文摘

背景。圆形RNA-RNA聚合酶的影响我和第三单元C (circPOLR1C)食道癌(EC)并没有被报道。在此,本研究旨在揭开circPOLR1C在EC和监管机制的影响。方法。在EC circPOLR1C组织和细胞的表达检测中存在。循环结构、稳定性和细胞定位circPOLR1C经存在,核糖核酸酶R,放线菌素D,荧光原位杂交试验(鱼)。细胞功能实验,裸鼠异种移植、肺移植模型,他染色进行评估CircPOLR1C对电子商务的影响在体外和在活的有机体内。监管关系mir - 361 - 3 - p和circPOLR1C证实了存在,circRNA在活的有机体内降水、RIP、鱼、CircInteractome数据库,dual-luciferase记者分析,免疫组织化学。救援实验应用于评估的影响mir - 361 - 3 - p和circPOLR1C EC细胞和组织。细胞凋亡和epithelial-mesenchymal转换(EMT) -相关基因表达式被存在量化和免疫印迹。结果。高度表达circPOLR1C EC与肿瘤分化和入侵。circPOLR1C,主要存在于细胞质中,是一个稳定的环状RNA。circPOLR1C沉默抑制circPOLR1C表达和EC细胞恶性功能,而circPOLR1C超表达促进移植肿瘤的生长和肺转移。mir - 361 - 3 p的浓缩高于其他针对性的microrna。circPOLR1C吸附mir - 361 - 3 - p调节细胞凋亡和EMT-related基因和部分逆转的肿瘤抑制效果mir - 361 - 3 - p,低表达在EC组织。沉默的目标基因mir - 361 - 3 - p也抑制了EC细胞的恶性发展。结论。circPOLR1C吸附mir - 361 - 3 - p和调节细胞凋亡和EMT-related基因表达,促进电子商务的发展。

1。介绍

食道癌(EC)在世界范围内癌症发病率占了第八的位置和全球癌症死亡原因(排名第六1]。因此,电子商务已经成为主要的公共卫生问题,极大地威胁着人们的生活。根据中国肿瘤登记数据,EC的发病率排名第五的癌症发病率(总2]。此外,2012年的调查数据显示,中国拥有世界上最大的电子商务的新病例数(3]。EC的组织学类型主要分为食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌。自1970年代以来,ESCC的发病率在许多西方国家已经显示出下降的趋势,而食管腺癌的发病率迅速增加,成为增长最快的恶性肿瘤之一4,5]。因此,洞察EC的发病机制,寻找早期诊断和干预的目标,探讨预后的生物标志物EC的预防和治疗具有重要意义。

与大多数肿瘤相似,电子商务是一种复杂的疾病,涉及多个因素,多个基因,和多个发展阶段。其发生和发展的分子机制尚未完全阐明,(6]。在探索电子商务的发病机制,除了致癌基因,肿瘤抑制基因,细胞因子,和其他监管因素,非编码RNA已经成为一个新的方向为癌症研究人员由于其重要的作用[7]。圆形的RNA (circRNAs)单链RNA的闭环结构,是一个重要的非编码RNA的家人(8]。一些研究报道,circRNA可能影响电子商务的发展。例如,通过在活的有机体内和在体外实验,唱歌等人证实,circRNA ciRS-7促进ESCC的发展,骗取mir - 876 - 5 - p上调MAGE-A信号(9]。因为circGSK3的高表达β被发现呈正相关,ESCC和预后不良的发展,胡锦涛等人建议,circGSK3水平β应该使用在等离子体的诊断和预后的生物标志物ESCC患者(10]。

RNA聚合酶I和第三单元C (POLR1C)是一个基因编码共享POLR1和POLR3子单元(11]。研究表明,POLR1C (hsa_circ_0076535)中扮演着重要角色在天生综合症和白细胞萎缩症(12,13]。约瑟夫等人提出,POLR1C的表达可能与三阴性乳腺癌患者的预后相关(14]。先前的研究已经报道,circPOLR1C (hsa_circ_0076535)是电子商务中高度表达的组织(15),但在EC circPOLR1C的监管机制尚未报道。上述研究的基础上,本研究进一步探讨的作用和机制circPOLR1C由线性POLR1C EC环合,以补充的circRNA EC表达谱和功能。

2。方法

2.1。道德的声明

由于本研究涉及临床试验和动物实验中,研究小组获得伦理委员会批准,中山医院,复旦大学(排名201701007 xhk),实验动物和委员会中山医院,复旦大学(排名201810003 xhk),分别。与患者和家属协商后,患者签署知情同意书,同意捐赠样本的EC和邻近组织局限于科学实验研究。动物实验动物伦理要求严格执行的必要性研究,标准化的操作,对实验动物的保护。

2.2。组织样本集合

从2017年1月至2018年12月,46名患者病理诊断原发性ESCC的胃肠病学的医院,手术前没有接受放疗或化疗,是包括在这项研究中。电子商务组织和邻近组织(≤3厘米的肿瘤组织,约1厘米³期间收集的)患者食管切除术并迅速放在RNA储物柜。手术后,组织存储在−20°C,供以后使用。之后,我们还分析了相关性circPOLR1C表达与性别、年龄、肿瘤大小(cm),分化,肿瘤侵犯(T),淋巴结转移、TNM阶段,和其他病人的临床资料。

