文摘
在东方医学,蜂毒一直被用作治疗代理对炎性疾病。几项研究已经报道,分离和纯化蜂毒组件是有效治疗痴呆、关节炎、炎症,细菌感染和癌症。在先前的研究中,我们报告说,蜂毒抑制细胞生长和诱导肺癌细胞凋亡细胞死亡。在目前的研究中,我们评估了蜂毒是否会影响自噬,从而诱发细胞凋亡。蜂毒疗法autophagy-related蛋白质的水平增加(Atg5、Beclin-1 LC3-II)的积累LC3 puncta。我们发现蜂毒可以诱导自噬通过抑制mTOR信号通路。此外,我们发现,羟氯喹(HCQ)——或si-ATG5-induced自噬抑制进一步降级蜜蜂venom-induced细胞凋亡。蜜蜂venom-induced在肺癌细胞自噬促进细胞凋亡,可能成为癌症治疗的新方法。
1。介绍
蜂毒是一种毒药在蜜蜂的毒囊,和许多研究已经进行了蜂疗在东方医学的使用1]。最近,蜂毒已注册作为一个替代医学和作为添加剂用于食品和药品。因此,研究成分,药理作用和毒性蜂毒正在积极进行。蜂毒肽组成的主要部件,如蜂毒素,apamin, adolapin;酶,如磷脂酶A2 (PLA2);类,如多巴胺、组胺、去甲肾上腺素、5 -羟色胺(称为神经递质)1- - - - - -7]。这些组件可能具有抗炎、镇痛、解热、抗痉挛的,细胞毒性和抗癌效果8- - - - - -15]。近年来,一些在体外和在活的有机体内有研究报道蜂毒的抗癌效应在许多肿瘤细胞(8,9,16- - - - - -19]。我们之前发现蜂毒增加细胞凋亡,抑制肺癌细胞的生长(19]。细胞凋亡和自噬与此同时调节细胞命运20.,21]。自噬和凋亡发生在细胞通过各种与压力相关的通路。
自噬是一种蛋白质降解的过程,本质上是发生在细胞对各种细胞维持体内平衡压力(22- - - - - -24]。自噬发生的大多数组织和参与产生和分化组织重塑的细胞器或维持平衡的合成和降解细胞器官和组件(25- - - - - -29日]。自噬的诱导是外部环境的变化如无序蛋白质——或错误折叠proteins-induced压力,营养不足,生长因子减少,ER应激,或病原体感染30.- - - - - -35]。自噬是已知的作为一个中间调解人在癌症、衰老,和炎症反应36- - - - - -47]。
自噬在癌症的作用非常复杂,尚不清楚。自噬在癌症两个相互冲突的功能。它可以抑制癌症保持遗传稳定性通过消除致癌物质的基质或展开的蛋白质的降解和受损细胞细胞器(48,49]。另一方面,它可以促进肿瘤细胞的生长提供了必要的物质增长(46,49,50]。然而,我们的研究表明自噬的机制在肺癌细胞凋亡。事实上,最近的研究关注在人类肺癌细胞自噬(51]。这些研究报道肺癌治疗能够诱导自噬的发展,最终导致肺癌细胞凋亡(52,53]。因此在目前的研究中,我们调查了蜂毒是否会影响肺癌细胞自噬,从而有利于诱导细胞凋亡。
2。方法
2.1。细胞培养和治疗
NCI-H460肺癌细胞A549肺癌细胞,A172胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌mda - mb - 231细胞,从美国获得Hep3B肝癌细胞类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。NCI-H460 A549细胞培养在RPMI 1640中补充10%胎牛血清的边后卫,100μ青霉素g / ml, 100μ克/毫升链霉素。A172、mda - mb - 231和Hep3B细胞在DMEM培养补充10%的边后卫,100μ青霉素g / ml, 100μ克/毫升链霉素。细胞培养在湿大气的5%孵化器有限公司2在37°C。
蜂毒的权力是由涌金生物科技有限公司(安山、韩国)。蜂毒的构成如下:蜂毒肽40 - 50%,2 - 3% apamin, MCD-peptide 401年2 - 3%,-1% - 0.5 adolapin,蛋白酶抑制剂,0.1 - -0.8% 0.5 - -2% secapin, 1 - 2% procamine A和B, 1%透明质酸酶,PLA2 10 - 13%, -2% - 0.5的组胺,多巴胺和0.2 -1%。
2.2。细胞溶解产物制备和免疫印迹
