小和nanocomplex是由动态激光光散射(DLS) Nano-ZS(红色标志)禅宗3600设备(莫尔文乐器,莫尔文英国。所有化学产品用于纳米颗粒和二磷酸盐分子从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。微孔H₂O是用于所有水溶液的制备。

2.2。合成(1 5-Dihydroxy-1 5 5-Tris-Phosphono-Pentyl)膦酸(12](Di-HMBPs)

在50毫升圆底three-neck瓶配备一个温度计,glutaryl氯(18更易)添加一滴一滴地,在氩亚磷酸三(三甲基硅烷基)(72更易)。除了完成时,反应混合物被允许站在室温1小时。的进化反应被监控 核磁共振。然后,挥发性分数在减压蒸发(0.1托)在甲醇分解(20毫升)。蒸发后,原油产品在二乙醚沉淀和冻干。纯产品获得了95%的收益率。核磁共振(161.9兆赫,)δ19.3,核磁共振(400.1兆赫,)δ1.78 - -2.05 (m, 6 h, C(哦)- ()₃- c (OH)),核磁共振(100.6兆赫,)δ18.1 (-- - - - - -- - - - - --),34.0 (-- - - - - -- - - - - --),73.2 (t)= 143.7赫兹,pci (OH) - p)。

2.3。的合成@Di-HMBP纳米晶体

准备noncoated粒子,第一步是添加一个解决方案二甲胺40%的水十二烷基硫酸亚铁的水胶束溶液(0.61克,摩尔)。解决方案是大力搅拌2小时以及由此产生的沉淀的裸纳米晶体是孤立的上层清液离心分离。在第二步中,沉淀用酸性溶液(盐酸10⁻¹ )和di-HMBPs分子的溶液(摩尔在30毫升的水)补充道。解决方案是在室温下搅拌了两个小时。出现的沉淀与酸性溶液(盐酸洗10⁻¹ )。免费HMBP隔绝涂层粒子由于磁场和离心。磁性纳米结晶涂层与di-HMBP分子分散在水中。初始pH值等于4 pH值,然后逐渐增加到7.4添加氢氧化钠氢氧化钠(10⁻¹ )。推导出铁浓度紫外可见吸收。

2.4。纳米晶体的表面特征

红外光谱是用来证明纳米晶体表面络合通过膦酸酯组。推导出平均每个纳米晶体的分子数核磁共振光谱。一系列浓度的自由di-HMBP(核磁共振 (80.9兆赫):19.17 ppm解决方案添加(在毛细管,10⁻¹ ;核磁共振 (80.9兆赫):0 ppm)是准备校准。di-HMBP分子远离磁场通过添加氢氧化钠氢氧化钠(1纳米颗粒)为了避免的转变核磁共振信号。上层清液进行了分析核磁共振和浓度(每纳米晶体的分子数)的di-HMBP样本推导出从这个校准阴谋。

2.5。的大小和表面电荷的分析@Di-HMBP纳米晶体

平均粒径由透射电子显微镜。胶体悬浮液直接沉积到碳涂层铜网格。电动电势的大小和nanocomplex是由动态激光光散射(DLS) Nano-ZS(红色标志)禅宗3600设备(莫尔文乐器,莫尔文英国。分析了每个样本与稀释铁磁流体在室温下((Fe) = 在pH = 7.4)。

2.6。钙络合滴定法

标准程序与羊毛铬黑色T(光大通信)是用来量化在溶液中钙离子的数量。光大通信的混合@di-HMBP(或免费di-HMBP)水溶液((Fe) = 在pH值10。这个解决方案是与钙溶液滴定([]= ),直到颜色解决方案改变从免费di-HMBP蓝色,粉色和绿色,棕色@di-HMBP粒子的解决方案。颜色的变化是由于光大通信之间的络合作用和钙离子。然后大量的钙离子与推导出HMBP功能。

2.7。磁性和磁共振成像

as-synthesized纳米颗粒的磁性行为特点是使用读者(Magnisense)。MIAplex读者(13)措施的非线性响应磁标签时接触到多频交变磁场。这个特定的签名(14)是基于B (H) / d。

试管的MR成像是使用4.7 T磁共振扫描器执行(力量)。T1弛豫时间的测量轴自旋回波(SE)序列得到用TR值10000 ms的TE 16女士在4.7 T。测量的放松,轴向三SE图像得到的TR 800 ms和TE 6.4毫秒的4.7 T。

2.8。体外羟磷灰石的目标

的冻干羟磷灰石(15]Ca / P比值等于1,64。哈哈(10毫克/毫升)悬浮在5毫米@di-HMBP索尔0,4毫克/毫升(Fe =米)。然后用HA纳米粒子是孵化和动摇在24小时。与一个注射器过滤器过滤和水洗后为0.45孔隙大小,HA resuspended溶胶和冻干红外光谱。纳米粒子的浓度保持在水中悬浮被UV / VIS分光光度计测量350和480海里的计算量哈。

