心肌细胞甘油三酯积累和减少与肥胖小鼠心室功能反映增加长链脂肪酸吸收和新创脂肪酸合成

文摘

nonarteriosclerotic心肌病越来越肥胖病人。寻求一种啮齿动物模型中,我们研究了心脏组织学,功能,心肌细胞脂肪酸吸收,和转运体基因表达控制雄性C57BL / 6 j小鼠和三个肥胖组:类似的高脂肪饮食的老鼠(HFD)和db / db和ob / ob老鼠。在牺牲,所有肥胖组增加了身体和心脏重量和肥肝。通过超声心动图、射血分数(EF)和部分缩短直径(FS)的左心室收缩时显著降低。的饱和脂肪酸的吸收增加,与心脏甘油三酯和胰岛素浓度显著相关。也与心脏脂肪酸转运蛋白基因的表达Cd36和Slc27a1。的基因新创脂肪酸合成(Fasn, Scd1)也被调节。十氧化磷酸化途径基因表达下调,表明减少心肌细胞ATP合成可以解释肥胖的心收缩功能下降。

1。介绍

心脏病是肥胖的一个主要后果是反过来与冠状动脉粥样硬化的主要危险因素如高血压、高脂血症、糖尿病和睡眠呼吸紊乱(<一个href="#B1">1]。然而,越来越多的研究显示,肥胖也有直接作用于心脏,可能不会造成动脉粥样硬化(<一个href="#B2">2]。大量证据显示了一个协会之间的肥胖和心脏结构和功能变化在人类和动物。许多这些变化,如左心室(LV)肥大,左心室扩大(LA),和亚临床损害LV收缩期和舒张功能,被认为是前兆的公开形式的心脏功能障碍和心力衰竭(<一个href="#B2">2]。数据显示,长期严重肥胖可能最终导致心力衰竭,几项研究表明,脂肪肝患者尤其受心脏并发症(<一个href="#B3">3,<一个href="#B4">4]。这些观察让我们假设,与肥胖相关脂肪肝(<一个href="#B5">5),肥胖会导致upregulation促进长链脂肪酸(LCFA)心肌细胞所吸收,从而导致心脏异位甘油三酯积累和顺向心肌病。为了验证这个假设,我们研究了三种小鼠肥胖模型:C57BL / 6 j小鼠长期喂食高脂肪的饮食,leptin-deficientob / ob老鼠,leptin-receptor-deficientdb / db老鼠,与功能的结合,组织学、生化和分子研究。促进吸收的长链脂肪酸(LCFA)心肌细胞,心脏重量和左心室质量,和心脏甘油三酯含量增加和心脏射血分数减少在所有三个模型。这些结果表明,一般的关系之间存在肥胖和心脏功能障碍,肥胖心肌病是肥胖的临床表现不可或缺的组成部分,而LCFA促进心肌细胞吸收的增加是一个重要的机制导致肥胖心肌病的发病机制。

2。方法和程序

2.1。老鼠和饮食

雄性C57BL / 6 j,db / db,和ob / ob老鼠从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)6周之久的年龄。收到老鼠住在笼子的温控设备组12 h:黑暗周期,免费获取水和一个标准的食物饮食(PMI LabDiet 5001年,圣路易斯,密苏里州)。在8周的年龄开始C57BL / 6 j小鼠被随机分为2组。一组,指定为控件(C),以及db / db和ob / ob老鼠,继续接受食物的饮食。其他C57BL / 6 j组喂高脂肪的食物(HFD)含35%猪油(55%的热量来自脂肪;Bio-Serv Frenchtown, NJ)。每周体重记录。所有小鼠安乐死星期一夜后的年龄(12小时)快。所有适用的制度伦理和政府法规使用动物在本研究随访。实验协议是机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)的哥伦比亚大学医学中心。

2.2。安乐死和组织收割

安乐死是通过腹腔注射氯胺酮(0.1毫克/克)和甲苯噻嗪(0.01毫克/克)。在牺牲小鼠被随机分配到两个协议。方案1:腹部被打开,灌注后“基底”解决方案(<一个href="#B6">6)通过主动脉、心被孤立的单个细胞悬浮液的心肌细胞。协议2:腹部打开如上所述,心没有灌注,重被移除。一分的心冻结后续生化测量;第二个部分是放置在中性缓冲福尔马林对随后的石蜡包埋,切片,苏木精和伊红染色())和马洛里的三色的。其余是嵌入在10月化合物(Tissue-Tek樱花Finetek美国公司,托兰斯,加州),在干冰冷冻,储存在−80°C。随后,连续7μ米厚的部分收集poly-D-lysine-coated幻灯片和沾油红O(奥罗)和苏木精。

