文摘

胰岛素抵抗,从而影响胰岛素敏感组织,包括脂肪组织,骨骼肌、肝脏,病理生理机制2型糖尿病进展。降低胰岛素敏感组织葡萄糖摄取干扰胰岛素信号通路,特别是PI3K / Akt通路。一个在体外模型是适合研究胰岛素抵抗细胞和分子机制,因为它是易于维护,结果可以很容易地复制。细胞模型的应用探索糖尿病和胰岛素抵抗的发病机制以及开发药物这些条件是众所周知的。然而,一个全面的回顾在体外胰岛素抵抗模型缺乏。因此,本文进行了最新的提供全面的概述和总结在体外胰岛素抵抗模型,特别是3 t3-l1 (preadipocyte) C2C12(骨骼肌)和HepG2(肝)细胞株与棕榈酸诱导,高葡萄糖,或慢性暴露于胰岛素。

1。介绍

胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要原因(T2D),这是与肥胖和代谢综合征(1]。T2D患者,胰岛素抵抗,从而影响胰岛素敏感组织(例如,脂肪组织,骨骼肌和肝脏),是中央病理生理机制T2D进展(2]。胰岛素抵抗的发病机制与游离脂肪酸(FFA)积累,增加肝葡萄糖生产,减少葡萄糖吸收胰岛素敏感组织(3]。受损的脂肪酸代谢的调节中扮演着重要的角色在骨骼肌胰岛素抵抗的发病机制。此外,在胰岛素抵抗的情况下,线粒体氧化磷酸化过程中缺陷被发现在骨骼肌1]。线粒体是产生能量的细胞器的脂肪。因此,线粒体功能缺陷诱发异位脂肪堆积,导致胰岛素抵抗的发展。此外,FFA积累或高血糖的条件触发过多的活性氧(ROS)在线粒体由于生产减少线粒体功能。高水平的ROS进一步抑制脂肪组织胰岛素的行动和肌管以及抑制insulin-mediated IRS-1和PI3K的重新分配,从而减少3 t3l1细胞GLUT4转位(4]。越来越多的证据表明,减少葡萄糖吸收胰岛素敏感组织干扰胰岛素信号通路(5]。磷脂酰肌醇的3-kinase PI3K / Akt通路已经被认为是一个重要的信号通路介导胰岛素的代谢影响,与一种蛋白激酶(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)作为关键效应分子(5]。

一般来说,动物模型发展的至关重要的小说和有效治疗某些疾病,如糖尿病。因为动物是生物与人类相似,它们通常利用在各种糖尿病研究[6]。同时,在临床前研究中使用的动物模型是一个耗时的协议维护成本高、住房、和繁殖。它还引发了道德问题关于动物的不道德的协议处理。全球动物权利活动家反对使用动物的研究,呼吁研究人员找到替代方法,可以缩短的同时减少动物模型用于筛选候选药物。为了克服这个限制,大量的新知识在体外技术被称为“另类”或“替代”的动物模型在药物开发研究中设计和实现。这一替代的好处包括减少使用动物模型,获得立即的结果,降低研究成本,控制实验变量的可能性(7,8]。利用在体外细胞培养在实验室环境中可以维护一个有价值的替代动物模型。的在体外技术是简单和容易理解。它也花费更少的时间,更少的昂贵;因此,它可能是一个潜在的解决方案解决3 r原则(降低、细化和替换)的动物模型研究[8]。虽然替代动物模型,包括在体外模型,有限制,比如不能代表动物的彻底的代谢反应和有限的能力来确定药物的药物代谢动力学情况或随后的代谢物,替代方法,特别是在体外模型,需要克服动物模型的局限性,尤其在道德方面考虑(7,8]。

一个在体外模型适用于研究胰岛素抵抗,因为细胞和分子机制在体外模型是易于维护,结果可以很容易地复制。细胞胰岛素抵抗模型允许所有参数,包括细胞外环境和文化条件,更精确控制和监控在活的有机体内胰岛素抵抗模型。此外,一个在体外胰岛素抵抗模型可以避免组织相声。几个在体外胰岛素抵抗模型已经应用但不同诱导物。可以使用各种胰岛素抵抗诱导物在体外胰岛素,包括慢性暴露、地塞米松促炎细胞因子,发病和缺氧。之前虽然慢性接触胰岛素是最常用的在体外胰岛素抵抗研究最多在体外胰岛素抵抗模型现在利用FFA暴露,尤其是棕榈酸接触(9]。