细胞裂解和西方墨点法进行如前所述[54]。细胞细胞溶解与裂解缓冲(NP-40 20毫米Tris-HCl pH值7.8,0.1%,200毫米氯化钠,EDTA 2毫米,5毫米EGTA蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂)和离心机13000×在4°C为20分钟。蛋白质被发现使用ECL衬底(#微孔,WBKLS0500 Billerica, MA)和可视化使用融合独奏年代化学发光检测系统(Vilber Lourmat, Collegien,法国)。主要的抗体如下:anti-LC3 (#2775年,春秋国旅,贝弗利,MA);anti-ATG5 (#12994年,春秋国旅);anti-p62 (#8025年,春秋国旅);anti-Beclin-1 (#3738年,春秋国旅);anti-phospho-mTOR (#2971年,春秋国旅);anti-mTOR (#2972年,春秋国旅);anti-phospho-4E-BP1 (#2855年,春秋国旅);anti-4E-BP1 (#9644年,春秋国旅);anti-phospho-p70 S6激酶(#9205年,春秋国旅);anti-S6激酶(#9202年,春秋国旅);anti-phospho-ULK (#A90736 Abclonal,武汉,中国);anti-ULK (#A8529 Abclonal);anti-cleavedcaspase-3 (#9661年,春秋国旅);anti-caspase-9 (#9502年,春秋国旅);anti-Bcl-2 (#sc - 7382,圣克鲁斯、达拉斯、TX);anti-Bax (#sc - 7480, Santa Cruz);和反β肌动蛋白(sc - 517582, Santa Cruz)。
2.3。免疫细胞化学
如前所述(执行一个免疫细胞化学鉴定55]。一夜之间固定NCI-H460细胞孵化与初级抗体在4°C,和Alexa萤石488 (#A32723,#A32731表达载体,德州卡尔斯巴德,CA)或红色(#t - 862,#t - 2767,英杰公司)共轭二次抗体是在室温下培养1 h。1的细胞培养μg / ml DAPI (#D9542 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)5分钟在室温下和安装Fluoromount-G安装介质(#0100 - 01,南方生物技术、伯明翰、AL)。这些细胞被可视化使用蔡司Axio观察者荧光显微镜系统(从卡尔蔡司,德国)。
2.4。自噬流量分析
如前所述(执行自噬流量分析55]。使用CYTO-ID自噬流量监控®自噬检测设备(法明岱尔恩佐生命科学公司,纽约),根据制造商的协议。与CYTO-ID细胞被染色®绿色检测试剂在黑暗中1 h在37°C。这些细胞被可视化使用蔡司Axio观察者荧光显微镜系统(卡尔蔡司)。分析了数字图像使用禅宗2.1软件(卡尔蔡司)。
2.5。RT-qPCR化验
如前所述执行RT-qPCR试验(54]。总RNA分离使用RiboEx总RNA (#301 - 001年GeneAll生物技术有限公司、韩国首尔)和反向转录成cDNA使用高容量cDNA逆转录工具包(#4368813,应用生物系统公司,促进城市,CA),根据制造商的协议。实时PCR进行使用SYBR绿色PCR反应混合液(#4344463,应用生物系统公司)和分析使用ABI棱镜7700序列检测系统(应用生物系统公司)。所有的引物用于RT-qPCR设计使用Primer3在网站上和从Bioneer购买公司(大田、韩国)。
2.6。细胞生存能力分析
如前所述(执行细胞生存能力分析55]。细胞被镀上96 -孔板和处理0,0.1,0.5,1μg / ml蜂毒24 h。24小时后,细胞生存能力评估使用3 - (4 5-dimethyl-2-thiazolyl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)试验(#西格玛奥德里奇M5655),根据制造商的协议。总之,5μ肝癌和g / ml的解决方案是添加和孵化37°C 4 h, 100μl DMSO溶液添加到每个好。每个样品的吸光度是使用一个微型板块读者阅读的波长540纳米。
2.7。流式细胞术(流式细胞仪)
使用胰蛋白酶化细胞被洗PBS和收获。这些细胞被沾propidium碘(π)和膜联蛋白V 5分钟在黑暗的房间里的温度。样品使用双相障碍进行流式细胞仪石中剑TMFlowCytometer (BD生物科学,圣地亚哥,CA),通过CellQuest Pro v6.0和数据分析软件(BD生物科学)。