2.3。血液和血清分析

血糖测定血糖仪(一触,LifeScan, Inc .,加州苗必达)在preanesthesia尾静脉样本。额外的血液收集下腔静脉的牺牲和及时通过离心分离。血清是储存在−20°C进行后续分析。以下测量血清进行在我们实验室使用商业套装:游离脂肪酸(和光化学FFA, kouichi美国公司,里士满,弗吉尼亚州);和光化学甘油三酯(l型H TG kouichi美国);总胆固醇(和光纯化学工业,胆固醇E, kouichi大阪,日本);AST (Stanbio Boerne特克斯)。瘦素和胰岛素浓度测定免疫测定激素研究范德比尔特大学的核心实验室。

2.4。测定心肌组织甘油三酯和胆固醇

协议2心样本均质在PBS。心脏总蛋白质含量测定与BSA蛋白分析工具包(热科学,罗克福德,生病),和心脏甘油三酸酯和胆固醇含量测定,Folch提取后(<一个href="#B7">7和光包),kouichi(胆固醇E和l型H TG)根据制造商的指示。

2.5。组织学评价心脏中性脂质

组织学观察ORO-stained心脏部分的图像与尼康Eclipse 250 x 80我用尼康数码显微镜和捕获DXM 1200 C相机,使用标准曝光照片。半定量的估计从每个鼠标中性脂质在这些部分是由两个独立的观察者(FG, PDB)盲实验协议,根据以下范围:(−)没有阳性染色,0分;(+)偶尔ORO-positive滴观察至少5大功率领域通过搜索(HPFs分区),1分;(+ +)小ORO-positive液滴出现在大多数HPFs分区,2分;(+ + +)明显,大ORO-positive滴HPFs分区,3分;(+ + + +)许多人仍然较大的ORO-positive滴,有时在团中,在所有HPFs分区,4分。平均得分为每个鼠标计算成绩的两个观察员。为57个样本分析本研究脂质分数的平均差两个观察者为0.12±0.04 (SE)点。回归线的斜率之间的两组分数为0.96 (,)。

2.6。透射电子显微镜法

心与2.5%戊二醛固定在0.1米索伦森的缓冲区(0.1 H₂阿宝₄0.1米,HPO₄至少12 h, PH值7.2)。样本OsO后缀为1%₄在0.1米索伦森的缓冲区1 h。全体用1%的丹宁酸水染色之后,洗涤和染色以1%醋酸双氧铀(<一个href="#B8">8]。组织被嵌入在lx - 112 (Ladd研究行业、公司、威利斯顿Vt,美国)。部分60海里被削减的mt - 7000 RMC超微切片机,放在网铜网格(电子显微镜科学,哈特菲尔德,Pa),沾1%醋酸双氧铀和0.4%柠檬酸铅,并分析了在JEOL jem - 1200 EXII电子显微镜。

2.7。超声心动图

老鼠与1.5 - -2%异氟烷麻醉,直到他们是无意识的,此后连续1 - 1.5%异氟烷是管理整个研究。胸部是剃最小化超声波衰减。老鼠被放置在一个加热垫与心电图描记的附加到每个肢体。超声心动图与执行Vevo770 (VisualSonics,多伦多,加拿大)仪器,设计用于小动物。表和M-mode二维(2 d)图像得到的胸骨旁的极震区的观点。从这些研究记录数字图像后续的分析。记录轮廓的测量平均值至少有三个心脏周期。一个有经验的操作人员看不到鼠标执行这些测量信息。在M-mode极震区图片,前和后壁厚度(啊,PW)和LV舒张压和收缩压维度(LVEDD, LVESD)测定midpapillary肌肉水平。LV部分缩短百分比(% FS),它反映了LV直径变化量之间的收缩和放松状态,射血分数(EF)和LV质量(LVM)计算根据Teichholz et al。<一个href="#B9">9)使用b型极震区midpapillary级别的图像方程(<一个href="#EEq2">2)和(<一个href="#EEq3">3)将修正因素之前显示优化结果<一个href="#B9">9,<一个href="#B10">10]。

2.8。隔离的心肌细胞

消化后的心脏组织胶原酶II,老鼠心肌细胞分离所述[<一个href="#B11">11- - - - - -<一个href="#B13">13),使用一个协议被证明产生优秀的大鼠心肌细胞制剂(<一个href="#B13">13]。由锥虫蓝染色可行性评估,只有准备≥80%的心肌细胞排斥台盼蓝。悬挂在显微镜下计数和细胞浓度调整到1.5×10⁶细胞/毫升用于油酸(OA)吸收化验。

2.9。油酸的细胞吸收

使用快速过滤方法建立在我们的实验室<一个href="#B14">14- - - - - -<一个href="#B17">17),O一个成心肌细胞的初始吸收速度从500年媒体包含37°CμM BSA决心一式两份/ 15秒在五个不同的游离油酸浓度。吸收是线性的在这个时间内,我们已经建立了,在这些条件下测量吸收主要反映了内在指导跨膜长链脂肪酸(LCFA)运输、相对独立的图层样式没有被搅动的水或细胞内绑定或代谢<一个href="#B14">14- - - - - -<一个href="#B16">16]。