再研究使用在体外模型有助于探索糖尿病的各个方面。此外,评估葡萄糖吸收仍然是一个有效的和可靠的方法测量生物细胞对胰岛素的反应刺激(10]。细胞模型已经广泛应用于探索糖尿病和胰岛素抵抗的发病机制以及开发药物对这些条件。然而,一个全面的回顾在体外胰岛素抵抗模型仍然缺乏。本文提供了一个全面的概述和总结最新的在体外胰岛素抵抗模型,从而帮助研究人员在决定细胞模型可用于胰岛素抵抗的分子研究。本文也将支持胰岛素敏化剂的药物发现的候选人。

2。材料和方法

进行了广泛的文献检索在PubMed和斯高帕斯数据库使用关键字如“在体外模型和胰岛素抵抗”、“棕榈酸诱导和胰岛素抵抗,”“高葡萄糖感应和胰岛素抵抗,”“慢性暴露和胰岛素抵抗,胰岛素”“C2C12和胰岛素抵抗,”“HepG2和胰岛素抵抗,”和“3 t3-l1和胰岛素抵抗。”

从上述数据库,我们确认相关的文章在体外胰岛素抵抗模型。此外,文章分类的基础上在体外诱导的胰岛素抵抗模型:棕榈酸(1),(2)高浓度的葡萄糖、胰岛素和(3)慢性暴露,连同每个诱导物引发胰岛素抵抗的机制。大多数文章发表在过去的十年中,仅局限于英语。

3所示。结果与讨论

3.1。胰岛素抵抗模型的细胞系

在科学研究、细胞系带来了一场革命由于他们的相似性主要组织,成本低、简单的应用程序,和简单的培养技术。此外,细胞系提供无限供应的生物材料,其使用最小化与使用相关的伦理问题的动物和人作为研究对象。细胞系已广泛用于疫苗生产、细胞毒性分析,药物代谢通路识别、和治疗性蛋白质合成11]。在这里,我们描述和总结几种细胞系作为在体外胰岛素抵抗模型。

3.1.1。3 t3-l1细胞系

3 t3-l1细胞系的preadipose细胞系来自瑞士3 t3小鼠胚胎年龄在17到19天并显示呈形态。3 t3-l1细胞系可以表现出一个adipocyte-like表型在适当的条件和环境下(12]。脂肪细胞葡萄糖代谢过程中发挥核心作用[13]。脂肪组织也是一个重要的组件,它响应胰岛素刺激;因此,它有助于确定进展对胰岛素抵抗[14]。

胰岛素在各种代谢过程中起着举足轻重的作用的脂肪组织,包括葡萄糖吸收,新创脂肪生成、脂肪形成和脂类分解抑制(图1)。胰岛素促进葡萄糖吸收的脂肪细胞通过调节GLUT4转位的能力。胰岛素也会增加脂肪生成,通过SREBP1c和PPAR脂肪形成γ分别刺激。此外,荷尔蒙脂肪酶的活性降低胰岛素的影响下,导致脂类分解抑制。3 t3-l1细胞在基底条件下,70% - -90%的GLUT4在GLUT4储存囊泡(GSV) [15]。胰岛素诱导10-20-fold报道的膜细胞GLUT4易位3 t3-l1,已知完全分化成脂肪细胞(16]。PI3K / Akt pathway-associated AS160触发释放从GSV GLUT4和易位。AS160是Akt的主要目标之一,起着至关重要的作用在刺激GLUT4易位过程。AS160一种蛋白激酶磷酸化的抑制其功能稳定GSV GLUT4,从而导致GLUT4的释放和易位17]。激活mTORC1促进SREBP1c的感应和Akt刺激下脂肪生成18]。在脂肪细胞,Akt-associated mTORC1激活触发器通过PPAR通过SREBP1c脂肪生成和促进脂肪生成γ(19]。

3 t3-l1完全分化细胞(脂肪细胞细胞)作为代表在体外模型,可以用来理解分子的葡萄糖代谢的过程(13]。值得注意的是,3 t3-l1细胞被广泛实现为一个胰岛素抵抗模型,主要是胰岛素引起的风险在体外(14]。一般来说,3 t3-l1细胞与成纤维细胞表型需要脂肪形成的代理,如地塞米松(DEX)的组合,3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)和胰岛素浓度为0.25μ米、0.5毫米和1μ向脂肪细胞分化分别g / mL。另一项研究显示,添加2μM的罗格列酮,除了前面提到的脂肪形成的代理的组合,成功地诱导3 t3-l1在10到12天内细胞分化。此外,敏捷和troglitazone报道诱导分化3 t3-l1 preadipocytes在更短的时间比IBMX和敏捷。接触敏捷和troglitazone增加脂滴堆积和葡萄糖吸收由GLUT4 112%和137%,分别与3 t3-l1细胞的分化诱导由传统方法(12]。