2.8。统计分析
统计分析软件使用GraphPad棱镜5。所有误差的标准差(SDs)报道,除非另有指示。使用学生两两进行比较t以及。使用单向方差分析进行多重比较图基的测试。组之间的差异被认为是重要的值< 0.05。
3所示。结果
3.1。蜂毒诱发自噬在人类癌症细胞
有很多对细胞凋亡和自噬之间的关系进行了报道。细胞凋亡和自噬诱导细胞死亡以合作的方式(20.,21,56]。我们之前发现蜂毒抑制细胞生长和诱导凋亡细胞死亡在人类肺癌细胞(19]。在目前的研究中,我们评估了蜂毒是否会影响在肺癌细胞自噬。检查蜂毒对A549和NCI-H460细胞的生存能力,我们使用MTT测定分析了细胞毒性的活动。我们发现,蜜蜂毒液抑制肺癌细胞的生长浓度的方式。的集成电路50值24 h后蜂毒治疗分别为2.9和3.18μg / ml NCI-H460和A549细胞,分别为(补充图S1)。蜂毒抑制这两种肺癌细胞的生长;然而,它更有效地抑制NCI-H460肺癌细胞的生长。因此,我们选择NCI-H460细胞进行进一步的分析。检查是否蜂毒影响自我吞噬,我们评估LC3的水平。分裂后的c端地区LC3 ATG4, LC3-I生成。LC3-I转化成LC3-II磷脂酰乙醇胺(PE) (57]。LC3-II被广泛用作自噬标志,因为它是附着在自噬体膜。免疫印迹分析表明LC3-II水平增加浓度的方式后蜂毒治疗(图1(一))。此外,蜂毒疗法LC3-II水平增加时间的方式(图1 (b))。确认是否自噬小体标记LC3 puncta可以通过治疗蜂毒,积聚在细胞发出荧光显微镜分析。蜂毒疗法导致重大LC3 puncta积累浓度的方式(图1 (c))。此外,蜂毒疗法增加LC3 puncta积累时间的方式(图1 (d))。确定是否可以诱导自噬蜂毒在其他癌症细胞系,我们证实蜂毒对A172胶质母细胞瘤的疗效,乳腺癌mda - mb - 231, Hep3B肝癌细胞系。蜂毒疗法增加LC3-II乐队和LC3 puncta在各种癌症细胞系(补充数据S2a和开通)。我们也评估其他autophagy-regulating蛋白质在细胞的水平治疗蜂毒。在蜜蜂venom-treated细胞,p62水平下降,而ATG5的水平和Beclin-1增加浓度和时间的举止(数字1 (e)和1 (f))。同样,ATG5的信使rna表达水平,Beclin-1, LC3-II增加蜜蜂venom-treated细胞(补充图S3)。这些结果表明蜂毒诱发自噬在肿瘤细胞,特别是肺癌细胞。
(一)
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(e)
(f)
3.2。蜂毒提高自噬流量
自噬诱导或自噬流量封锁可以增加LC3-II和自噬小体的形成。评估是否蜂毒影响自噬流量,细胞治疗蜂毒有或没有自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)。已知HCQ LC3-II水平的增加抑制自噬体与溶酶体的融合块自噬小体的退化。因此,增加LC3-II水平HCQ面前显示出增强的自噬流量。LC3-II增加水平治疗后和蜂毒HCQ孤单。治疗蜂毒的HCQ进一步增加LC3-II水平(图2(一个))。此外,LC3 puncta增加甚至在HCQ的存在(图2 (b))。自噬水平的变化引起的蜂毒评估使用CYTO-ID自噬检测装备,另一个自噬流量测量方法。CYTO-ID自噬检测设备有选择地污渍自噬空泡。没有指出在控制细胞染色。然而,蜜蜂venom-treated染色观察细胞(图2 (c))。这些结果表明,蜂毒能增强自我吞噬。
(一)
(b)
(c)
3.3。蜂毒诱发自噬通过抑制mTOR通路
为了揭开蜂毒诱导自噬的机制,我们证实mTOR的参与,一个著名的抑制自噬。磷酸化mTOR的表达减少蜜蜂venom-treated细胞。mTOR的下游因素p70 S6激酶1 (S6K1)和eif4e结合蛋白1 (4 e - bp1)。mTOR磷酸化S6K1,激活S6K1促进翻译起始的激活S6核糖体蛋白(58]。mTOR磷酸化4 e - bp1它,使其失去活性,从而促进翻译(59]。我们观察到蜂毒治疗减少S6K1磷酸化和剂量依赖性的方式(图4 e - bp1磷酸化3(一个))。UNC-51-like自噬激活激酶1 (Ulk1)是一个关键的监管机构的成核所需autophagophore和自噬体膜的形成。激活mTORC1抑制自噬通过直接的磷酸化ULK1 S757 [60,61年]。这种磷酸化抑制ULK1激酶活性和随后的自噬小体的形成。如图3 (b)的ULK1 mTORC1磷酸化S757蜂毒疗法后抑制。雷帕霉素,mTOR抑制剂,用于验证在蜜蜂venom-induced mTOR自噬的作用。雷帕霉素显著增加LC3-II水平;然而,与雷帕霉素预处理后,蜂毒不会增加LC3-II水平(图3 (c))。这些结果表明蜂毒诱发自噬通过mTOR通路。