2.10。计算和数据拟合

基于多个先前的研究在啮齿目动物和人类<一个href="#B17">17- - - - - -<一个href="#B22">22),油酸值初始吸收速度5研究游离油酸的浓度被电脑安装(<一个href="#EEq4">4),使用阿姆II软件修改实施着一台笔记本电脑(<一个href="#B23">23,<一个href="#B24">24]。这个方程表明LCFA吸收是一个饱和的总和加上一个不饱和的血浆中游离LCFA浓度的函数。因此, 吸收([OA_u])的吸收速度标记油酸(pmol /秒/ 50000细胞)的浓度油酸(OA_u)(nM),(pmol /秒/ 50000细胞)分别(nM)的最大吸收速率饱和吸收游离OA组件和浓度half-maximal吸收速度(nM)(毫升/ 50000个细胞/ sec)是不饱和的OA吸收速率常数。计算的值为生理变量表示为均值±S.E.

2.11。分析心脏基因和蛋白表达

2.11.1。中存在

总RNA提取心脏组织样本使用QIAamp RNA迷你包(试剂盒(aapl . o:行情),瓦伦西亚,加利福尼亚州)根据制造商的协议。第一链互补dna合成使用TaqMan反转录试剂盒(应用生物系统公司,加州福斯特城),用随机六聚物引物。PCR反应进行总量的50μL 500 ng cDNA 7300实时PCR系统使用SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)作为制造商的详细指南。我们使用geNormTM工具包β₂M (beta-2-microglobulin) GAPDH(甘油醛3 -磷酸脱氢酶),哥伦比亚大学(泛素C) (PrimerDesign有限公司、英国),和18 srna (IDT,加州圣何塞)看家基因分析。引物序列选择使用引物3软件(s . Rozen h . Skaletsky<一个href="http://frodo.wi.mit.edu/primer3/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)。我们使用Got2(谷氨酸草酰乙酸转氨酶2,线粒体),Slc27a1(长链脂肪酸运输蛋白1),Slc27a6(长链脂肪酸运输蛋白6),Cd36(脂肪酸移位酶)Scd1(硬脂酰辅酶a desaturase-1)和Fasn(脂肪酸合酶)引物(IDT,加州圣何塞)来量化这些基因的表达水平。我们也使用Ndufaf4(NADH脱氢酶(辅酶q) 1α复形,组装因子4),Ndufa8(NADH脱氢酶(辅酶q) 1α复形,8),Sdhd(琥珀酸脱氢酶复合体亚基D,整合膜蛋白),Cox5b(细胞色素c氧化酶亚基Vb),Cox6b1(细胞色素c氧化酶亚基VIb多肽1),Cox6c(细胞色素c氧化酶亚基维克)Uqcrc2(泛醌细胞色素c还原酶核心蛋白2),Uqcrfs1(ubiquinol-cytochrome c还原酶,Rieske iron-sulfur多肽1),和Atp5j(线粒体ATP合酶、H +运输F0复杂,单元F)Atp5h(线粒体ATP合酶、H +运输F0复杂,亚基d)量化氧化phosphorylation-associated基因表达的引物,引物检查表达过氧物酶体proliferator-activated受体γcoactivator-1α(PGC-1α)。

2.11.2。西方的屁股

检测CD36和脂肪酸运输蛋白1 (FATP1)、总蛋白提取准备与使用小鼠心脏细胞裂解缓冲(里帕缓冲区,Teknova)。颗粒物质被离心分离,蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质化验设备。等量的总蛋白(50μg /样本)受到Bis-Tris凝胶电泳NuPAGE 4 - 12%(表达载体,加州卡尔斯巴德)然后electrophoretically转移到硝化纤维素膜。非特异性结合被孵化的膜与脱脂奶粉(5%)在室温下至少1小时。这些墨迹孵化了以下主要抗体:兔子anti-mouse FATP1(加州Santa Cruz)或山羊anti-mouse CD36 (R & D系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州)。每个主要抗体是孵化2 h或隔夜的稀释1:500。山羊anti-rabbit和驴抗体免疫球蛋白二次抗体(1:1000稀释;圣克鲁斯生物技术)被用来识别主要抗体结合位点。所有的免疫印迹结果分析了扫描微密度和密度测量图像分析仪软件(图像J、美国国立卫生研究院的贝塞斯达,Md (<一个href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/download/))。