关于他们的文化,分析可扩展性,再现性分化的能力达到100%在优化条件下,3 t3-l1细胞已成为最常用的preadipocyte模型对脂肪细胞的研究开发和生物学(20.]。新孤立的成熟脂肪细胞相比,3 t3-l1可以维持更多的段落,有均匀的细胞群。因此,这些细胞一致应对治疗和实验条件的变化。与此同时,3 t3-l1模型具有一定的实际限制,包括首次亚文化以及所需的时间这一事实去至少需要两个星期。此外,当3 t3-l1细胞达到融合或都进行了广泛的通道,他们不再分化成脂肪细胞,很难使转染,未能重建主要细胞培养模型的特色因为这个细胞系来源于单个克隆(12]。这应该被认为是实现3 t3-l1作为时在体外研究模型,特别是对代谢性疾病,如糖尿病。

越来越多的证据的基础上,研究人员可能决定使用3 t3-l1细胞系机制的更深入的了解脂肪细胞的胰岛素抵抗,导致2型糖尿病的发展。此外,可以使用3 t3-l1细胞在体外开发新药与特定目标参与脂肪细胞胰岛素抵抗的发病机制。然而,实际的应用3 t3-l1应考虑合适的分化培养基和细胞的成熟所需的时间。此外,脂肪生成是一个暂时的依赖的过程。因此,有必要理解机制在脂肪细胞分化的不同阶段。

3.1.2。C2C12肌管细胞系

1977年,成肌细胞C2细胞首先阐明分子机制基本肌肉萎缩症在体外。从那时起,C2C12 subclone已被广泛用作探索骨骼肌细胞培养模型21]。此外,C2C12 insulin-responsive细胞系,作为一个有用的模型研究胰岛素抵抗的机制。胰岛素抵抗之间的联系和其他代谢条件也可以使用C2C12细胞行调查。它也作为一个模型对于发展中重要的药物和研究药物运载系统(22]。

在所有胰岛素敏感组织中,骨骼肌中扮演着一个关键的角色在超过75%的葡萄糖利用过程中针对胰岛素,特别是餐后状态。此外,在骨骼肌胰岛素抵抗被认为是一个重要条件是影响发展的系统性胰岛素抵抗[23]。

胰岛素调节骨骼肌代谢,尤其是葡萄糖运输和糖原合成与PI3K / AKT信号通路(图2)。一系列磷酸化和PI3K / AKT激活骨骼肌胰岛素敏感条件下发生。Akt激活可以直接使磷酸化和灭活AS160,从而引发GLUT4的易位GSV细胞膜促进葡萄糖吸收。此外,AKT激活增强糖原合成通过GSK-3骨骼肌β抑制。AKT稳定糖原合成酶(GS)诱导糖原生成一个活跃的状态。因此,受损PI3K / AKT信号通路的失调会导致葡萄糖运输和糖原合成,这是必不可少的胰岛素抵抗和2型糖尿病的发展。PI3K / AKT信号通路也被认为是发生在C2C12肌管,代表骨骼肌细胞(24]。

随着主要肌原性的细胞,鼠标C2C12和16种细胞是最常用的为探索骨骼肌细胞模型在体外。细胞系成肌细胞,尤其是C2C12细胞,是行之有效的在体外模型被转基因;因此,他们可以无限增殖,分化成包含肌纤维肌管,和收缩蛋白表达。C2C12和16种成肌细胞可以完全分化成肌小管表达insulin-responsive GLUT4,这是至关重要的在促进肌纤维刺激葡萄糖摄取。肌纤维的主站点insulin-induced在餐后葡萄糖吸收状态。的积累循环FFA和炎性细胞因子可以直接影响胰岛素信号通路在肌纤维25]。

C2C12——L6-based在体外模型表现出的潜力代表胰岛素抵抗和T2D-related代谢紊乱,因为这些细胞系维护关键的胰岛素信号通路,如IRS-1 PI3K, AMPK, mTOR,和一种蛋白激酶,以及高水平的过剩蛋白表达。在体外暴露小鼠成肌细胞或肌管高葡萄糖胰岛素增加了我们的见解机制失调的血糖和胰岛素骨骼肌。这使我们能够区分异常升高的不利影响在骨骼肌葡萄糖和/或胰岛素其他T2D致病机制的影响,包括脂肪浸润和炎症(26]。

