文摘

米6RNA修改是一种常见的丰富的mrna转录后的修改发生在肿瘤的生长和发展。HNRNPC积累的证据已经证明,充当一个m6读者中扮演着重要的角色在促进癌症发生和发展;然而,HNRNPC在乳头状肾细胞癌的作用仍然被发现。在这项研究中,我们全面发现HNRNPC中心基因参与m6pRCC修改。然后,表达水平,生存结果,PPI网络,浓缩功能,免疫细胞浸润,单细胞分析进行。最后,我们发现HNRNPC大大促进了肾细胞癌体外增殖和迁移。总之,我们的工作证明了HNRNPC可能作为重要的m6一个监管机构,以及一个潜在的通道pRCC生物标志物。

1。介绍

肾细胞癌(RCC)是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内,提出79000年估计在美国新病例根据2022年癌症统计(1]。碾压混凝土包含三个主要的组织学亚型:透明细胞RCC (ccRCC),乳头状RCC (pRCC)和chromophobe RCC (chRCC)。其中,pRCC是最常见的nonclear细胞RCC (nccRCC),所有信用社占10 - 15%,与不良预后相关(2,3]。乳头状肾细胞癌(pRCC)可分为两个亚型遗传背景的基础上:1型pRCC特点是遇到了改变,和2型pRCC CDKN2A特性改变,SETD2, BAP1,叫做PBRM1 FH, NF2, TFE3, NFE2L2,4- - - - - -6]。遇到的致癌突变是罕见但确定为pRCC形式的一个重要发病机制的特征(6,7]。然而,详细的推导的背景和进展还没有深入研究。因此,合作研究成为迫切的需求,发现pRCC的更深层次的分子机制,以及建立预测生物标志物是迫切需要指导临床治疗和药物开发。

N6-Methyladenosine (m6)RNA改性是一种最丰富的mrna转录后的修改发生在肿瘤的生长和发展8- - - - - -10]。可以动态地甲基化和脱甲基mrna特定的甲基转移酶(m6一个作家)和demethylases (m6一个橡皮擦)。此外,米6是存放在本地RNA转录和转录后的调解招聘下游功能配合物通过改变RNA结构或特定识别m6绑定蛋白(m6读者),分别10,11]。越来越多的证据已确认参与的影响6在肿瘤的增殖和转移的修改12- - - - - -14]。陈等人报道,m6可能会影响肿瘤微环境和预后pRCC [15]。尽管越来越多的应用6RNA修改在癌症研究领域近年来研究m6A修改在肿瘤发展的潜在机制,特别是pRCC缺乏。

作为异构核核糖核蛋白(hnRNPs)家庭、异构核核糖核蛋白C (HNRNPC)是一种rna结合蛋白组装到新创建的记录在真核细胞的细胞核16]。两个截然不同的拼接亚型已被确认为hnRNPC1 hnRNPC2,不同于彼此的13个氨基酸(16]。不像其他的米6一个监管机构,后认识到m6修改,HNRNPC可以选择性地调节mRNA丰富和拼接将RNA二级结构(14,17- - - - - -19]。大量的研究报道,HNRNPC中扮演着重要的角色在促进癌症的发生和发展。以乳腺癌为例,需要HNRNPC BRCA基因表达和同源重组20.]。此外,HNRNPC调节癌症特异性替代乳沟和聚腺苷酸化概要文件在结肠癌21]。然而,在pRCC HNRNPC的功能仍然是充分发现。

在目前的研究中,我们首次调查HNRNPC中心基因参与了m6pRCC修改。然后,表达水平和生存的结果进行了分析与临床特点以及体细胞突变。PPI网络,功能丰富,与免疫细胞渗透进行了相关分析,探索潜在的分子机制。最后,我们发现HNRNPC大大促进了肾细胞癌体外增殖和迁移。总之,我们的工作证明了HNRNPC可能作为重要的m6一个监管机构,以及pRCC的潜在生物标志物。

2。材料和方法

2.1。数据源和预处理

规范化RNA-seq数据(FPKM格式),体细胞突变、大会资料、和相应的临床注释乳头状肾细胞癌患者的癌症基因组图谱(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov)、GTEx和基因表达数据库GSE15641综合(GEO)进行了综合和分析。GSE15641包括23个肾脏正常样本和11个乳头状肾细胞癌样本(22]。体细胞突变、大会和临床资料,包括年龄、性别、病理阶段,TNM阶段,主要治疗的结果,和生存信息包含在这个研究。