2.12。统计分析

所有结果都表示为±SE。单比较与学生的检查t测试,有统计学意义。对报告的参数表<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/tab1/" target="_blank">1和<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/tab2/" target="_blank">2三个实验,每组与对照组(主要目标,三个比较);三个实验小组也与对方相比(次要目标,三个比较)。统计学意义再次设置。由一维方差分析分析,其次是事后t测试,使用混合标准偏差计算组差异的标准错误。应用Bonferroni调整需要设置限制的意义(0.05除以6,组间比较的数量)。这是无法实现给定每组动物的数量。因此简单地报道值的传说这些事后测试表<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/tab1/" target="_blank">1和<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/tab2/" target="_blank">2。任何值低于0.0083可以采取明确的Bonferroni-corrected价值意义重大,而其他值()可以被认为是只有探索性或暗示。


集团	心脏重量(克)	心脏甘油三酯(毫克)	心脏胆固醇(毫克)

控制()	0.125±0.002	0.68±0.16	0.68±0.07
HFD ()	0.145±0.006 * *	1.40±0.22^*‡	0.54±0.16
db / db()	0.143±0.002 *	2.73±0.32 * *	3.71±1.06 * *
ob / ob()	0.157±0.006 * *	2.87±0.35^{* *§§}	5.89±1.99^{* *§}

* ,* * 与对照组相比。^‡ (HFD与db / db);^§ ,^§§ (HFD与ob / ob)。


组	心率	亚历山大-伍尔兹(毫米)	PW(毫米)	LVEDD(毫米)	LVESD(毫米)	LVM(毫克)	EF (%)	FS (%)

控制	456±13	0.73±0.02	0.72±0.02	4.03±0.08	2.50±0.08	85.25±3.17	61.52±1.38	38.05±1.08
HFD	474±12	0.80±0.01^{* *‡}	0.77±0.02^‡	4.23±0.08^‡	2.80±0.05 * *	101.89±4.86 * *	55.95±0.73^{* * __}	33.62±0.55^{* * __}
db / db	445±4	0.88±0.03 * *	0.86±0.02 * *	3.89±0.08^£	2.70±0.09	101.74±4.6 * *	51.76±1.79 * *	30.66±1.29 * *
ob / ob	458±9	0.87±0.03^{* *§}	0.85±0.02^{* *§§}	4.16±0.09	2.93±0.09 * *	112.19±1.0 * *	50.53±1.4^{* *§§}	29.70±1.00^{* *§§}

亚历山大-伍尔兹:前壁厚度。
PW:后壁厚度。
LVEDD:左心室舒张期结束维度。
LVESD:左心室收缩末期维度。
LVM:左心室质量。
% EF:射血分数百分比。
% FS:部分缩短百分比。

表2

超声心动图结果。前壁厚度、后壁厚度、左心室舒张期结束维度,左心室收缩末期维度,左心室质量,射血分数,分数缩短测量。数据报告为±SE。方差分析的结果,其次是事后t测试:*,* *与对照组相比,^__ ,^‡ (HFD与db / db);^§ ,^§§ (HFD与ob / ob);^£ ,(db / db与ob / ob)。

3所示。结果

3.1。年龄、体重、血清生化检查

研究了老鼠的平均年龄是139±1天,相当于在所有四组。HFD-fed(37.95±1.11克,),db / db(51.78±0.57克,),ob / ob(62.5±0.53克,)小鼠,共同指定的肥胖组,都明显比chow-fed重C57BL / 6 j控制(26.58±0.24克,)。血糖值、HOMA-IR和血清胰岛素、瘦素,总脂肪酸、甘油三酯,胆固醇,和AST值将被发现在之前的出版物处理的发病机制肝在这些相同的动物脂肪变性(<一个href="#B5">5]。短暂,血糖是只在HFD组显著增加,血清胰岛素db / db和ob / ob组和HFD和血清中瘦素db / db组,但是内稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR),计算如前所述在老鼠<一个href="#B25">25),在所有肥胖组显著增加。在所有三个肥胖组血清胆固醇也高,但只在HFD和甘油三酯含量增加ob / ob动物。虽然总LCFA浓度是有些在所有实验群体比控制,没有一个组显著增加。然而,在总LCFA相比,增加游离LCFA (LCFA_u),它提供了LCFA吸收的驱动力,在所有实验组显著(<一个href="#B5">5]。血清AST显著增加db / db和ob / ob但不是HFD老鼠。

3.2。心脏重量和甘油三酸酯含量

心脏重量和甘油三酸酯含量增加在所有肥胖组;心胆固醇含量增加ob / ob和db / db但不是HFD动物(表<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/tab1/" target="_blank">1)。心脏重量(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig1/" target="_blank">1:),心脏甘油三酸酯含量()和心脏胆固醇含量()都与体重显著相关(在每个实例中)。