C2C12细胞表现为有核和纺锤形细胞成肌细胞。在培养这些细胞在合适的媒体,他们进行细胞融合形成多核结构。还C2C12细胞迅速分化为肌管,表现出细长的纤维在分化后维护媒体(22]。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含有葡萄糖,胎牛血清(的边后卫)和抗生素可以利用增长C2C12成肌细胞。达到融合后,切换到low-FBS或马血清(HS)文化可以诱导C2C12分化成肌管(25]。C2C12成肌细胞为多核肌管的形态变化,配备了一个肌动蛋白细胞骨架已确认通过共焦显微镜和免疫荧光染色(22]。

尽管C2C12的广泛使用增加了我们理解T2D病理生理学,细胞线在精确复制的能力局限在人类发现的复杂的基因档案和代谢功能障碍(26]。转录组分析显示,C2C12肌管和主人类肌管都较低的基因编码葡萄糖转运蛋白水平和氧化能力低于16种肌管。16种肌管可能是更适合探索葡萄糖代谢及线粒体功能,而C2C12和人类肌管主要有独特的肌凝蛋白和糖原存储内容。因此,他们可能能更好理解运动/压力反应[27]。

可用的证据表明,主要的关键分析肌管文化密切代表骨骼肌的生理学。然而,它的应用程序是有限的,由于入侵过程的复杂性需要隔离。社会应激或C2C12肌管细胞系可以用来阐明目标分子与胰岛素抵抗和运动机制的调制与骨骼肌葡萄糖利用率有关为了理解分子发病机制和探索T2D的新药物化合物。哈佛的适当选择和C2C12模型以及主要肌原性的文化是高度依赖科学假说和进一步研究的生物学意义;这些事实应该考虑在选择适当的成熟的肌管作为在体外胰岛素抵抗模型。

3.1.3。HepG2细胞系

在各种肝细胞系,HepG2细胞首先显示肝细胞的主要特征。这些细胞在1975年被孤立和定义为肝癌或肝细胞癌。1980年,专利作为人类hepatoma-derived HepG2细胞细胞系威斯塔研究所的研究人员。这些细胞是来源于分化良好型的肝脏肝细胞癌的一个15岁的男孩11]。

内源性葡萄糖生产的主要来源,肝脏是一个重要的胰岛素靶器官。此外,重要的是调节系统脂质代谢和肥胖和T2D中介之间的交互。研究肥胖之间的关系的分子机制和肝胰岛素抵抗发病机理和研究脂肪肝的发展是重大挑战先进的生物医学研究(28]。

Hepatoma-derived细胞系表现出特定的肝细胞形态特征和表达hepatocyte-specific标记。因此,HepG2细胞行是一个比使用主肝细胞细胞培养更实用的选择。原发性肝细胞培养的准备需要动物主题,和无限增殖细胞的过程在技术上是比这更复杂的文化。此外,HepG2的可用性作为一个来自人体肝癌细胞株相当大的好处是由于有限的人类原发性肝细胞的可用性。因此,HepG2细胞线目前被用于一些研究涉及建模研究肝细胞胰岛素信号或代谢过程的分子机制28]。

肝细胞在糖质新生的重要作用已经被广泛地研究过了在胰岛素抵抗糖尿病,因为他们的失调状况。值得注意的是,HepG2细胞表达glucose-6-phosphatase (G6PC)和磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase (PEPCK) gluconeogenic酶(29日]。然而,HepG2作为胰岛素抵抗模型的应用程序有几个注意事项。糖质新生的抑制胰岛素在肝脏发生直接或间接通过脂解作用,减少流通的FFA和甘油糖质新生基质(30.]。此外,一个广泛的比较研究在胰岛素信号发生在原发性肝细胞肝癌细胞株,尤其是HepG2,需要验证使用的适宜性肝癌细胞系作为模型来阐明胰岛素信号和胰岛素对葡萄糖代谢28]。

肝脏胰岛素信号通路是由绑定的胰岛素胰岛素受体(IR),触发其激活通过自身磷酸化酪氨酸残基。红外激活触发器的磷酸化和激活下游分子,如IRS1/2 PI3K和一种蛋白激酶/蛋白激酶B (PKB)。一种蛋白激酶的激活在抑制GSK-3过程中发挥作用β在GS的失活。GS的活性状态进一步触发糖原合成。Akt激活还能抑制转录因子FOXO1因为它诱发FOXO1从细胞核进入胞液流出。这种射流抑制FOXO1活动,从而表达下调PEPCK和抑制糖质新生。此外,一些葡萄糖的流通都是通过肝脏GLUT2,紧随其后新创脂肪生成胰岛素刺激下(31日]。肝脏胰岛素信号通路也最有可能发生在HepG2细胞行显示hepatocytic表型(图3)。政府的诱导物干扰胰岛素信号通路触发HepG2细胞胰岛素抵抗。