2.3。EC细胞培养

为了澄清circPOLR1C对EC细胞的生物功能的影响,我们购买了人类食管正常细胞系Het-1A(写明ATCC®crl - 2692™,美式文化集合)和各种EC细胞系(Procell KYSE-30, cl - 0577,中国;Procell KYSE150, cl - 0638,中国;kyse - 220,实验室保存;四渎,实验室保存;mz - 1077, EC9706 MingZhouBio、中国)和微分表达式进行研究。根据制造商的指示,细胞培养与他们特定的完整细胞培养基如下:Het-1A细胞培养在BEGM™支气管上皮细胞生长培养基(cc - 3171, Lonza / Clonetics公司、瑞士)含胎牛血清(的边后卫,10%,sfb、Bovogen、澳大利亚);KYSE-30 KYSE150, kyse - 220和四渎细胞维持rpmi - 1640中(中国Procell PM150110)补充与火腿F-12营养混合物(中国Procell PM150810)的边后卫(10%),和penicillin-streptomycin解决方案(P / S, 1%, PB180120 Procell,中国);EC9706细胞生长在高糖杜尔贝科修改鹰的介质(美国Gibco DMEM, C11995500BT)混合的边后卫(10%)和P / S (1%)。所有细胞培养在MCO-20AIC有限公司5%₂孵化器(日本三洋)37°C。

2.4。提取的RNA

RNA的提取方法指的是现有文献报道。短暂,试剂盒(1毫升,15596018,英杰公司,美国)是用于分离从细胞RNA和其他组件。后的三氯甲烷(200μL, T819285 Macklin,中国)和随后的离心分离,混合解决方案分为水(含RNA)和有机阶段。接下来,异丙醇(500μL, I811932 Macklin,中国)添加到恢复RNA沉淀。此后,所得沉淀溶解了适量的diethylpyrocarbonate (DEPC)水,之后RNA浓度检测利用量子位™4荧光计(美国ThermoFisher Q33226)。后来,RNA的解决方案是存储在一个冰箱在−80°C。确定具体表达式circPOLR1C的细胞,细胞质和细胞核分离,RNA提取使用分钟™细胞质和核分离设备(sc - 003、发明、中国)。

2.5。核糖核酸酶R (R)核糖核酸酶治疗

核糖核酸酶R是一个3′5′核糖核酸酶的大肠杆菌RNR总科,裂开RNA的功能(16]。核糖核酸酶R (R0301、杰纳西、中国)治疗前需要circPOLR1C浓缩的分析和识别,因为几乎所有线性rna核糖核酸酶R可以消化,但它不是容易消化循环rna。具体地说,10 U R核糖核酸酶添加到2.5μg总RNA,由此产生的混合是在37°C的环境中30分钟(min)。

2.6。RNA逆转录定量实时聚合酶链反应(存在)

美国英杰公司™M-MLV逆转录酶(28025021)用于反向转录的RNA的互补。随后,结核病绿色®预混料交货Taq™II (RNaseH + Tli)火箭+试剂(RR82LR)和SmartChip™实时PCR系统(640022)从豆类订购(日本)应用实施中存在下列条件:在95°C predenaturation 10分钟,变性在95°C 15秒(s),和退火60°C 1分钟,总共40周期。在这项研究中使用的引物序列都是补充表1。GAPDH和U6被视为内部引用在这个研究。使用2相对表达水平计算^−ΔΔCT方法(17]。

2.7。放线菌素D转录抑制实验

放线菌素D来抑制RNA合成,干扰细胞转录过程。简而言之,EC细胞被播种在24-well板块5×10的密度⁴细胞/好,5试验井在每组设置。然后,2μg / ml放线菌素D(美国MedChemexpress hy - 17559)被添加到细胞中。增加放线菌素D后,RNA在细胞中提取在0小时(h), 4 h, 8 h、12小时、24小时和检测到存在。

2.8。RNA荧光原位杂交(鱼)

biotin-labeled mir - 361 - 3 - p探测器(biotin-GGGGGTCCACACTAAGACT-biotin)和digoxin-labeled circPOLR1C探针(circPOLR1C digoxin-TCCGGAATCTACATTTATTTGAGTGGGTTTGTTGTGCCTCGTCCCGATGATCCTGCGTG-digoxin)合成了北京Abace生物有限公司有限公司是添加到EC细胞。biotin-labeled mir - 361 - 3 - p探测器可以探测到Cy5-streptavidin(016-170-084,杰克逊,美国)用红颜色。同样,digoxin-labeled circPOLR1C探针可以确定使用Alexa萤石™488 Tyramide SuperBoost™工具(美国表达载体B40932)和绿色。此外,核可以由4,彩色6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。观察之后,最后的实验结果和分析通过使用徕卡DMi8倒置荧光显微镜(德国)低于400×放大。