图1

心脏重量与体重显著相关的四个实验组,每组()。

3.3。心脏组织学分析,油红O染色和透射电子显微镜

ORO-positive脂滴在控制心肌细胞(图十分罕见<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig2/" target="_blank">2(一个))。尽管显著增加生化测量TG HFD组,只是偶尔ORO-positive脂滴在HFD光学显微镜观察到心肌细胞(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig2/" target="_blank">2 (b)),但明显脂质积累的db / db和ob / ob老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig2/" target="_blank">2 (c)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig2/" target="_blank">2 (d))。在透射电子显微镜图像,脂滴的心脏HFD动物,但脂滴都是更大更丰富db / db和ob / ob老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig2/" target="_blank">2 (e),<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig2/" target="_blank">2 (f),<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig2/" target="_blank">2 (g),<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig2/" target="_blank">2 (h))。半定量的分级ORO-stained心脏部分没有显示明显的脂质沉积的平均品位差异HFD(0.54±0.14)和控制(0.6±0.13)小鼠;然而,在db / db(2.4±0.38)ob / ob(3.4±0.14)组,脂质沉积的年级,分别4倍和6倍高于C和HFD组()。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

心脏组织学。((a)、(b) (c)和(d))。(代表Oil-Red-O) -奥罗——彩色部分的心(a)控制,(b)高脂肪饮食(HFD), (c),(d)老鼠。脂滴在控制在HFD小鼠心脏和罕见尽管心脏~ 12倍,后者甘油三酸酯含量。明显有ORO-stainable脂质增加的心和老鼠。((e)、(f) (g)和(h))。透射电子显微镜的图像(e)控制,HFD (f) (g)和(h)老鼠。脂滴在控制(箭头)是罕见的心,但单个液滴可以发现在许多领域HFD组。脂滴是更大的和更常见和心,与多个液滴通常被观察到在大多数领域。酒吧规模表明500海里。脂滴的心脏是在直接接触线粒体几乎一致。

3.4。二维超声心动图心脏功能分析

通过超声心动图测量,AW和PW增加肥胖组的老鼠(表<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/tab2/" target="_blank">2)。超声心动图左心室质量的估计也增加HFD(101.89±4.86毫克),db / db(101.74±4.6毫克),ob / ob老鼠(112.20±1.0毫克)相比,C(85.25±3.17毫克),与组织高度相关的测量心脏重量(总,)。收缩末期直径(LVESD)平均为2.50±0.08毫米和舒张期内径(LVEDD) 4.03±0.08毫米控制老鼠。尽管平均LVESD增加肥胖组,LVEDD相似(表在所有组<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/tab2/" target="_blank">2,图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig3/" target="_blank">3(一个)肥胖组),所以没有达到的基本标准扩张心肌病。FS百分比,38 C±1.1%,下降到33 HFD±0.6%, 30±1.3%db / db,和29±1.0%ob / ob老鼠(为每个组)(图和控制<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig3/" target="_blank">3 (b))。同样,EF减少HFD (56±0.7%),db / db(52±1.8%)和ob / ob老鼠(51±1.4%)相比,C (62±1.4%) (为每个组)(图和控制<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig3/" target="_blank">3 (b))。英孚是体重呈负相关(,)和心脏TG (,)研究了四组(数据没有显示)。

(一)

(b)

通过超声心动图心脏功能评估。(一)M-mode图像左心室的胸骨旁的极震区视图,显示深度标记。EDD:左心室舒张末期直径。委托人:左心室收缩末期直径。(b)部分缩短直径的左心室收缩和放松之间的状态和射血分数计算从超声心动图测量在心动周期。射血分数(EF)舒张末容积的分数与每个被打败;也就是说,它是中风量(SV)、除以舒张末期容积(类别)。*,**与对照组相比。

3.5。LCFA吸收研究

正如前面在脂肪细胞(<一个href="#B17">17和肝细胞<一个href="#B5">5,<一个href="#B26">26),吸收的³由孤立的老鼠心肌细胞H]十八烯酸组成的饱和和不饱和的组成部分的总和。在所有组研究中,饱和组件成为主流在生理范围内的游离油酸浓度。典型的吸收曲线控制,HFD,db / db,和ob / ob心肌细胞在图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig4/" target="_blank">4(一)。饱和心肌细胞LCFA吸收,反映在增加增加在每个肥胖组(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig4/" target="_blank">4 (b))。的意思是在HFD,db / db,和ob / ob老鼠是1.4、2.0和3.2倍,在控制老鼠。增加仅仅是重要的db / db老鼠(),但不是ob / ob动物,最大的意思是增加,由于更大的散射数据。有一个显著的非线性关系和血清胰岛素组(,图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig4/" target="_blank">4 (c)),符合等级增加胰岛素抵抗的肥胖组动物。

(一)

(b)

(c)

(一)对心肌细胞H]十八烯酸吸收曲线从控制、HFD,和老鼠。数据点是指±SE。(b)对饱和心肌细胞LCFA吸收增加的肥胖组与对照组相比。酒吧代表的意思是±1 SE。*表示而控制。(c)和血清胰岛素浓度的关系(H]十八烯酸吸收,这表明一个重要的非线性相关性可能反映出,在某种程度上,胰岛素抵抗。