糖尿病及其并发症可能导致病理改变在肝细胞损害肝脏功能。相比之下,激活胰岛素/ PI3K / Akt信号通路促进糖原合成,抑制肝脏中糖质新生,从而降低血浆葡萄糖水平(32]。这表明肝细胞胰岛素抵抗的发病机制中起关键作用。因此,HepG2细胞系可以提供一个有价值的工具,用于识别目标的候选药物胰岛素/ PI3K / Akt通路在肝脏。

3.2。诱导物的在体外胰岛素抵抗模型及其机制

3.2.1之上。感应的在体外胰岛素抵抗模型使用棕榈酸

近年来,利用棕榈酸诱导在体外胰岛素抵抗模型在几个细胞系已成为越来越受欢迎。研究芒果苷减轻胰岛素抵抗的能力由游离脂肪酸的积累,Zhang et al。33)使用C2C12和HepG2胰岛素抵抗模型,建立的暴露C2C12肌管或HepG2 0.25毫米棕榈酸解的无血清培养基FFA-free 1%牛血清白蛋白(BSA) 24小时33]。棕榈酸暴露之前,C2C12成肌细胞分化首先成C2C12肌管通过切换中有2%马在杜尔贝科的修改鹰血清培养基(DMEM)高葡萄糖。C2C12分化成一个多核肌管需要7 - 9天33,34]。

另一项研究使用0.75毫米的棕榈酸建立胰岛素抵抗模型在C2C12肌管。这个模型被用来研究Silibinin活动和抑制胰岛素抵抗的分子机制由棕榈酸(35]。棕榈酸的解决方案是由溶解棕榈酸0.1 M氢氧化钠和加热在70°C水浴颤抖。然后,棕榈酸溶液被稀释10% FFA-free BSA-DMEM和加热55°C到产生棕榈酸原液浓度的5毫米,当时过滤使用0.45毫米孔径膜过滤器。这个解决方案可以存储在−20°C和2周内使用。股票软脂酸解决方案必须在55°C加热15分钟,冷却到室温之前使用。的确切浓度氢氧化钠混合FFA-free 10% BSA被用作控制(35]。

的C2C12肌管暴露于各种饱和和不饱和脂肪酸被用来阐明分子机制FFA-related骨骼肌胰岛素抵抗。此外,GLUT4的实验参数。高脂肪饮食和过度FFA的积累循环逐步诱导外周胰岛素抵抗特征是GLUT4的易位受损,一个insulin-responsive骨骼肌葡萄糖转运体。饱和的负面影响远期运费协议,如棕榈酸酯,在骨骼肌异常相关积累一些脂质代谢产物,如甘油二酯和天然保湿因子,导致失调的丝氨酸/苏氨酸激活(36]。

在土屋的研究等。36后,首先,C2C12成肌细胞达到80% -90% confluency,这些细胞分化成C2C12肌管。分化是由取代分化的生长培养基介质组成的DMEM(4.5克/升的葡萄糖)补充2%的牛血清,1纳米胰岛素,30岁μ青霉素g / ml, 100μ克/毫升链霉素。分化培养基是改变每24小时。天4和5,C2C12细胞被完全分化成肌管,可以用于进一步的实验。胰岛素抵抗的感应是由孵化媒体包含FFA与DMEM补充2% FFA-free BSA如前所述[37]。总之,远期运费协议被溶解在乙醇和稀释的比例1:150年DMEM含有2% (w / v) FFA-free BSA和2%的牛血清。lipid-containing媒体孵化了1小时前在37°C接触C2C12肌管(36,37]。

多项研究表明,长链饱和脂肪酸,包括棕榈酸(PA),可以破坏胰岛素反应,从而抑制葡萄糖的吸收在骨骼肌细胞(38]。各种机制构成的负面影响骨骼肌自由FFA水平高,导致胰岛素抵抗[23]。PA暴露显著促进PKC的磷酸化θ、ERK和促炎细胞因子在骨肌管。这个过程进一步诱发胰岛素抵抗的发展(39]。