2.9。转染

广州杰纳西生物公司(中国)提供质粒中也是circPOLR1C circPOLR1C小干扰RNA (sicircPOLR1C;CCCAAACAACACGGAGACGGA),小干扰RNA双特异性磷酸酶2 (siDUSP2),和小干扰RNA的抑制细胞凋亡(siXIAP)和沉默BCL2凋亡调节器(siBCL2),以及他们消极的控制。mir - 361 - 3 - p模仿(M;miR40004682-4-5)和mir - 361 - 3 - p抑制剂(我;从RIBOBIO miR30004682-4-5)购买。接下来,Lipofectamine 3000工具包(美国ThermoFisher L3000008)被用来使转染质粒进入细胞。细胞转染48 h后,转染效率检测中存在。

2.10。circRNA在活的有机体内降水(circRIP)

circRIP试验进行净化和分析RNA或microrna circPOLR1C有关。具体地说,biotin-labeled DNA探针(上海生物科技有限公司。探针序列,TACATTTATTTGAGTGGGTTTGTTGTGCCTCGTCCCGATGATCCTGCGTGCGCGCTCT-biotin),特别是绑定circPOLR1C转染到EC细胞。24小时后,这些细胞被洗PBS和1%甲醛固定10分钟。接下来,细胞治疗1毫升里帕裂解和提取缓冲(美国89901年,热科学™)然后放在超声波干扰仪器(sm - 150 d, Shunma技术,中国)10分钟。此后,上层清液收集然后孵化Dynabeads™m - 280链霉亲和素(11205 d,英杰公司™,美国)在30°C 12 h。最终,混合解决方案是进一步处理英杰公司™蛋白酶K的解决方案(美国AM2546),其次是RNA提取,逆转录和存在。

2.11。RNA免疫沉淀反应(RIP)

RIP是使用抗体靶蛋白沉淀目标蛋白质和RNA绑定到它。分离和纯化后,RNA可以检测和分析复杂的存在。按照相关文献[18),我们使用了杰纳西RNA免疫沉淀反应工具包(P0101,中国)来完成检测。circANRIL被用作负控制实验中,没有绑定到Argonaute-2 (AGO2)抗体(英国Abcam ab32381)。

2.12。细胞计数工具包(CCK) 8化验

EC细胞消化和播种在96 -孔板的密度1×10⁴细胞/。接下来,10μL CCK-8试剂的慢慢添加到96孔板的底部包含肿瘤细胞,以防止气泡。然后,这些细胞被孵化在37°C公司为5%₂随后发现通过使用SpectraMax®®范式多功能微型板块读者(分子器件、美国)的波长450 nm。最后,光密度值(OD)记录在0 h, 24小时和48小时。

2.13。细胞克隆形成实验

EC细胞转染sicircPOLR1C或mir - 361 - 3 - p模仿第一次消化Trypsin-EDTA解决方案(美国0.25%,25200072,GIBCO)然后制成细胞悬液的浓度为3×10⁴细胞/毫升。此后,甲醇固定(15分钟)和染色(美国σG4507-5G)染色(20分钟)。最终,完全干细胞被置于一个徕卡DMi8显微镜(德国)观察细胞形成的殖民地为了检测细胞增殖。

2.14。划痕试验

简化EC细胞(3×10⁵细胞/)被播种12-well盘子。在孵化后一个MCO-20AIC有限公司₂孵化器在37°C 24 h,无菌吸管应用于垂直画平行线在板(1公分)。接下来,PBS是用来洗浮板细胞和碎片。随后,细胞无血清培养液添加到相应的细胞。48 h后,12-well盘子又包含细胞在显微镜下观察和拍摄的放大100倍。最终,迁移率计算评估不同干预条件下对EC细胞迁移的影响。

2.15。Transwell化验

根据制造商的指示,与8 Transwell室μ米孔隙聚碳酸酯膜插入和基底膜基质从BD购买生物科学(美国)被安装和补充道,分别。简而言之,EC细胞(5×10⁴细胞/)接种的上院设备人工基底膜覆盖,和众议院补充完整中包含的边后卫。48小时后,这些细胞被收获,固定在多聚甲醛(4%)为30分钟,与结晶紫染色(0.1%)10分钟。最后,观察细胞入侵的变化通过使用徕卡DMi8显微镜(德国)低于250×放大,然后通过计算细胞的入侵。

2.16。流式细胞术

细胞凋亡的重要基本生理功能的细胞,流式细胞仪检测。总之,1×10⁵EC细胞接种到500年μL稀释1×膜联蛋白V绑定缓冲膜联蛋白的工作解决方案根据指令V-FITC /π荧光双染色凋亡检测设备(p - ca - 201, Procell,中国),其次是被混合成细胞悬液。随后,5μL的膜联蛋白V-FITC和5μL (propidium碘(π)染色解决方案添加到EC细胞悬液在序列。混合物在室温下混合,然后孵化了20分钟。反应后,液体被转移到DxFLEX流式细胞分析仪(美国后方Coulter)进行进一步的分析和检测。