2.2。kaplan meier生存分析,在pRCC HNRNPC ROC曲线

基于中值表达式HNRNPC, pRCC患者分为高HNRNPC表达组和低HNRNPC表达式组。kaplan meier (km)方法和生存率较,我们评估了针对疾病的生存(DSS),总生存期(OS), progress-free间隔(PFI)这两组之间的差异。接受者操作特征曲线(roc)是由使用R“survivalROC”包,和曲线下的面积(AUC)值计算评估特异性和敏感性。的诺模图旨在预测生存pRCC病人使用R“rms”和“生存”包。

2.3。PPI网络的可视化

蛋白质相互作用(PPI)网络构建使用字符串在线数据库(http://string-db.org)和ComPPI数据库(23,24]。Cytoscape软件和Metascape网站(https://metascape.org)进一步应用到可视化,实现基因富集分析和coexpression网络分析(24]。在这里,我们使用R包“limma”搜索的积极和消极20 coexpression基因从TCGA-KIRP HNRNPC基于数据。

2.4。单变量和多变量Cox风险回归分析

为了识别独立的预后因素,单变量和多变量Cox回归分析用于排除临床特点和预后值和操作系统,决策支持系统,和PFI从年龄、年级,舞台,HNRNPC mRNA表达水平。

2.5。基因集富集分析(GSEA)

GSEA执行之间的通路富集分析两组除以HNRNPC表达式值的中位数。genesets被从分子特征数据库(MSigDB下载http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/)[21]。免疫治疗的签名,包括致癌途径目标治疗相关性基因签名和预测放疗反应,也综合(25]。这些签名的ssGSEA浓缩分数计算使用“GSVA”R包(26,27]。

2.6。单细胞RNA序列处理

首先,原始数据的GSE152938从地理数据库,下载和R包“修”是用于处理数据(https://satijalab.org/seurat/)[28- - - - - -30.]。数据集GSE152938包含一个pRCC样本和11821个细胞28]。通过过滤的标准> 20% mitochondria-related基因或小于或大于20000 1000个基因表达的基因表达,总比例9941细胞终于获得了进一步分析。质量控制后,我们归一化数据和新所有的rna。接下来,各自减少细胞集群,包括tSNE和PCA,执行,和细胞集群通过tSNE方法。最后,我们使用了“单一”包得到细胞群的细胞类型注释(31日]。

2.7。细胞培养和定量实时PCR(存在)

肾癌细胞系(786 - o, 769 - p ACHN Caki-1,和Caki-2)和人类肾小管上皮细胞永生化细胞系(HK-2)从文化的集合类型购买中国科学院(中国上海)和培养RPMI 1640 (786 - o, 769 - p)、DMEM (ACHN),本人的5 a (Caki-1 Caki-2)和DMEM / F12 (HK-2)(美国热费希尔科学Gibco)含10%胎牛血清(的边后卫;美国热费希尔科学Gibco)和1%青霉素和链霉素(美国热费希尔科学Gibco)。所有细胞培养在37°C包含5%的湿润孵化器有限公司2。293 - t细胞转染控制核和siRNA-HNRNPC使用Lipofectamine 3000(美国热费希尔科学表达载体)。慢病毒载体包含超表达的HNRNPC cotransfected pMD2。G和psPAX2包装向量。慢病毒转导进行769 - p和Caki-2细胞系。稳定与嘌呤霉素选择后,过HNRNPC细胞建立了。

总RNA提取使用英杰公司试剂盒试剂(美国热费希尔科学)和随后反转录成cDNA使用HiScript三世一体化RT SuperMix (Vazyme,中国)。执行中存在与SYBR qPCR大师混合(使用StepOne Vazyme中国)+ 480(美国应用生物系统公司)和LightCycler PCR仪器(瑞士罗氏诊断)根据制造商的指示。使用的引物和siRNA益生元是列在表中S1。

2.8。临床样品和免疫组织化学(包含IHC)

pRCC样品和相邻正常肾样本通过彻底的切除。所有诊断都证实了两个独立的资深病理学家。所有患者获得知情同意的研究。研究设计和协议是经医院伦理委员会批准。如前所述(执行包含IHC染色32,33]。简而言之,主要抗体是孵化如下:anti-HNRNPC (Proteintech 1: 200年,中国)。与HNRNPC包含IHC染色的结果是发现和捕获使用显微镜(奥林巴斯、美国)。