2.9。细胞生存能力

人类骨肉瘤细胞(MG63)线在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM英杰公司)补充10%小牛血清。MG63 osteoblast-like细胞用于本研究得到来自美国文化(写明ATCC集合类型CRL 1427)。

使用MTT细胞生存能力评估(3 - (4 5-Dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium)测定在第一天,第三天,第五天。细胞被播种密度细胞/在乘96孔板(猎鹰,斯特拉斯堡,法国),在完全培养基孵化1,3,5天。然后,介质被删除,取而代之的是10% FCS-medium包含增加浓度@di-HMBP纳米晶体。后1、3和5天的孵化,细胞用磷酸缓冲盐(PBS,英杰公司)和孵化0.1毫升的MTT(2毫克/毫升,Sigma-Aldrich)额外的4小时。不溶性产品然后添加DMSO溶液溶解(Sigma-Aldrich)。光密度测量在570 nm使用微型板块女士Labsystems多屏幕阅读器。每个体外实验进行了三次,有四个井每样本实验。

2.10。电池标签

活细胞的标记是评估使用普鲁士蓝染色@di-HMBPs纳米晶体。普鲁士蓝染色的原理是三价铁()在亚铁氰化物的存在离子沉淀高度有色和高度不溶于水的复杂,钾铁氰化物、普鲁士蓝。24小时的细胞培养eight-well室幻灯片的存在与否@di-HMBPs纳米晶体。与PBS的细胞被洗了三次,固定与丙酮(10分钟)和干在室温20 mn。贴壁细胞单层孵化与5%亚铁氰化钾(5分钟),用PBS然后再孵化亚铁氰化钾溶液含有5%和10%盐酸10分钟和蒸馏水清洗三次。铁粒子在细胞被观察到蓝点使用光学显微镜相衬。

3所示。结果与讨论

功能化纳米粒子在纳米技术应用中起着重要作用。计划1描述了程序设计一个新的MRI纳米骨靶向药物输送。小纳米晶体为超顺磁的行为和选择高T2对核磁共振对比剂的敏感性。1,5-dihydroxy-1 5 5-tris-phosphono-pentyl-phosphonic酸(di-HMBPs)为两个HMBP功能:选择一个HMBP一部分作为增粘剂表面和第二目标函数由于亲和力强骨。我们的方法需要两个HMBP功能分子是由一个短的间隔分开,避免了纳米颗粒与两个HMBP根锚定,导致纳米粒子聚合和丢失的具体骨靶向。

磁赤铁矿纳米晶体是准备像前面描述的那样16由软化学)。的合成,在水中di-HMBP溶液pH值4添加到纳米颗粒分散。酸碱然后逐步增加到7.4添加氢氧化钠氢氧化钠,从而实现稳定的纳米颗粒分散。

冻干透析后,分散的解决方案。粉很容易分散在水中和纳米粒子溶胶稳定在一个范围广泛的pH值(4 - 12)和浓度(超过40 wt %),在合适的离子强度(0.6等各种生物缓冲)和PBS和消息灵通的。TEM图像(插入图1)的沉积纳米晶体表明平均直径和多分散性,分别等于11 nm和20%。

红外光谱分析(图1膦酸酯组)表明,高度与纳米颗粒表面的交互。

自由HMBP-COOH分子(蓝色曲线),P-O拉伸区域内(1200 - 900厘米¹),光谱展览两个高峰在1172和900厘米⁻¹分配给P=O和警:哦,分别17]。宽带1071厘米⁻¹振动模式的特点吗集团(18]。

比较@di-HMBP纳米晶体(红色曲线)和自由di-HMBP解决方案(蓝色曲线),大的变化观察P-O拉伸区域内(1200 - 900厘米⁻¹)表明,膦酸酯之间的强相互作用headgroup和表面存在。这些结果是一致的氧化膦酸酯绑定到表面(19),我们可以建议中的铁原子粒子表面是由氧原子协调从膦酸酯组20.]。

核磁共振滴定法的使用是为了量化分子/纳米晶体的平均数量。2100年的平均数量100 di-HMBP分子/纳米颗粒,对应0.1当量/铁离子(约0.3表面铁离子)。

动态光散射是用来描述电动电势和水动力直径。这个测量表明颗粒表面电荷的物种,它扮演重要的角色在决定解决方案稳定、易聚合和降水问题,以及体内蛋白质和细胞表面绑定。在生理的pH值,@di-HMBPs粒子表现出消极的电动电势(−54 mV)和水动力直径36海里表明一些聚合物的存在(意思是结晶的核心11海里)。负电荷表面显示的存在自由粒子的磁芯HMBP功能(计划1)。确定的数量免费HMBP,我们使用标准比色测试的程序演绎钙离子的数量每复合体@di-HMBP纳米颗粒。3.8免费di-HMBP分子,我们发现钙离子包裹每个分子意味着每个HMBP功能可能复杂2钙离子。发现钙离子/纳米复合体的数量等于3100200年。考虑到每个HMBP功能可能复杂的钙离子,1550免费HMBP /纳米颗粒的数量。这个结果符合核磁共振测量导致2100 HMBP /纳米颗粒。因此,自由HMBP功能纳米颗粒的外表面应该允许他们的骨靶向和骨矿物质密度的增加。