2.17。肿瘤形成实验和转移实验老鼠的裸体照片

72名男性BALB / C裸小鼠(6周大,重量18±1 g)中使用的实验都从广东购买医学实验动物中心(GDMLAC)。实验动物在SPF-level实验动物中心,他们可以自由吃喝。48个裸体小鼠随机分为8组(6小鼠/组)根据体重后3天的喂养。数控+ MC组的小鼠注射KYSE-30或EC9706细胞转染负控制和mir - 361 - 3 - p模拟控制;老鼠circPOLR1C + MC组注射KYSE-30或EC9706细胞转染circPOLR1C超表达质粒和mir - 361 - 3 - p模拟控制;老鼠在数控+ M组注射KYSE-30或EC9706细胞转染负控制和mir - 361 - 3 - p模仿;老鼠在circPOLR1C + M组注射KYSE-30细胞或EC9706细胞的超表达质粒转染circPOLR1C和mir - 361 - 3 p模仿。1×10⁵细胞被注入每个裸鼠皮下注射进入左腋窝。为了确保转染细胞的及时性,我们补充注射一周一次。肿瘤体积(毫米³,直径长直径××短直径/ 2)每5天用游标卡尺测量。所有动物都牺牲在注射后35天,在那之后,移植肿瘤摘除,拍照,和体重。

BALB / C裸小鼠也用于肺转移的实验。24裸体小鼠随机分为8组(3老鼠/组)根据同一分组原则如前所述。肺移植模型是由注射KYSE-30或EC9706细胞(1×10⁵通过尾静脉的老鼠细胞)。补充注射后以同样的方式如前所述(一周一次),所有裸体小鼠牺牲在八周后注入和肺组织收集。

2.18。Hematoxylin-Eosin(他)染色

移植肿瘤在4%多聚甲醛固定,梯度脱水,嵌入在石蜡切片。脱蜡、水化部分被苏木精试剂(B25380-20毫克、原液、中国)和伊红试剂(Solarbio g1100——500年,中国)。染色后,切片被再次与梯度酒精脱水,莱卡DMi8荧光显微镜下观察到的放大100倍。

2.19。目标预测和验证

CircInteractome (https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)是利用预测microrna能绑定到circPOLR1C和识别结合位点。此外,母星数据库(https://starbase.sysu.edu.cn/)应用于分析目标基因与结合位点mir - 361 - 3 - p。然后,dual-luciferase记者进行了试验检测的具体序列结合转录因子及其启动子目标。野生型(WT: circPOLR1C-WT DUSP2-WT、XIAP-WT和BCL2-WT)和变异(傻瓜:circPOLR1C-MUT, DUSP2-MUT XIAP-MUT, BCL2-MUT)记者质粒构建使用pmirGLO质粒(CL414-01、生物医学、中国)。此后,上述记者质粒是cotransfected mir - 361 - 3 - p模仿(模仿控制)或mir - 361 - 3 - p抑制剂(抑制剂控制)为EC细胞24 h,分别。150年之后,μL 1×被动裂解缓冲和50μL荧光素酶检测试剂二世被添加到序列转染EC细胞,在那之后,混合解决方案测试两次,Promega GloMax。具体来说,在第一部分萤火虫荧光素酶活性检测。在第二部分,前者荧光反应是停在停止&如果留意,Renilla荧光素酶活性。最终,质粒活动的最终报告的分析计算,获得了萤火虫/Renilla比率。

2.20。免疫印迹

免疫印迹分为样品制备步骤,电泳,膜转移,抗原抗体结合,色彩发展(19]。总之,100年μL•瑞帕裂解缓冲(Beyotime P0013 K,中国)添加到preprepared EC细胞或组织匀浆,帮助细胞完全溶解。然后,蛋白质浓度测定用皮尔斯™快速黄金BCA蛋白质测定试剂盒(美国热科学™A53225)和SpectraMax®®范式微型板块读者。此后,40μ克蛋白质分离了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜(美国IPVH00010)从微孔购买。随后,膜被阻断剂™FL荧光阻断缓冲区(美国37565年,热科学™)2 h。抗原抗体结合的过程包括两个部分:主抗体和抗原的蛋白质绑定在4°C一夜之间,和二次抗体是公认的主要抗体蛋白质在室温为1.5 h。接下来,ECL发光液(美国微孔WBKlS0100)和凝胶Doc™XR +系统(美国BIO-RAD)是利用开发过程最终颜色。,所有使用的抗体免疫印迹从Abcam统一购买,英国。主要包括抗体针对裂解caspase-3 (ab2302 17 KD, 1: 1000), bcl - 2 (ab59348 26 KD, 1: 500),伯灵顿(ab32503, 21 KD, 1: 1000),钙粘蛋白(ab40772 97 KD, 1: 10000), N-cadherin (ab18203 130 KD, 1: 1000)、波形蛋白(ab92547 54 KD 1: 2000),双特异性磷酸酶2 (DUSP2 ab224407 24 KD, 1: 2000),凋亡的抑制蛋白(ab2541 XIAP, 54 KD, 1: 1000),和GAPDH(内部参考、ab8245 36 KD, 1: 5000)。二次抗体包括山羊antirabbit抗体(ab205718, 1: 5000)和一只山羊antimouse抗体(ab150117, 1: 5000)。

2.21。免疫组织化学

石蜡的部分移植肿瘤组织之前被弥漫在海神x - 100试剂(0.01%,10分钟,KGF011、注册机、中国)。接下来,H₂O₂试剂(3%,10分钟)和山羊血清(10%,1 h, C0265 Beyotime,中国)被用来治疗切片,分别。然后,anti-Ki67抗体(SP6)(英国Abcam ab16667)稀释250倍添加一滴一滴地孵化组织切片在一夜之间在4°C。第二天,SABC-POD免疫组织化学工具包(I001-2-1、南京建成,中国)应用于染色的部分。后,彩色部分是脱水,使透明和安装。最后,观察颜色片的发展使用显微镜的放大倍数400倍来评估的积极表达ki - 67。