2.9。细胞增殖和集落形成试验

预处理细胞被培养成一个96孔板的密度 细胞/。细胞增殖测定后24 h, 48 h, 72 h和96 h使用CCK-8细胞计数工具包(Vazyme,中国)。吸光度测量在450 nm标后孵化在37°C 1 h根据制造商的协议。

集落形成试验,进行预处理细胞被播种到6-well板(1000个细胞/)。这些细胞被孵化了10天。殖民地在4%多聚甲醛固定20分钟,两次与PBS洗,沾0.1%结晶紫进行进一步分析。

2.10。Transwell细胞迁移试验

总共 细胞进行预处理细胞被播种到24-well transwell心房与血清介质的迁移化验。中含有20%的边后卫被添加到室底部。在37°C 36 h孵化后,20分钟的细胞被固定在4%多聚甲醛结晶紫染色和0.1%。细胞被捕获在显微镜下五个随机选择的字段,和所有的实验重复三次。

2.11。统计分析

所有的统计数据和数据分析使用R软件(v4.1.3;https://www.r-project.org/)和GraphPad Prism 9.0(美国圣地亚哥)。不同基因之间的相关性进行了分析,皮尔森和斯皮尔曼的相关分析。临床病理的信息之间的关系和HNRNPC mRNA表达被Wilcoxon估计符号秩检验和逻辑回归。所有统计结果 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。m的景观6pRCC RNA甲基化监管机构

本研究的流程图如图1。基于已发表的研究,23个常见的m6核糖核酸甲基化监管机构被过滤掉,包括8作家,13个读者,和两个橡皮擦。热图显示表达的特点和不同的m6这些监管机构的亚型pRCC组织与正常肾组织相比(图2(一个))。如图2 (b)总共16 m6监管机构显著差异表达。此外,单变量Cox回归和kaplan meier生存分析显示,HNRNPC VIRMA, RBMX, IGFBP3和RBM15独立预测基因,而其他监管机构没有与pRCC患者的预后相关(图2 (c))。最后,进一步探索自然m之间的交互6一个监管机构,23 m之间的相关性6一个监管机构进行调查。m6网络描述综合景观6监管机构相互作用、相关血统,他们的预后价值pRCC病人(图2 (d))。值得一提的是,HNRNPC基因和风险因素是最重要的中心。因此,以上结果证实HNRNPC m是一个调节6RNA基因甲基化监管机构作为一个中心,主要是预测pRCC患者的预后。因此,HNRNPC被选为中心基因为进一步研究。


图1
本研究的流程图。
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图2
m的景观6pRCC RNA甲基化监管机构。(一)一个热图表现出不同的表达特点和m6一个亚型。(b)箱线图显示这些m的表达水平6一个RNA甲基化监管机构。(c)单变量Cox回归和kaplan meier生存分析。(d)相关网络说明m之间的交互6监管机构。 ; ; ;ns:不重要。
3.2。HNRNPC表达升高,与乳头状肾细胞癌临床疗效不佳有关

探讨HNRNPC在肿瘤发生中的作用,TCGA和GTEx数据库进行调查以确定HNRNPC的表达模式在不同的肿瘤。结果表明,HNRNPC反常地在各种肿瘤组织(图表示3(一个))。上面的验证结果,TCGA和GTEx数据库表明HNRNPC mRNA水平调节pRCC组织与正常肾组织( ,图3 (b))。同时,TCGA样本数据库单独还透露的高表达HNRNPC pRCC ( 未配对样本和 配对样本数据3 (c)和3 (d)),在独立的数据集符合外部验证GSE15641从GEO数据库(图3 (e))。找到HNRNPC表达与临床特征之间的关系,完成临床和生存TCGA 389 pRCC病人收集的信息数据库。分组后病人的临床病理的特点,它可以观察到,HNRNPC表达表现出显著增加不同的TNM分类和病理阶段(子组数据3 (f)- - - - - -3 (k))。此外,HNRNPC显著调节在进步的疾病和疾病稳定(PD&SD)和死的病人,而部分响应并完成响应(PR&CR)和幸存的患者,分别为(数字3(左)- - - - - -3 (o))。在随后的分析,中位数是389年用于二分pRCC个人切成high-HNRNPC ( )和low-HNRNPC ( )子群基于mRNA表达水平。如表所示1HNRNPC表达显著相关,T阶段( ),N阶段( ),和M阶段( )。此外,采用逻辑回归分析来描述具体的HNRNPC表达和临床病理特征之间的相关关系(表2)。综上所述,以上结果表明,HNRNPC可能扮演重要的角色在促进pRCC的恶性表型。