3.6。基因和蛋白质表达

3.6.1。基因参与LCFA吸收

心脏LCFA转运蛋白基因表达率,Got2、Slc27a1 Slc27a6,和Cd36和关键酶的参与新创LCFA合成,Scd1和Fasn,如图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig5/" target="_blank">5(一个)。Got2编码传输FABPpm / mAsp-AT,只调节ob / ob老鼠;Slc27a1,该编码FATP1,显著调节三个肥胖组;Cd36,编码CD36 /脂肪,在这两方面都显著调节ob / ob和db / db动物。免疫印迹分析证实,CD36和FATP1调节肥胖组(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig5/" target="_blank">5 (b))。表达率Cd36特别是,是高度相关的³H]十八烯酸吸收在所有的肥胖组,用一个((图)的基因表达数据<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig5/" target="_blank">5 (c)),蛋白表达(免疫印迹)的结果。有一个较小的程度的相关性和Slc27a1表达率(数据未显示)。相比之下,Slc27a6编码假定的心脏输送FATP6,不是调节心肌细胞从任何肥胖组。

(一)

(b)

(c)

(d)

图5

Got2、Slc27a1 Slc27a6, Cd36) Scd1 Fasn Fasn Scd1 ob / ob db / db db / db, ob / ob ³ Cd36 Ndufaf4 Ndufa8) (Sdhd) (Cox5b Cox6b1和Cox6c) (Uqcrc2 Uqcrfs1); (Atp5j Atp5h 所有所有

(一)心脏心脏LCFA转运蛋白基因表达率(和以及两种酶LCFA合成、硬脂酰辅酶a desaturase-1 ()和脂肪酸合酶()。和被显著的调节和老鼠。(b)代表西方滴CD36的表达和FATP1控制,HFD,和老鼠。(c)对于[在心肌细胞H]十八烯酸吸收有显著的相关基因表达率在所有肥胖组。(d)心脏10氧化磷酸化基因的表达率。复杂的我:NADH脱氢酶(;复杂的二世:延胡索酸盐还原酶;复杂的三世:细胞色素c还原酶;复杂的IV:细胞色素c氧化酶复杂的V: f型atp酶)表达下调的肥胖组。误差线表明±1 SE。*,**与对照组相比。

而不是一个运输本身脂蛋白脂肪酶(LPL)可以增加LCFA吸收循环脂蛋白、甘油三酯的水解使他们组件LCFA可促进吸收(<一个href="#B27">27]。我们发现LPL表达率显著升高()db / db(1.78±0.05)ob / ob(1.72±0.1)但不是HFD(1.07±0.07)动物。当地LCFA浓度因此心肌毛细血管前菌株可能高于我们批量测量等离子体,促进LCFA吸收相应更大的绝对水平,但这地方增加的程度LCFA浓度不能直接测量。

操作。新创LCFA基因合成

Fasn脂肪酸合酶,编码,和Scd1,编码硬脂酰Co-A desaturase 1,都显著调节db / db和ob / ob老鼠。一个小的增加Scd1HFD动物没有达到统计学意义。

3.6.3。氧化磷酸化和ATP的合成

基于基因表达微阵列研究的结果在人类肥胖的脂肪(<一个href="#B28">28),我们检测小鼠心肌细胞的表达10基因在基因和基因组学的《京都议定书》百科全书(KEGG)氧化磷酸化途径[<一个href="#B29">29日)组件的四个线粒体电子传递和ATP合酶复合物。Ndufaf4和Ndufa8(复杂的我,NADH脱氢酶);Sdhd(复杂的二世,延胡索酸盐还原酶);Cox5b Cox6b1,和Cox6c(复杂的三世,细胞色素c还原酶);Uqcrc2和Uqcrfs1(第四复杂,细胞色素c氧化酶);Atp5j和Atp5h(复杂的V, f型atp酶)都是下调大约相同的程度在所有三个肥胖组(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jobe/2012/205648/fig5/" target="_blank">5 (d))。已报告基因在这些复合物两人几个组织中表达下调(<一个href="#B28">28)和实验动物与肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗[<一个href="#B30">30.- - - - - -<一个href="#B34">34]。在初步研究中,表达过氧物酶体proliferator-activated-receptor伽马coactivator-1α(PGC-1α)下调了40%ob / ob和39%db / db动物。