2.22。数据分析

使用SPSS 22.0软件进行数据分析(美国)。学生的双尾t以及用于比较两组之间的差异,和单向方差分析(方差分析)是利用多个组间对比差异。决心在统计上显著的差异 。

3所示。结果

3.1。在EC circPOLR1C的特征

circPOLR1C呈现在图的结构1(一)。我们第一次发现的微分表达式circPOLR1C EC组织和细胞。结果表明,在EC circPOLR1C组织的表达显著高于相邻正常组织(图1 (b), ),和circPOLR1C EC细胞相比,在Het-1A中高度表达的细胞(图1 (c), )。circPOLR1C之间的相关性研究的患者的临床特征,我们发现circPOLR1C表达式只是与分化和肿瘤入侵(表2, )。

我们进一步验证了圆形circPOLR1C结构,分析了阻力,稳定,和本地化的核糖核酸酶在circPOLR1C R。首先,我们使用六聚体随机引物和低聚糖(dT) 18个引物中存在circPOLR1C和线性POLR1C的分析表达式。随后,我们发现益生元(dT) 18个引物的差别导致了明显的对这些circPOLR1C但几乎不影响线性POLR1C表达式,而六聚体随机引物(图1 (d), )。这个结果证明circPOLR1C没有聚(a)尾(线性分子的特征)。circPOLR1C的稳定性实验表明,R核糖核酸酶治疗后,POLR1C水平明显下降,而circPOLR1C保持不变(图的水平1 (e), )。治疗后与放线菌素D circPOLR1C的半衰期非常长的比线性POLR1C(图1 (f), )。这部分的结果充分表明,circPOLR1C是一个稳定和非降解性RNA分子。最后,存在分析的结果和鱼实验circPOLR1C核浆分离后如图1 (g)和1 (h)。原来circPOLR1C EC细胞主要存在于细胞质中。

3.2。sicircPOLR1C对circPOLR1C表达的影响,可行性,增殖,迁移,入侵,EC细胞的凋亡

sicircPOLR1C转染KYSE-30和EC9706细胞后,sicircPOLR1C明确circPOLR1C的表达减少,虽然没有影响线性POLR1C(图2 (a), )。此外,sicircPOLR1C在生存能力的影响,增殖,迁移,入侵和EC细胞的凋亡CCK-8化验分析,克隆形成试验,划痕试验,transwell分析,流式细胞术方法。与siNC组相比,OD值(图2 (b))、菌落数(图2 (c)和2 (d)),迁移率(图2 (e)和2 (f)),和入侵率(图2 (g)和2 (h)) sicircPOLR1C KYSE-30和EC9706细胞减少的集团( ),虽然KYSE-30和EC9706细胞的凋亡率增加sicircPOLR1C组(图2 (i)和2 (j), )。这些发现表明,sicircPOLR1C显然阻碍了可行性,EC细胞增殖,迁移和入侵而促进KYSE-30和EC9706细胞的凋亡。

3.3。过表达circPOLR1C对EC-Transplanted肿瘤及肺组织的影响

为了进一步弄清circPOLR1C在电子商务的影响,我们建立的裸鼠模型EC移植和肺转移。通过记录肿瘤体积,我们发现过表达circPOLR1C增加了肿瘤体积和促进移植肿瘤的生长(图2 (k)和2(左), )。不仅如此,我们通过他染色观察肺组织泡结构明显增加circPOLR1C组与向量组相比,转染后表示肺组织明显受损的过表达circPOLR1C质粒(图2 (m))。此外,在活的有机体内实验结果表明,过表达circPOLR1C提升EC异种移植的生长,肺组织破坏。

3.4。circPOLR1C可以充当海绵mir - 361 - 3 - p和消极监管mir - 361 - 3 - p在EC低表达组织

针对这一事实报道circRNA可以作为microrna的海绵,我们证明了RIP anti-AGO2 circPOLR1C可以突出丰富的抗体(图3(一个), )和可以作为绑定AGO2和microrna的平台。在预测的microrna CircInteractome circPOLR1C可能目标,我们选择第一个6 circRIP microrna并分析他们的浓缩。如图3 (b),我们观察到,探测器专门针对circPOLR1C可以丰富circPOLR1C, mir - 361 - 3 - p,和mir - 182, mir - 361 - 3 - p是浓缩比mir - 182更明显。