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图3
的表达水平HNRNPC pRCC组织和临床特点。(a) HNRNPC的表达水平在不同的肿瘤或特定肿瘤的亚型。(b)的表达水平在TCGA-KIRP HNRNPC GTEx数据库。(c)的表达水平HNRNPC TCGA-KIRP队列。(d)表达水平的HNRNPC TCGA-KIRP配对样本。(e)的表达水平HNRNPC GSE15641队列。(岗)的表达水平,分析了HNRNPC不同临床病理的特点。(f)的年龄。(g)性别。T (h)病理阶段。 (i) Pathologic M stage. (j) Pathologic N stage. (k) Pathologic stage. (l) Primary therapy outcome. (m) OS event. (m) DSS event. (o) PFI event. ; ; ;ns:不重要。
表1
在pRCC HNRNPC表达与临床病理的相关性特征。
表2
HNRNPC表达和临床病理特征之间的逻辑回归分析。
3.3。HNRNPC显示良好的预测价值在乳头状肾细胞癌的诊断和预后

探索HNRNPC的预测价值,ROC曲线的展示其能力协助pRCC的诊断。如图片所示,曲线下的面积(AUC)中华民国为0.650 (95% CI 0.554 - -0.747;图4(一)),这表明HNRNPC拥有体面的pRCC患者的诊断敏感性和特异性。接下来,kaplan meier生存分析应用于验证HNRNPC临床结果的预测价值。如数据所示4 (b)- - - - - -4 (d)总生存期( , ),针对疾病的生存( , ),和无进展时间间隔(小时:2.31, )high-HNRNPC组都统计上不如low-HNRNPC组。此外,单变量Cox回归分析进行进一步评估HNRNPC的预测价值在总生存期(OS)。除了临床阶段,T台,N阶段,和M阶段,HNRNPC表达式成为操作系统的一个重要的独立危险因素(人力资源:2.204, ,和 ,图4 (e)和表S2)。最终,提供更准确的估计pRCC病人的存活率,六个因素纳入一个预后模型如列线图(图所示4 (f))。此外,校准曲线表现出相当大的一致性之间观察到的生存概率和预测结果为1 - 3 - 5年。这些结果在很大程度上符合实际的1 -,3 -,5年存活率TCGA-KIRP队列(数字4 (g)- - - - - -4(我))。

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图4
生存分析HNRNPC和建筑的诺模图。(一)ROC曲线显示HNRNPC mRNA表达的效率pRCC组织与正常组织区分开来。(罪犯)kaplan meier曲线显示,OS HNRNPC的预后价值,DSS, PFI。(e)单变量Cox回归分析在总生存期(OS)。(f)建设的诺模图估计pRCC病人的存活率。(胃肠道)校准曲线表现出相当大的观察之间的和谐生存概率和预测结果为1 - 3 - 5年。
3.4。HNRNPC的基因突变频率

考虑到致病基因突变的性质,cBioPortal数据库调查获得的突变频率和基因改变的地位HNRNPC跨多个癌症类型。发现放大是主要的频繁的基因改变TCGA深删除和MSK-IMPACT队列(紧随其后34]。然而,不像其他癌,删除和突变在pRCC患者最常见的两个亚型,贡献一个变更的频率∼2%(图S1A-B)。HNRNPC突变频率网站和病例数的基因改变检测氨基酸之间的定位并显示在图中就是S1C。此外,使用定时器数据库,拷贝数变异(CNV)的HNRNPC,包括删除,arm-level删除二倍体/正常,arm-level增益,显著影响B细胞的渗透程度,CD4 + T细胞、CD8 + T细胞,中性粒细胞,巨噬细胞和树突细胞在pRCC [35)(图S1D)。