此外,孵化C2C12肌管与高浓度的PA(0.75毫米)16小时报道诱导肿瘤坏死因子-α蛋白表达,这表明PA在病理浓度可能发挥作用在影响TNF -的过度α当观察到胰岛素抵抗肌肉(40]。肿瘤坏死因子诱导的胰岛素抵抗α以上几种差别有关对这些蛋白质参与胰岛素信号通路。促炎细胞因子TNF -α据报道抑制红外自身磷酸化的反应与胰岛素刺激有关。此外,肿瘤坏死因子-α引发的对丝氨酸/苏氨酸磷酸化胰岛素受体底物1 (IRS-1),而抑制insulin-induced酪氨酸的磷酸化IRS-1 [41]。符合这一发现,棕榈酸诱导在0.75毫米已报道明显抑制刺激酪氨酸的磷酸化^632年IRS-1和爵士^473年一种蛋白激酶。爸爸还能抑制葡萄糖摄取刺激C2C12细胞38% (40]。此外,PA暴露浓度的0.25毫米被报道触发il - 6表达mRNA和蛋白水平通过proteasome-dependent机制,这进一步导致我的退化κβ- - - - - -α同时,它触发NF的激活κβ促炎的关键调节器信号(42,43]。慢性炎性信号通路的活性增加骨骼肌和脂肪组织是一个关键因素,确定代谢疾病的进展,包括胰岛素抵抗、肥胖、和T2D [43]。

另一项研究表明肝细胞的慢性接触高浓度的脂肪酸,尤其是长链饱和脂肪酸(比如,PA),干扰胰岛素信号通路。18个小时的孵化HepG2细胞和小鼠原发性肝细胞与高浓度的PA已报告影响胰岛素信号通路。在控制细胞HepG2、急性胰岛素刺激触发酪氨酸磷酸化胰岛素受体酪氨酸(1162/1163)和IRS1(酪氨酸612)以及丝氨酸的磷酸化Akt以剂量依赖性的方式(Ser 473)。相比之下,750年HepG2细胞接触μM棕榈酸酯抑制刺激丝氨酸磷酸化Akt的65% - -70%,这与内质网(ER)压力感应(44]。越来越多的证据表明ER应激与胰岛素抵抗之间的联系通过直接的胰岛素信号通路中断机制45]。此外,增加的蛋白质或一个ER可以触发展开蛋白质构象变化响应(UPR),这是一个应对ER应激的机制。如果UPR机制或增加伴护蛋白质不足以应付压力,它会触发proapoptotic转录因子的表达,比如同源转录因子C / EBP(切)。棕榈酸酯报道诱导砍在肝细胞的表达46]。

3.2.2。感应的在体外胰岛素抵抗模型使用高葡萄糖曝光

高葡萄糖浓度已知诱导细胞损伤;这种情况被称为葡萄糖毒性。高葡萄糖浓度可能会引发胰岛素抵抗,特别是骨骼肌(47),证明它的使用作为诱导胰岛素抵抗模型。研究氧化苦参碱的分子机制研究肝醣类的调制,包括监管PEPCK G6Pase表达式和一种蛋白激酶磷酸化,使用HepG2胰岛素抵抗模型,由高浓度的葡萄糖诱导(55毫米)为24小时。暴露在55毫米葡萄糖触发葡萄糖生产而HepG2抑制葡萄糖的吸收机制相关的一种蛋白激酶抑制和upregulation PEPCK和G6Pase表达式。在治疗之前,HepG2细胞在DMEM培养媒体补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37°C;细胞培养,直到他们达到70% confluency [48]。

在另一项研究评估东莨菪亭的效果在改善胰岛素抵抗,Zhang et al。49)使用HepG2胰岛素抵抗模型,由高葡萄糖诱导,一种蛋白激酶磷酸化的测量参数。HepG2细胞达到最大融合后,他们reincubated 24小时血清饥饿媒体。这些细胞被进一步孵化24小时无血清DMEM包含正常(5.5毫米)或高浓度的葡萄糖(30毫米)有或没有10μ米东莨菪亭和/或5μ罗格列酮作为一个积极的控制。high-glucose浓度(30毫米)组没有胰岛素和东莨菪亭,有显著抑制一种蛋白激酶磷酸化与对照组相比没有治疗(49]。高et al。50]治疗完全分化3 t3-l1细胞葡萄糖的浓度高的25毫米和0.6纳米胰岛素18个小时调查在减轻4-hydroxyisoleucine insulin-resistant-like状态的影响。这些治疗方法成功地建立了一个3 t3-l1胰岛素抵抗模型,可以在抑制2-deoxy - [³H] d葡萄糖摄取和增加TNF -α(50]。