进一步验证的直接绑定mir - 361 - 3 - p和circPOLR1C,我们比较的差异circPOLR1C的浓缩和circANRIL(负控制)KYSE-30 EC9706细胞使用biotin-labeled mir - 361 - 3 - p - wt和biotin-labeled mir - 361 - 3 - p -无足轻重的人。原来biotin-labeled mir - 361 - 3 - p - wt可以丰富circPOLR1C而不是circANRIL(图3 (c), )。在图3中(d), circPOLR1C的结合位点和mir - 361 - 3 - p是展出。此外,通过dual-luciferase记者分析,我们发现KYSE-30和EC9706细胞的荧光素酶活性增加circPOLR1C-WT + I组相对于circPOLR1C-WT + IC组,在荧光素酶的活性没有变化KYSE-30 EC9706细胞之间circPOLR1C-MUT + IC组和circPOLR1C-MUT + I组(图3 (e), )。此外,荧光素酶的活性KYSE-30 circPOLR1C-WT + M组和EC9706细胞减少的价格相比circPOLR1C-WT + MC集团(图3 (f), )。这些结果证明,mir - 361 - 3 - p可以用circPOLR1C绑定。此外,鱼直接实验的结果证明了colocalization circPOLR1C和mir - 361 - 3 - p (g)的(图3)。

在实验结果的相互调节mir - 361 - 3 p和circPOLR1C sicircPOLR1C发现移植mir - 361 - 3 - p的表达在EC细胞(图3 (h), ),而过表达circPOLR1C产生相反的影响(图3(我), )。如图3 (j)和3 (k), mir - 361 - 3 - p的表达是明确低EC组织比相邻的组织(图3 (j), )和mir - 361 - 3 - p表达在EC circPOLR1C组织的表达呈负相关(图3 (k), ,r=−0.388)。

3.5。mir - 361 - 3 - p的影响模拟和circPOLR1C过度mir - 361 - 3 - p表达式,生存能力,增殖,迁移,入侵,EC细胞的凋亡

后mir - 361 - 3 p模仿和circPOLR1C超表达质粒转染KYSE-30和EC9706细胞,我们检查了他们的监管和交互的可行性,增殖,迁移,入侵,凋亡细胞癌。mir - 361 - 3 - p明显模仿调节mir - 361 - 3 - p的表达在EC细胞,但部分扭转了这一趋势circPOLR1C超表达(图4 (a), )。的EC细胞的基本生理功能,我们发现mir - 361 - 3 - p模仿抑制活力,增殖,迁移和入侵(图4 (b) 4 (h), )和增强EC细胞的细胞凋亡(图4 (i)和4 (j), ),而circPOLR1C过度产生相反的监管效果(图4 (b) 4 (j), )。更重要的是,circPOLR1C超表达部分抵消的监管影响mir - 361 - 3 - p模仿上面的基本生物功能的EC细胞(图4 (b) 4 (j), )。

3.6。监管的mir - 361 - 3 - p模仿和circPOLR1C Apoptosis-Related基因过度表达,Epithelial-Mesenchymal过渡(EMT) -相关基因,和致癌基因

机制研究的mir - 361 - 3 - p和circPOLR1C,我们发现mir - 361 - 3 - p模拟调节蛋白质的表达裂解caspase-3,伯灵顿,和钙粘蛋白mRNA水平的伯灵顿和钙粘蛋白表达下调蛋白质表达和bcl - 2 mRNA水平N-cadherin和波形蛋白(补充图1 (a) 1 (f), )。此外。过度的CircPOLR1C面对面,部分逆转mir - 361 - 3 - p的影响模拟bcl - 2的表达,伯灵顿,Caspase-3裂解,钙N-Cadherin和波形蛋白(补充图1 (a) 1 (f), )。

通过存在,我们进一步筛选不同的致癌基因和凋亡信号通路,mir - 361 - 3 - p和circPOLR1C可能参与,如SH2B1、剪接因子3 b亚基3 (SF3B3) DUSP2, cysteine-rich血管生成诱导物61 (CYR61), XIAP, O3 (FOXO3) forkhead盒子,bcl - 2。结果表明,mir - 361 - 3 - p明显阻碍了mRNA的表达DUSP2, XIAP和bcl - 2,而circPOLR1C过度产生相反的监管效果(补充图1 (g)和1 (h), )。此外,circPOLR1C超表达部分逆转的抑制性影响mir - 361 - 3 - p DUSP2模仿,XIAP和bcl - 2表达水平(补充图1 (g)和1 (h), )。随后,我们进一步发现上述差异表达基因在免疫印迹,发现circPOLR1C超表达促进了蛋白质表达DUSP2, XIAP,和bcl - 2,而mir - 361 - 3 - p模仿抑制蛋白质的表达DUSP2, XIAP和bcl - 2(补充图1 (i)和1 (j), )。此外,circPOLR1C超表达部分否定的抑制作用mir - 361 - 3 - p DUSP2模仿,XIAP和bcl - 2表达水平(补充图1 (i)和1 (j), )。这些实验结果表明,circPOLR1C过度可能部分中和的监管效果mir - 361 - 3 - p模仿细胞凋亡和EMT-related基因。

3.7。mir - 361 - 3 - p可能目标DUSP2 XIAP和BCL2

基于之前的研究结果,我们进一步验证了绑定mir - 361 - 3 p DUSP2 XIAP和BCL2 dual-luciferase记者分析。与野生型细胞cotransfected报告基因和mir - 361 - 3 - p模仿,EC细胞的荧光素酶活性显著低于控制细胞(图5 (a) 5 (f), )。这些结果表明,DUSP2 XIAP, BCL2可以绑定到mir - 361 - 3 - p。