3.5。PPI网络,HNRNPC GSVA和功能富集分析

调查潜在的分子机制HNRNPC抒发pRCC患者肿瘤发生,在蛋白质相互作用进行了进一步的分析和基因功能。字符串和GeneMANIA数据库被用来帮助建立PPI网络和进一步探索HNRNPC-related基因之间的相互作用36)(图S2)。同时,ComPPI数据库调查获得细胞compartment-specific蛋白质相互作用网络和(23)(图5(一个))。接下来,GSVA采用配对样本中识别途径分来自TCGA-KIRP队列。结果表明HNRNPC参与几个标志途径包括“MYC目标,”“DNA修复,”“E2F目标”和“G2M检查点”(图5 (b))。在选择前15名HNRNPC coexpressed基因,浓缩和途径进行了注释的功能使用Metascape网站。去分析表明HNRNPC主要扮演着一个重要的角色在信使RNA代谢过程的规定,spliceosomal复杂,RNA绑定(数字5 (c)和5 (d))。此外,代表丰富KEGG通路是剪接体和氧化磷酸化途径(数字5 (e)和5 (f))。此外,GSEA受雇,和相关的五大重要途径G2M检查点,E2F目标,MYC目标,epithelial-mesenchymal过渡(EMT),和有丝分裂纺锤体(图S3)。

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图5
PPI网络和功能富集分析。(一)ComPPI数据库研究获得细胞compartment-specific HNRNPC的蛋白质相互作用网络。(b) GSVA说明HNRNPC参与几个标志通路。(c, d)。HNRNPC-related基因的分析。(e, f) KEGG HNRNPC-related基因的通路富集。
3.6。HNRNPC密切相关pRCC与肿瘤微环境中免疫细胞浸润

肿瘤免疫微环境的复杂性(时间)是癌症发展和传播的一个重要组成部分37,38]。因此,估计分数pRCC计算样本之间的关系发现HNRNPC使用ssGSEA方法和免疫细胞浸润,热图(图所示6(一))。结果表明,HNRNPC表达与大多数免疫细胞的渗透水平负相关。其中,HNRNPC获得最强的负相关与细胞毒性细胞,NK细胞,未成熟树突状细胞(iDC)和CD8 + T细胞,这表明自身积极的监管机构的免疫抑制。然而,斯皮尔曼的分析显示它呈正相关,辅助T细胞(Th)和辅助T 2 (Th2细胞(图)6 (b))。接下来,显著降低和负相关免疫得分观察high-HNRNPC组相比low-HNRNPC组使用估计方法(39)( ,图6 (c))。值得注意的是,我们还分析了HNRNPC水平之间的相关性和一组基因签名预测反应免疫检查点拦截器(ICB)治疗,结果表明HNRNPC有密切关系的浓缩分数immunotherapy-related签名(25)(图6 (d))。最后,HNRNPC之间的相关性和免疫调制剂(PDCD1、CD274 LAG3, CTLA-4, TIGIT, HAVCR2, PDCD1LG2,和SIGLEC15)如图6 (e)。进一步评估HNRNPC对免疫系统的影响,HNRNPC之间的联系,分析了几种典型的免疫细胞标记计时器数据库(表3)。HNRNPC水平是显著相关的15个免疫细胞标记44。这些研究结果部分支持之间的负面关系HNRNPC pRCC表达和免疫细胞浸润。

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图6
关系HNRNPC mRNA表达在肿瘤微环境和免疫渗透。(a)的热图HNRNPC表达之间的相关性和各种免疫细胞和估计的分数。(b)浸润的细胞毒性细胞、NK细胞、不成熟的树突细胞(iDC)和CD8 + T细胞。(c)之间的相关性和表达水平HNRNPC和评估分数。(d) HNRNPC有密切关系的浓缩成绩immunotherapy-related签名。(e)之间的相关性HNRNPC和免疫调制剂(PDCD1、CD274 LAG3, CTLA-4, TIGIT, HAVCR2, PDCD1LG2,和SIGLEC15) ; ; ;ns:不重要。
表3
HNRNPC之间的相关性和基因标记的免疫细胞在数据库计时器。
3.7。单细胞分析显示在pRCC HNRNPC组织的分布

除了bulk-RNA测序,我们分析的免疫微环境与单细胞pRCC RNA-sequencing数据集GSE152938 [28]。首先,我们进行质量控制,以确保电池的可靠性分析(图7(一))。我们发现的基因在细胞数量呈正相关,基因表达的数( ,图7 (b))。然后,我们筛选了3000高度可变的基因和基因标志着十大红色(图7 (c))。无监督聚类和主成分分析(PCA)的每个隔间了总共15集群所示的热图(数据7 (d)和7 (f))。之后,我们用“单一”包来注释不同集群细胞通过细胞标记。如图7 (e),pRCC样品可以主要分为内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、组织的干细胞,平滑肌细胞,单核细胞和T细胞。最后,我们试图探索在pRCC HNRNPC组织的具体分布。tSNE算法得到的图表显示表达式的HNRNPC主要是集中在巨噬细胞、单核细胞和内皮细胞,免疫渗透的结果分析(数据一致7(g)和7(h))。