持续的高血糖诱导葡萄糖毒性和在不同的细胞类型有有害的影响。不可逆转的胰腺β由于葡萄糖毒性细胞损伤引起的慢性暴露于高葡萄糖浓度会导致胰岛素抵抗的形成和分泌功能障碍。胰腺β细胞glucotoxicity主要是与氧化应激有关。葡萄糖水平升高引发活性氧产量,降低胰腺抗氧化酶的能力β肽也呈现β肽更容易比其他细胞氧化损伤。高葡萄糖水平与蛋白质,引发了过度的先进的糖化最终产品的形成,增强氧化应激。这些机制的一些基础葡萄糖毒性之间的链接,活性氧积累、氧化应激、细胞功能障碍,引起胰岛素抵抗的发展(51]。

3.2.3。感应的在体外胰岛素抵抗模型使用胰岛素长期接触

慢性接触胰岛素与胰岛素抵抗有关,据报道,诱导胰岛素抵抗模型在体外在几项研究。罗西et al。14]3 t3-l1细胞作为模型用来描述慢性高胰岛素血症风险的影响。被用作一个模型之前,3 t3-l1细胞需要从成纤维细胞的表型分化成熟的脂肪细胞通过孵化3 t3-l1细胞分化中包含1μ0.25克/毫升的胰岛素,μIBMX M地塞米松,0.5毫米,2μM罗格列酮(14,52]。分化过程是利用Oil-Red-O染色观察。第七天,细胞内脂滴开始出现在规模和数量,增加孵化时间的增加。整个分化过程花了大约14天(52]。的慢性刺激3 t3-l1使用重组人胰岛素的浓度150海里,这是补充说从6天postdifferentiation感应到前一天实验。胰岛素曝光和血清饥饿前应至少18小时。未经处理的平行实验,来细胞(14]。

另一项研究使用C2C12肌小管细胞暴露于慢性60 nM 24小时的胰岛素浓度诱导胰岛素抵抗模型。此外,在评估细胞胰岛素刺激胰岛素的C2C12细胞暴露在120海里前15分钟研究激活的信号通路5]。研究评价人参皂苷的影响Rg1触发葡萄糖吸收的胰岛素抵抗模型也进行了在C2C12细胞胰岛素引起的慢性暴露。C2C12细胞被孵化的DMEM培养基组成,10%的边后卫,1%的抗生素。达到融合后,C2C12细胞分化和暴露于100海里的慢性胰岛素为3天。在第四天,C2C12细胞的分化仍在DMEM补充2%的商品,而人参皂苷Rg1给出的最后12小时前测量参数(53]。

冯et al。54]探索铬酸盐在改善胰岛素抵抗的影响3 t3-l1脂肪细胞模型。完全adipocyte-mature 3 t3-l1细胞得到2天的治疗后胰岛素(10毫克/毫升)和IBMX(0.5毫米),其次是5天的治疗FBS-DMEM为10%。对于建立胰岛素抵抗模型,区分3 t3-l1细胞(2×10⁵毫升)被播种在96 -孔板与10% FBS-DMEM和孵化24小时37°C,紧随其后的是24小时的胰岛素浓度10孵化⁻⁶mol / L。如图所示,增加血糖水平、慢性3 t3-l1胰岛素暴露引发胰岛素抵抗。这种效应的差别有关对这些葡萄糖uptake-related通路(GLUT4, Akt, p-Akt)。此外,它可以抑制胰岛素敏感信号通路,包括IRS1 PPARγ、PI3K和p38-MAPK,信使rna和蛋白质含量(54]。

胰岛素抵抗与足够的个体β细胞功能可以通过胰岛素分泌增加了补偿β肽。然而,增加胰岛素分泌会加重胰岛素抵抗自循环胰岛素浓度的增加会抑制胰岛素的反应。主要胰岛瘤病人还没有代谢综合征的历史开发胰岛素抵抗,这可能导致肿瘤导致胰岛素血症。此外,糖尿病患者接受脉动的胰岛素治疗显示血糖控制比那些接受连续胰岛素输注(55]。

高胰岛素血胰岛素受体的活性降低;因此,它有助于胰岛素抵抗。慢性胰岛素孵化后,自身磷酸化胰岛素受体对胰岛素刺激的能力是受限制的52]。此外,高胰岛素血会引起胰岛素抵抗,尤其是与脂肪酸积累,自激活后抑制IRS1/2函数负反馈在胰岛素信号通路中观察到的高胰岛素血症56]。