3.8。影响siDUSP2、siXIAP siBCL2 EC细胞的基本功能

我们进一步验证靶基因的影响在EC细胞基本功能的基因沉默的途径。结果,我们发现siDUSP2的抑制影响的差异,siXIAP, siBCL2 EC细胞的基本生物功能。例如,siXIAP和siBCL2显然阻碍了电子商务的可行性和扩散细胞(图6 (a) 6 (c), ),但siDUSP2的抑制效应不显著(图6 (a) 6 (c))。EC细胞的迁移和入侵,尽管siDUSP2, siXIAP, siBCL2 EC细胞的迁移和入侵(图6 (d)和6 (e)和补充图2 (a)和2 (b), ),siDUSP2的抑制效果更明显。此外,三个基因的沉默EC凋亡细胞的比例增加,其中siXIAP产生更重大的影响(补充图2 (c)和2 (d), )。

3.9。mir - 361 - 3 - p的影响模拟和circPOLR1C异种移植肿瘤的生长,Apoptosis-Related基因,circPOLR1C, mir - 361 - 3 - p,和ki - 67表达式在活的有机体内

的在活的有机体内实验是为了验证的监管影响mir - 361 - 3 - p模仿和过表达circPOLR1C EC。如图7所示(一个)7 (f), mir - 361 - 3 - p模仿显著抑制移植肿瘤的重量和体积的增加( ),虽然这种效应被过表达circPOLR1C部分逆转(图7 (a) 7 (f), )。类似于在体外细胞实验,mir - 361 - 3 - p模拟调节蛋白质的表达裂解caspase-3和伯灵顿伯灵顿的mRNA水平但表达下调的蛋白表达和bcl - 2 mRNA水平(图7 (g)和7(我), )。同时,过表达circPOLR1C部分无效的监管影响mir - 361 - 3 - p模仿EC细胞(图7 (g)和7(我), )。

在此,在活的有机体内发现circPOLR1C表达调控和mir - 361 - 3 - p在移植肿瘤组织也符合的结果在体外实验。如图8 8 (a)和(b), mir - 361 - 3 - p模仿circPOLR1C的表达没有影响,而中circPOLR1C镇压的mRNA表达mir - 361 - 3 - p ( )。此外,ki - 67的表达在免疫组织化学组织进行了分析。结果在图8中所示(c)。与数控+ MC组相比,数控的棕色阳性表达面积+ M组显著降低。后circPOLR1C cotransfection,阳性表达面积circPOLR1C + M组显式地增加的价格相比数控+ M组。

我们从肺移植模型小鼠肺组织中提取。他染色和肺结节的结果统计表明,circPOLR1C过度增加肺组织病理损伤和肺结节的数量,而mir - 361 - 3 - p模仿了相反的效果(图8 (d)和8 (e), )。更重要的是,circPOLR1C中和的保护作用mir - 361 - 3 - p模仿。

4所示。讨论

电子商务是一种食管恶性肿瘤的起源。虽然在过去的几十年里,取得了重大进步EC的治疗结合手术切除后,新辅助化疗、放疗、生物治疗。然而,缺乏早期诊断和治疗仍然使EC患者的总体生存率低(20.]。非编码rna的发现和已知的生物功能提供了一个新的方向EC的预防和治疗。凭借其特殊的共价闭环结构,circRNA保护自己免受来自exonuclease-mediated退化,所以circRNA具有高稳定性的表达8]。在这项研究中,我们进一步发现在EC circPOLR1C组织和细胞的表达,探讨circPOLR1C是否循环,并验证其稳定性和细胞定位。因此,我们证明了circPOLR1C EC细胞中大量表达,主要位于细胞质circRNA分子具有高稳定性。此外,我们表明,circPOLR1C, EC中高度表达,与肿瘤分化和相关性EC细胞的入侵。此外,推倒circPOLR1C表达抑制增殖和转移促进了EC细胞的凋亡,而调节circPOLR1C提升EC异种移植的生长和转移。值得注意的是,这些实验结果并没有在以前的研究报道。

目前,很少有研究在EC circRNA干预。circRNAs,比如circRAD23B [21],ciRS-7 [22],circRNA_100367 [23),规范电子商务的出现和发展,据报道,其机制主要基于circRNA充当一个microrna的海绵。circRNA的显著特征,本研究进一步探讨circPOLR1C是否可以绑定microrna。结果表明,circPOLR1C可以吸附mir - 361 - 3 - p形成竞争海绵mir - 361 - 3 - p,部分逆转的监管效果在EC mir - 361 - 3 - p。