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单细胞分析显示在pRCC HNRNPC组织的分布。(一)质量控制pRCC单细胞RNA-seq样本。基因表达的数量在每一个细胞,基因表达的总和,线粒体基因的比例。(b)基因在细胞的数量呈正相关,基因表达的总和,相关性为0.93。(c) 3000年变异度高的基因的基因所示红色和十大高变的基因。(d e)。结果细胞集群获得的细胞标记基因的注释是一致的“单一”包法所得结果与注释。(f)的热图了PCA无监督聚类在每个隔间。(g h)分布在pRCC HNRNPC tSNE算法获得的组织。
3.8。在pRCC HNRNPC发挥了显著的致癌作用

验证令人鼓舞的结果通过生物信息学分析,随后进行了体外实验。首先,mRNA的表达HNRNPC RCC细胞系中检测并显示出一个明显的调节表达水平在769 - p和Caki-2(图8(一个))。七pRCC样品从我们的队列,HNRNPC mRNA水平在统计学上调节肿瘤组织比正常组织(图8 (b))。同时,组织丰富用包含IHC测量,取得了一致的结果(图8 (c))。siRNA (siHNRNPC-1 / siHNRNPC-2)和慢病毒(oeNC / oeHNRNPC)被用来完成HNRNPC击倒和超表达pRCC细胞系,分别。使转染后siRNAs或慢病毒769 - p和Caki-2细胞,HNRNPC表达水平被相应地存在(图测量S4)。CCK-8和集落形成试验的结果表明,HNRNPC击倒大大削弱两个细胞系的增殖能力,特别是Caki-2细胞,而overexpressing HNRNPC逆转效应(数据9(一个)- - - - - -9 (d))。此外,transwell迁移试验表明,沉默HNRNPC pRCC细胞的转移性能力下降,而HNRNPC超表达肿瘤细胞更多的攻击性(数据9 (e)和9 (f))。综上所述,这些研究结果表明,升高HNRNPC可以促进pRCC细胞的增殖和侵袭性。

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图8
确认调节HNRNPC pRCC表达式。(一)存在验证在RCC HNRNPC细胞系的表达水平。(b)的表达水平存在验证HNRNPC七成对pRCC临床样本。(c)包含IHC检测证实了丰富pRCC样本和正常肾组织样本。
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图9
实验验证在pRCC HNRNPC的致癌作用。(a, b)。HNRNPC击倒显著削弱769 - p和Caki-2细胞的增殖能力,而overexpressing HNRNPC逆转效果。(c, d) 769 - p和Caki-2细胞集落形成试验。(e, f) HNRNPC pRCC细胞的转移性能力下降,而HNRNPC超表达肿瘤细胞更多的攻击性。酒吧规模:20μm。 ;ns:不重要。

4所示。讨论

乳头状肾细胞癌占7% -14%的肾细胞癌,患者在临床并不少见7]。有限的相对较少的情况下,pRCC两分子机制尚未彻底调查研究和大规模的临床试验。米6核糖核酸甲基化,一个典型的生物过程,在转录后的调控拼接中扮演不可或缺的角色,稳定,运输,和翻译的有针对性的mrna,已被证明参与众多肿瘤的调制(12,40]。因为这个原因,一直注意的规定6核糖核酸甲基化本身(41- - - - - -43]。尤其是Zaccara等人回顾了epitranscriptome关键功能的影响基因表达和全面总结了三个主要的调节方法6一个影响mRNA-reading、写作、和擦除44]。通过生物信息学分析,杨等人,陈等人发现重要的预后标志物和风险基因签名pRCC强调m的关键作用6核糖核酸甲基化监管机构(45,46]。同样,太阳和他的同事们研究了预后风险签名有三米6核糖核酸甲基化监管机构,发现这些基因可以精确地预测pRCC病人的生存结果(47]。不幸的是,尽管越来越多的database-dependent研究m6核糖核酸甲基化调控,仍然是一个缺乏先进的和有说服力的研究来解释它的作用在pRCC的起源和发展。