4所示。讨论

动脉硬化性缺血性心脏病是肥胖的一个主要后果<一个href="#B1">1]。更少的广泛赞赏,尽管它被哈维近400年前首次发现(<一个href="#B35">35),这是一个显然nonarteriosclerotic心肌病指定软木adiposum,又或脂肪的心,这是越来越认识到严重肥胖患者(<一个href="#B36">36- - - - - -<一个href="#B39">39]。正如已经指出的那样,心脏并发症的肥胖在非酒精性脂肪肝患者(尤其普遍<一个href="#B3">3,<一个href="#B4">4),这一现象的部分原因可能是由高度的相关性(,)之间的观察心脏甘油三酸酯含量在本研究报告和之前报道肝甘油三酯含量相同的动物(<一个href="#B5">5]。平均HFD-fed身体重量,db / db,和ob / ob老鼠1.3、1.9和2.3倍的控制动物,相应的大致在人类肥胖,病态的肥胖,和超级肥胖,分别都有肝脂肪变性。血糖和血清FFA的海拔和TG在这些肥胖老鼠平行观察到相对肥胖的人类。每组小鼠心肌脂质积累和研究也有重要的异位对应的LV收缩性下降,表明它们可能是人类肥胖心肌病模型。Lipid-associated心肌病在突变和转基因小鼠<一个href="#B40">40- - - - - -<一个href="#B43">43进一步刺激我们检查心脏的老鼠的肝脏我们最初专注。

相比我们有基本的病理生理的特性的三个广泛研究肥胖小鼠模型相应的值在正常控制动物。在db / db和ob / ob动物有缺陷的瘦素信号是肥胖的根本原因<一个href="#B44">44]。相比之下,在C57BL / 6 j小鼠喂食HFD,瘦素信号最初是正常的。模型的致病的多样性研究表明观察,至少暂时,一般被认为是肥胖的代表国家。在心脏功能进行了研究ob / ob,db / db分开,HFD-fed老鼠,我们相信这是第一个研究直接比较。

我们的研究表明,身体总重量的增加由于任何几种不同机制明显与心脏重量和增加心脏TG含量。这些数据并行发现在人<一个href="#B39">39]。与肝脂肪变性(<一个href="#B45">45- - - - - -<一个href="#B47">47),增加心肌TG含量可以从一个或多个结果的几个过程,增加心肌细胞LCFA TG吸收或合成代谢或减少LCFA TG出口。与我们的发现在肝脏,促进LCFA吸收的增加只在肥胖模型与正常的瘦素信号,对饱和LCFA吸收是孤立的老鼠心肌细胞的调节所有肥胖组。

我们检查了心脏功能下降和体重之间的关系,心脏TG含量,LCFA吸收的LCFA和甘油三酯和血清水平线性回归。减少射血分数(EF)和部分缩短左心室的收缩(% FS)与体重强烈负相关(心脏TG)、内容(),LCFA吸收()所有的肥胖组。这些相关性明显强于LCFA(心脏功能和血清水平之间)或TG ()。我们的研究没有专门设计用于识别个人贡献的许多组件肥胖表型观察减少心脏功能。然而,这些结果并不表明,增加脂肪酸的循环水平或高甘油三酯血症是肥胖一样重要本身或肥胖相关的增加心脏LCFA吸收和甘油三酯积累。

我们的技术为研究细胞LCFA吸收,测量都是在15 - 30秒,独特之处在于确定单向,促进流入率,很大程度上独立于细胞内的绑定和新陈代谢<一个href="#B14">14]。在特定情况下这种方法获得的结果被证明是高度相关的表达特定LCFAs转运蛋白(<一个href="#B5">5,<一个href="#B19">19]。替代方法,标记LCFA现存动物和肝静脉注射到LCFA内容确定分钟后,反映了一个更复杂的过程,除了细胞涌入,影响血液流动的变化,细胞内绑定,流出,酯化、氧化、甚至其他进程,每个受自己的基因调控。这两种方法通常,但并非总是如此,产生类似的结果。

四个蛋白已经被提议作为重要的心脏LCFA运输车:CD36,也称为脂肪酸移位酶或脂肪,质膜脂肪酸结合蛋白(FABPpm),已被证实与线粒体天冬氨酸转氨酶(mAspAT)和脂肪酸运输蛋白1和6 (FATP1和FATP6)。在目前的研究中,当化验qPCR和免疫印迹,upregulation的Cd36(CD36)和Slc27a1(FATP1) HFD基因和蛋白质被发现,db / db,和ob / ob团体、确认CD36和FATP1发挥重要作用在心肌细胞脂质积累。的基因FABPpm / mAspAT (Got2)是调节ob / ob老鼠。Upregulation的Slc27a6基因没有被观察到的任何组。表达率Cd36尤其高度相关所有的肥胖组。除了转运蛋白,upregulation stearoyl-CoA desaturase-1 (Scd1)基因在肥胖组;脂肪酸合酶(Fasn)在两个显著调节db / db和ob / ob老鼠,这表明在肝脏,增加新创LCFA合成可能导致增加了这些动物的心肌细胞甘油三酸酯水平。