异常表达mir - 361 - 3 - p报道与多种肿瘤细胞的增殖和凋亡。例如,低mir - 361 - 3 - p的表达减弱非小细胞肺癌细胞的扩散和转移通过抑制SH2B1基因(3]。此外,mir - 361 - 3 - p,这也是低表达在视网膜母细胞瘤,已经被证明可以通过针对嘘信号产生一个肿瘤抑制作用(24]。类似于上面的研究成果,mir - 361 - 3的表达在EC - p组织被发现在这项研究中,减少过度的mir - 361 - 3 - p还抑制增殖和转移促进EC细胞的凋亡。这一结果表明,mir - 361 - 3 - p在EC作为一个肿瘤抑制基因。除了癌症抑制,mir - 361 - 3 - p也被证实有促进作用。如前所述,mir - 361 - 3 - p提高胰腺导管腺癌的EMT过程细胞通过调节DUSP2 / ERK轴(25]。此外,据报道,mir - 361 - 3的促进效应- p与异常高表达在乳腺癌组织中是通过抑制E2F1 / P73途径[26]。这些发现表明mir - 361 - 3 - p可以产生不同的刺激作用在不同类型的癌症。除了监管mir - 361 - 3 - p的角色本身,mir - 361 - 3 - p是circRNA的目标基因,这也是受circRNA和干扰肿瘤恶化。陈等人。27]发现circRNA 100146结合mir - 361 - 3 - p在非小细胞肺癌调节下游mRNA。王等人。28)证实的海绵mir - 361 - 3 - p, circ-MYBL2促进宫颈癌细胞的生长和转移。hsa_circ_0011385,也充当一个海绵和负调节mir - 361 - 3 - p,对甲状腺癌有明显的促进作用(29日]。这些研究证据强烈支持我们的研究结果,mir - 361 - 3 - p, circPOLR1C的目标基因,由circPOLR1C吸附,消极监管。同时,这项研究表明,circPOLR1C调节EC细胞凋亡和EMT-related基因通过吸附mir - 361 - 3 - p。

伯灵顿,裂解caspase-3 bcl - 2, DUSP2, XIAP的关键基因调节细胞凋亡的过程。之前的研究表明,BIR地区XIAP结构可以抑制半胱天冬酶活性,是XIAP凋亡效应变化的关键(30.]。此外,过度的DUSP2促进异位基质细胞的凋亡31日]。同时,凋亡基因bcl - 2可以直接调节线粒体膜的通透性,防止细胞色素C的释放到细胞质中,从而抑制caspase-3的激活和防止细胞凋亡32]。相反,伯灵顿的bcl - 2家族一样有很大的proapoptotic效应(32]。值得注意的是,在这项研究中,我们发现,过度的circPOLR1C吸附mir - 361 - 3 - p和部分抵消mir - 361 - 3 - p的影响表达下调的凋亡基因(bcl - 2、DUSP2 XIAP)和移植proapoptotic基因的水平(裂解caspase-3和伯灵顿),最终抑制EC细胞的凋亡。有越来越多的证据支持EMT扮演着一个重要的角色在癌细胞迁移和入侵,可以由钙N-Cadherin和波形蛋白。例如,焦虑等。33)提出,钙粘蛋白的转换N-cadherin激活EMT过程是一个重要的原因。此外,upregulation波形蛋白激活TGF -β途径和诱发EMT过程(34]。同样,在这项研究中,我们也发现过表达circPOLR1C逆转mir - 361 - 3的规定- p在钙N-cadherin,波形蛋白和提升EC细胞的迁移和入侵。

5。结论

总之,本研究证实circPOLR1C, EC中高度表达的组织和细胞,促进异种移植生长,肺转移、扩散和转移抑制EC细胞的凋亡。具体机制是调节与细胞凋亡相关的基因和EMT通过吸附和抑制mir - 361 - 3 - p。在某种程度上,本研究进一步丰富了EC circRNA干预的基础研究参数。

数据可用性

在研究过程中生成的数据集分析是合理的请求可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

永方负责概念和设计。小君,亚星沈,郝Wang汉Tang和陈Xiaosang负责数据采集、数据分析和解释。永方负责撰写初稿和批判性的修改手稿。永芳,小君阴,亚星沈,汉族Tang和郝Wang Xiaosang陈负责批准发布最终版本的手稿。永芳,小君阴,亚星沈,汉族,郝Wang和陈Xiaosang同意负责所有方面的工作,确保相关工作的准确性或完整性问题是适当的调查和解决。

补充材料

补充数据:补充图1。mir - 361 - 3的规定- p模仿和过表达circPOLR1C apoptosis-related基因,epithelial-mesenchymal过渡(EMT) -相关基因,和致癌基因。(a, b)的影响mir - 361 - 3 - p模仿和circPOLR1C mRNA水平的细胞凋亡,EMT-related基因检测到存在。GAPDH是用作内部参考。(c) - (f)的影响mir - 361 - 3 - p模仿和circPOLR1C细胞死亡的蛋白质含量和EMT-related通过免疫印迹基因进行了评估。GAPDH应用作为内部参考。(g) - (h)中存在被用来屏幕不同的致癌基因和凋亡信号通路,mir - 361 - 3 - p和circPOLR1C可能参与。GAPDH是利用内部参考。免疫印迹(i, j)是用于检测凋亡信号通路的蛋白表达。GAPDH作为内部参考。 All experiments were independently performed in triplicate. ; 与数控+ MC;^ ^ ^ 与数控+ M;^{# #} ;^{# # #} 与circPOLR1C + MC。补充图2。影响siDUSP2、siXIAP siBCL2入侵和EC细胞的凋亡。(a, b) siDUSP2的影响,siXIAP, siBCL2 EC细胞的入侵被transwell评估试验在250 x放大。(c, d) siDUSP2的影响,siXIAP, siBCL2 EC凋亡的细胞流式细胞仪测定。所有的实验都是独立执行一式三份。 ; ; 与siNC。(补充材料)