本文表明,在体外模型集中在几个细胞系(3 t3-l1 C2C12肌管,和HepG2)从脂肪组织,骨骼肌和肝脏代表受损的胰岛素的主要位点行动提供巨大的效益和简化过程研究胰岛素抵抗的机制(总结表1)。

尽管他们很多好处,在体外研究有很多缺点,应该考虑。弗瑞森et al。57报道称,最关键的限制在体外细胞培养系统是培养基中含有的营养成分不完全代表人体组织中包含的材料等离子体在活的有机体内。几次已经克服的限制,包括细胞培养媒体内容的浓缩来模仿人类的等离子体。然而,在体外由于特定文化模式仍然缺乏营养supraphysiological级别的或不完整的验证胰岛素信号响应(57]。

另一个限制在体外人体模型是复杂的系统;因此,在体外测试研究全身系统的单独是不充分的。因此,药物的有效性,候选人也应该使用一个评估在活的有机体内系统获得一个全面的理解。在体外模型是有用的,建议确定一个合适的目标分子或受体处于初期阶段。然而,一个在活的有机体内模型是必需的,建议进一步研究开发候选药物和评估其安全性进行毒理学测试(58]。

3.3。未来的讲话

在最近的几十年中,已经利用2 d细胞培养生物研究,包括大规模筛选(高温超导)小药物库。大多数的细胞是在二维(2 d)上进行高温超导细胞培养生长在塑料表面定制的组织文化。与此同时,2 d文化是无法表达的微环境在活的有机体内生物学、细胞的生理影响。先前的研究已经证明了细胞外基质(ECM)的必要性对细胞行为,三维细胞培养可以更准确地表示在活的有机体内环境比2 d细胞培养系统。此外,传统的二维培养系统无法模拟炎症条件在脂肪细胞的分化。集成成熟脂肪细胞的炎性微环境的发展需要药物针对代谢疾病如肥胖和胰岛素抵抗[59]。细胞间发生的相互作用和cell-matrix形状控制的分子表型和细胞形态、增殖和代谢。这种交互是被传统的二维单层培养。密切代表细胞微环境,研制了三维细胞培养(20.]。

多种因素涉及器官和组织之间的串扰,甚至同一组织内细胞之间的隔间,经常负责代谢系统紊乱。许多生理压力可能破坏的严格监管机制β细胞功能代谢过载和胰岛素抵抗的背景下,这两个经常被观察到在与肥胖相关的T2D人类。T2D的特点是两个或两个以上的器官之间的串扰的中断的自我平衡的机制。尽管如此,有必要探讨潜在的疾病进展研究平台通过这个相声的扰动。传统的在体外模型研究器官相互作用仅限于coculturing不同的细胞类型和传输媒体从一个细胞到另一个,和他们未能捕获多个器官的时间动态直接交互。因此,模型有足够的复杂性需要重建其相关的特征在体外。Organ-on-a-chip平台是一个有吸引力的候选人的工具多因子的病态的特征,包括糖尿病,允许不同的器官和组织之间的交互。它还模拟系统的相互关系通过coculturing不同器官在芯片上通过微流体通道连接单独隔间里。最初,这些系统被用来演示在活的有机体内特定药物的药代动力学和药效学反应。与3 d环境的建立和长期的文化中,这个概念进一步扩展为药物代谢和连续的进步进行了调查和信息交互60]。

的进一步发展在体外T2D模型将允许研究人员逆向工程的复杂性在活的有机体内T2D信号在一个在体外设置。3 d组织框架将提供新的治疗策略和对小说的发展贡献T2D疗法与精确的机制(26]。

4所示。结论

细胞系带来了一场革命,科学研究的转变。细胞系已被用于研究糖尿病和胰岛素抵抗的发病机制以及发现药物对这些条件。利用3 t3-l1 (preadipocyte) C2C12(骨骼肌)和HepG2(肝)细胞系由棕榈酸诱导高葡萄糖,胰岛素或慢性暴露一直建立在探索糖尿病和胰岛素抵抗,考虑到这些细胞系代表器官在胰岛素抵抗的发病机制和T2D至关重要进展。此外,在体外模型可以合理选择抚养3 r原则(降低、细化和替换),有助于克服动物模型的局限性,特别是在伦理方面的考虑。

数据可用性

数据用于支持本研究的结果和讨论都包含在这篇文章,引用的引用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由印尼合作研究格兰特(RKI)(批准号872.1 / UN27.22 / PT.01.03/2022)。作者要感谢意大利Sebelas Maret,意大利Gadjah马达思班,意大利Airlangga,意大利Brawijaya促进这种合作。