之前许多出版物表明肥胖会影响心脏的结构和功能的鼠标,老鼠,和人<一个href="#B48">48- - - - - -<一个href="#B56">56]。联系当地的脂质积累和心脏功能障碍早期人类研究报告(<一个href="#B48">48和已经确认<一个href="#B57">57]。左心室肥大和收缩性下降,典型特征的人类肥胖的心肌病(<一个href="#B48">48),也一直观察到的模式在目前的老鼠研究。心肌脂质和心脏功能之间的关系建立了最终的赵et al。<一个href="#B41">41),他创建了一个转基因小鼠的选择性overexpressing心肌长链acylCoA合成酶(留住)。通过酯化LCFA初始吸收后变成心脏细胞,从而防止他们否则快速被动流出,这种酶的过度捕捉LCFA的影响在这些细胞中,在那里他们后续代谢导致有毒的脂质积累的物种。这是最初与心脏肥大,紧随其后的是左心室功能障碍和过早死亡。第二个转基因线过多表达心肌LCFA运输车FATP1类似,但不相同的心肌病(<一个href="#B43">43]。

生成的活性氧增加LCFA氧化和线粒体损伤被认为是重要的致病的过程发展的脂质和alcohol-associated心肌病。心外膜脂肪迅速分解脂肪的速率。自的心立即下游(额外的-和intrapericardial)内脏脂肪仓库和第一轮的关系对任何LCFAs释放他们(<一个href="#B52">52),这将导致增加心脏LCFA交付和吸收,这将会变得几乎连续antilipolytic胰岛素抵抗的发生。因此,毫不奇怪,肥胖在许多设置与心肌细胞形态学的变化,线粒体数量和收缩功能。增加了线粒体数量被描述,例如,在心中ob / ob(<一个href="#B52">52,<一个href="#B54">54),db / db老鼠(<一个href="#B58">58]。线粒体功能障碍的也有越来越多的证据。基于这些数据已经表明,线粒体功能障碍和受损心肌能量可能导致在这些小鼠的心脏收缩功能障碍,肥胖病人,增加他们对心力衰竭(<一个href="#B55">55,<一个href="#B59">59]。我们演示协调下调10基因参与了心肌线粒体氧化磷酸化和ATP合成途径在所有三个肥胖模型研究是完全符合这一假说。

我们的数据提供了强有力的证据表明upregulation促进LCFA吸收是一个重要的机制导致增加心肌脂质积累在肥胖小鼠模型的频谱。数据还指出CD36和FATP1运输车主要负责LCFA吸收的增加。增加的贡献新创LCFA合成,提出研究中存在的相关基因的表达,功能需要进一步确认。最后,协调下调10基因在线粒体氧化磷酸化/ ATP的合成途径提出下调过氧物酶体proliferator-activated受体γcoactivator-1α(PGC-1α),心脏线粒体功能的关键调节器包括线粒体脂肪酸氧化、ATP合成和脂质稳态<一个href="#B59">59- - - - - -<一个href="#B61">61年]。初步观察报道强烈建议PGC-1之上α确实是表达下调至少在某些型号的肥胖。我们假定PGC-1α介导了ATP合成将负责减少% FS和EF这些模型中观察到。

在这项研究中,我们建立了一个清晰的肥胖之间的关系,增加心脏甘油三酸酯含量,老鼠的频谱和心脏功能障碍导致肥胖。这表明,心肌病,而不是新奇,是不可分割的一部分的光谱与肥胖相关的疾病。我们也证实增加促进运输LCFA进入心肌细胞在这一过程中是一个重要的致病机制。我们还发现感兴趣的其他基因,未来的研究可能解释这些发现。这些包括过氧物酶体proliferator-activated受体γcoactivator-1α(PGC-1α),主调节器的脂质和能量代谢,以及那些参与ATP合成。尽管这些数据,心肌细胞脂质积累的精确过程导致心肌功能障碍仍有待阐明。他们是否一样被描述为“lipotoxic心肌病”转基因小鼠模型(<一个href="#B41">41,<一个href="#B43">43目前还不清楚。然而,在场的许多相似之处心脏发现在老鼠和人类类似的数据表明,这些老鼠可能是有用的对人类肥胖心肌病模型,特别是考虑到限制获得人类心脏组织进行研究。此外,我们观察到体重之间的相关性,心肌脂质积累,和减少LV功能,在一个重量谱从正常到超级肥胖,表明最近的观察心肌功能障碍的严重肥胖患者可能是一个更大的冰山一角。

贡献

通用电气博士和胡锦涛的贡献这个研究是等价的。

利益冲突

作者都没有任何利益冲突声明。

确认

这些研究dk - 52401和DK0772526-S1赠款支持来自美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病的美国国立卫生研究院。作者感谢k·r·布朗(病理学系)透射电子显微镜显微照片,糖尿病和内分泌学研究中心组织学核心准备冻结部分和油红O染色和Rajasekhar Ramakrishnan博士biostatistical建议。