在目前的研究中,通过综合生物信息学分析和可靠的基本实验,HNRNPC被确认为一个重要m6信使rna甲基化监管机构促进恶性表型pRCC和降低pRCC患者的生存的期望。HNRNPC,称为异构核核糖核蛋白C,属于亚科广泛表达异构核核糖核蛋白(hnRNPs),这是RNA结合蛋白异构核(末端)。这些蛋白质与信使rna前体在细胞核和验证影响pre-mRNA加工、结构转换,信使rna代谢的其他方面。详细,多种功能hnRNPs在细胞核和细胞质包括信使rna剪接、稳定、营业额,出口,格兰特和翻译,自己经常参与各种mRNA监管事件(48]。多年来,hnRNPs监管的本质产生的冲刷影响不同疾病的进展,特别是恶性肿瘤。通过揭示hnRNPs控制丙酮酸激酶的可变剪接mRNA在肿瘤发生,陈等人提出了一个新颖的视觉hnRNPs如何调节癌症扩散的分子机制从代谢角度(49]。Kedzierska等人总结hnRNPs调节各级表达在大多数凋亡基因,这表明他们在癌症细胞凋亡调节器的作用和意义在抗癌疗法(50]。这些研究揭示的重要监管能力hnRNPs肿瘤恶化和癌症发展。

一开始,我们的研究说明了紧pRCC HNRNPC表达和临床结果之间的联系。足够的样本几个数据库共同分析显示高表达HNRNPC pRCC tumoral样本。逻辑回归分析进一步表明,更高层次HNRNPC与贫穷的生存和更多的恶性表型pRCC病人。值得注意的是,pan-cancer分析表明,HNRNPC在tumoral组织与正常组织中最常见的癌症,也强烈与可怜的临床和病理特征。许多研究已经证实这一发现[51- - - - - -53]。灵感来自于公司HNRNPC水平和临床结果之间的关系,我们下一个建立的预后作用HNRNPC pRCC患者作为一个可靠的生物标志物。的列线图和校准曲线预测模型表明,HNRNPC表达是很有资格来预测肿瘤阶段和整体的生存pRCC病人作为一个独立的危险因素。在其他研究中也观察到类似的发现。王等人发现HNRNPC的表达在前列腺癌组织明显增加,与T台呈正相关,N阶段,格里森评分,PSA水平(52]。郭先生和他的同事们还显示,HNRNPC高度肺腺癌中表达明显(LUAD)组织和有关吸烟史、淋巴结转移和预后不良。因此,HNRNPC LUAD病人[表达式是一个独立的预后因素53]。相对地,王等人发现,在多形性胶质母细胞瘤(GBM),更高的表达HNRNPC与更好的预后有关(54]。这可能是由于肿瘤的异质性和不同操作方式的hnRNPs在各种癌症14]。

自HNRNPC据报道,调节癌症恶化通过多样化的系统(21,55),其肿瘤促进作用的具体机制pRCC之际,一个不可避免的问题。的原因,随后GSVA,功能充实和途径进行了注释,旨在揭示底层驱动事件由HNRNPC pRCC发展。正如预期的那样,结果去和KEGG分析被证明是与pre-mRNA处理和信使rna代谢紧密相关,和HNRNPC从根本上规范pRCC作为剪接体的重要组成。此外,GSVA显示显著差异表达途径pRCC配对样本,和那些有特点的“MYC / E2F目标,”“G2M检查站,”和“DNA修复”突出高表达的肿瘤组织。发表的研究已经证实,原癌基因mRNA hnRNPs的可以作为一个潜在的目标。黄等人报道,在Linc-RoR-mediated原癌基因表达系统,HNRNPI可能的基本设备是必不可少的它们之间的交互56]。有趣的是,大卫和他的同事们发现,原癌基因转录调节蛋白水平的几个hnRNPs,因此也许M2亚型的可变剪接的丙酮酸激酶(PKM2) mRNA影响肿瘤细胞增殖57]。这些发现表明潜在的相互监管原癌基因和hnRNPs之间的关系,强调其在肿瘤发展重要和不可分割的作用。G2 / M细胞周期检查点,也称为DNA损伤检查点,有助于防止细胞进入有丝分裂(有丝分裂期)基因组DNA损伤。p53在这个生物过程,通常是由DNA损伤检查点激酶激活规范同时G1 / S和G2 / M检查点(58]。通过将RNA结合蛋白,Cannell等人透露,hnRNPA0蛋白质的主要基质检查点激酶MK2型,它执行细胞周期阻滞和提升抗DNA损害化疗通过针对mRNA控制了G2 / M DNA损伤检查点(59]。同样,hnRNPA0 Konishi等人报道了抑制细胞凋亡,促进有丝分裂的维护G2 / m期,因此在结直肠癌细胞发挥肿瘤助长的作用[60]。据我们所知,本研究是第一个将关注HNRNPC之间的关系和G2 / M检查点通路在肿瘤的研究中。我们希望提供一个新颖的见解修炼6核糖核酸甲基化与细胞周期控制作为未来前景的研究课题。