这些纳米颗粒的磁性研究使用读者。

磁化的二阶导数B (H) / d(图2),提出了一个最大值和一个最小值没有磁滞回线。这个特定的磁性签名是低偶极相互作用的粒子的超顺磁的行为特征(21]。这个超顺磁的行为允许使用这些粒子为核磁共振造影剂。

探讨先生信号增强效果,水和纳米颗粒在不同铁浓度在4.7 T磁共振扫描仪测定。如图3(一个)T1和加权图像变化剧烈和越来越多的纳米粒子信号强度,表明合成纳米粒子生成对比先生在纵向(T1)和横向()质子弛豫时间加权序列。图3 (b)显示的是1 / T1和1 /放松利率作为铁浓度的函数。放松利率与铁浓度线性变化,如预期。纵向和横向relaxivities(对应的斜坡线)发现铁1.40毫米⁻¹年代⁻¹和295年菲毫米⁻¹年代⁻¹,分别。这样的值和表明HMBP涂布纳米粒子可以作为T1和造影剂考虑其体积小,但似乎更有利造影剂的大得多价值。

的因素之一,让HMBP最有效的BP药物是它的高骨吸收和保留,直接关系到其亲和力对羟磷灰石(22(HA)。演示的具体目标@di-HMPBs纳米骨,体外试验标准(12)进行展示这些新核磁共振造影剂的强大的亲和力与羟磷灰石。一个@diHMBP索尔((Fe) =米)与HA孵化使用0.45,然后分开洗m过滤器。的绑定能力as-synthesized nanocomplexes研究用紫外可见和红外(图4)光谱。如图所示插入图4,HA的改变颜色从白色到布朗表示@di-HMBPs HA与高亲和力结合由于高铁纳米颗粒在哈。纳米粒子的浓度保持在水中悬浮的紫外可见分光光度计测定350和480海里的计算量哈。推导出绑定=毫克每毫克的HA纳米颗粒(eq。0.19毫米每毫克HMBP公顷)。图4的红外光谱显示哈(蓝色曲线)和孵化哈@diHMBP纳米颗粒(红色曲线)。

HA光谱(红色曲线)展品不同波段之间1250 - 600厘米¹在HA是P-O拉伸区域的特征(10]。HA nanocomplex, P-O拉伸区域的分析复杂是因为强大的背景HA矩阵的吸光度(ν(PO4)) (23]。HA与孵化@di-HMBP(蓝色曲线),P-O拉伸区域扩大与最初的哈。这显然很难分配这种效果。显然,需要更多的实验来阐明纳米颗粒表面成键的确切机制公顷。

纳米晶magnemite中推导出的紫外可见光谱和棕色(插入图4孵化的哈@di-HMBP纳米晶体建议选择性的交互nanocomplex哈,然后骨头的潜在目标。

为了评估对骨肉瘤细胞生存能力我们进行可行性测试mg - 63细胞,癌症,但相关的模型来研究高效成骨细胞的细胞系的行为(24]。as-synthesized纳米晶体是孵化与MG63骨肉瘤细胞precultured 24小时,3天,5天为各种胞外铁浓度可达3(1情商。di-HMBP)。MG63细胞的增殖是MTT分析如图所示5)。

三倍的孵化,MTT扩散试验表明成骨细胞细胞的正常生长。没有观察到的细胞毒。确定细胞内吸收@di-HMBPs纳米晶体,蓝色普鲁士成像进行人类MG63细胞(数字5(一个)和5 (b))。铁粒子进入细胞观察与相衬蓝点使用光学显微镜(图5 (b))。这幅图表明,细胞内的均匀的纳米晶体的内化。因此,@di-HMBPs纳米晶体可以作为诊断和治疗系统。一个完整的生物研究进展了解这种纳米颗粒治疗骨质疏松症的机理和诊断。这项工作的目的是描述纳米颗粒蛋白表达模式的影响成骨细胞的分化和矿化有关,生存能力,重塑的细胞结构,细胞粘附,装配在人类正常细胞的细胞外基质。

4所示。结论

bone-targeted核磁共振成像对比剂设计与超顺磁的纳米颗粒和二磷酸盐半个。HMBP功能展品高铁和钙络合效应。这样的综合测试可行性,这个系统被多元羟磷灰石证明骨靶向和增加骨密度降低主要骨质疏松性骨折的发生率。此外,这种纳米颗粒的超顺磁的行为让他们作为核磁共振对比剂以提高骨质疏松症的诊断治疗。

确认

作者感谢美国Sarda博士和c·雷伊(5085年CIRIMAT-UMR CNRS)提供羟磷灰石,美国博士Changotade提供他们的成骨细胞的细胞和公关。d . Lutomski(3043年CSPBAT-FRE CNRS)富有成果的讨论骨成骨分化的目标和具体的步骤(工作)。这项工作是支持由Magnisense公司一部分。

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