根据先前的研究,HNRNPC报道调节免疫抑制肿瘤微环境中的事件(61年,62年),我们进行可比分析HNRNPC发现它在免疫系统中的作用。其中,代表性的方法包括估计算法和ssGSEA评估免疫渗透水平。根据先前的研究,HNRNPC被证明是显著抑制免疫活动的内部pRCC [46]。总而言之,我们认为HNRNPC表达式并支持免疫水平渗透时间的预测pRCC和获得适用的临床价值。

作为米6核糖核酸甲基化获得越来越受欢迎在肾癌的研究中,大量的功能基因和通路在pRCC被认为参与这个过程。通过全面的生物信息学分析,杨et al。45),陈等人。46),和太阳等。47分别构造m6核糖核酸甲基化基因风险签名作为pRCC预后的生物标志物。有趣的是,HNRNPC似乎讨论的大部分基因在这些同类的研究中心。在这些研究中,它显示了强劲的临床相关性和独立的预后功能,这与我们的研究结果在很大程度上是相一致的。尽管在线研究的新兴趋势,仍有一个紧急呼吁更有说服力的调查。另外做一个互补的研究中,我们通过分子和细胞生物学基本实验方法执行。qPCR和包含IHC分析清楚地验证的预测表达式模式HNRNPC pRCC。HNRNPC mRNA水平和蛋白水平在统计学上调节比正常组织的肿瘤组织。后来,功能化验的结果证明在pRCC HNRNPC细胞系的明显的致癌作用。综上所述,这些研究结果建立强劲pRCC HNRNPC的肿瘤相关作用。

5。结论

我们的研究进行了全面的生物信息学分析6信使核糖核酸甲基化监管机构,HNRNPC pRCC不可或缺的风险因素。作为一个读者,HNRNPC产生深远的影响在pRCC患者肿瘤进展和临床结果,它可能是一个潜在的目标在未来更有前途的治疗。

数据可用性

我们使用的数据来支持这个研究的发现是本研究中提到的。其他相关数据,支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

涉及人类受试者的研究和临床样本通过南京医科大学第一附属医院(2021 - sr - 430)。

病人提供他们的书面知情同意参与这项研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,属于这个工作。

作者的贡献

XY。王,ZJ。王研究的构思进行了全方位的设计。JJ。吴,丫。魏,CK。苗进行实验和写论文。CK。苗族和某人王修订。所有作者阅读和批准这个手稿的最终版本。 All authors agreed to be accountable for all aspects of the work. Jiajin Wu, Yuang Wei, Chenkui Miao, and Songbo Wang contributed equally to this work.

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号81270685和81270685),南京工程科学和技术委员会(201605001),和江苏省“333”项目(没有。BRA2018083)。创建流程图http://BioRender.com。

补充材料

HNRNPC图S1:基因突变频率。(A, B) cBioPortal数据库调查获得的突变频率和基因改变的地位HNRNPC跨多个癌症类型。(C)的突变频率网站和病例数HNRNPC基因改变。(D)之间的相关性拷贝数变异(CNV)的HNRNPC和免疫细胞的渗透水平。图S2: PPI网络的建设。(一)GeneMANIA数据库被用来建立PPI网络。(B)与Metascape PPI网络的建设网站和集群和所示 价值。图S3: GSEA TCGA HNRNPC-related基因群的。(A)的热图的前50名与HNRNPC coexpressed基因。(B) GSEA显示相关的五大重要途径。图S4:存在验证HNRNPC相对表达的。(A)的相对表达HNRNPC 769 - p细胞转染si-NC或si-HNRNPC。(B)的相对表达HNRNPC Caki-2细胞转染si-NC或si-HNRNPC。(C)的相对表达HNRNPC 769 - p细胞转染与消极控制慢病毒或超表达慢病毒。(D)的相对表达HNRNPC Caki-2细胞转染与消极控制慢病毒或超表达慢病毒。数据呈现的 ; 。表S1:寡核苷酸序列用于这项研究。表S2:单变量和多变量Cox回归分析HNRNPC总生存期(OS)。(补充材料)