(一)
(b)
(c)
3.4。蜂毒介导Autophagy-Induced细胞凋亡
Compound-induced自噬可能在癌症治疗pro-survival或赞成。我们之前发现蜜蜂毒液治疗浓度的方式可以增加凋亡细胞死亡(19]。评估蜜蜂蜜蜂venom-induced venom-induced自噬在细胞凋亡的作用,我们使用了HCQ autophagy-specific抑制剂。MTT试验结果显示,与蜂毒疗法相比,细胞生存能力显著增加蜂毒治疗后的HCQ(图4(一))。此外,免疫印迹分析显示,HCQ治疗显著降低蜜蜂venom-induced水平caspase-3裂解,裂解caspase-9,和伯灵顿,但增加bcl - 2(图的水平4 (b))。此外,相比之下,仅蜂毒疗法,治疗蜂毒的HCQ显著减少凋亡细胞的比例(图4 (c))。我们还观察到使用流式细胞仪分析细胞周期。结果,这是证实subG1细胞的数量增加了蜜蜂venom-treated细胞。然而,蜂毒和HCQ-cotreated细胞表现出相似的细胞群控制细胞(图4 (d))。凋亡细胞被膜联蛋白V染色,再次确认和膜联蛋白的数量V-positive细胞增加了蜂毒疗法(图4 (e))。与蜂毒疗法相比,蜂毒和HCQ-cotreated细胞减少的百分比膜联蛋白V-positive细胞。
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(b)
(c)
(d)
(e)
ATG5是一个关键的自噬监管机构和不可或缺的一部分ATG5-ATG12-ATG16L1复杂,催化ATG8 lipidation,这对自噬小体的形成和扩展是至关重要的。ATG5也是不可或缺的自噬体与溶酶体融合的典型自噬和不在经典里的自噬62年,63年]。我们进一步研究了蜜蜂venom-mediated自噬是否会影响细胞凋亡,使转染ATG5核(图5(一个))。蜂毒治疗与控制核apoptosis-related蛋白质的水平增加caspase-3裂解,裂解caspase-9,和伯灵顿但bcl - 2的水平有所下降。然而,损耗ATG5蜂毒治疗减少apoptosis-related蛋白质(图的水平5 (b))。此外,ATG5减少损耗的蜜蜂venom-induced细胞凋亡(图5 (c))。这些结果证实再次通过流式细胞仪分析。蜂毒subG1的数量显著增加,膜联蛋白V-positive细胞。损耗的ATG5蜂毒治疗减少了subG1和膜联蛋白V-positive细胞(数字5 (d)和5 (e))。这些数据表明,自噬对于蜜蜂venom-induced凋亡是必要的。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
在目前的研究中,我们发现,蜂毒诱发肺癌细胞自噬。我们的研究结果提供的证据表明蜂毒诱发自噬。我们还证明了mTOR通路与蜜蜂venom-induced自噬相关。此外,我们的研究结果表明,蜜蜂蜜蜂venom-induced venom-induced自噬可能是重要的在肺癌细胞凋亡细胞死亡。
蜂毒作为一种有效的治疗选择与各种肌肉骨骼疼痛、炎症性疾病,neuroparalytic疾病和免疫相关疾病(4,10,12,13,15]。许多研究也报道,蜂毒growth-inhibitory影响各种癌症细胞,如结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌的细胞(8- - - - - -10,64年,65年]。此外,一些研究已经进行疼痛控制和预防蜂毒对恶性骨质疏松和周围神经病变的影响,以及癌症和化疗相关的棘手的症状(1]。几项研究表明,在压力条件下,细胞第一次尝试修复受损细胞自噬和生存;然而,在失败的事件,autophagy-mediated程序性细胞死亡,细胞凋亡和坏死/ necroptosis进步受损细胞变成癌细胞(20.,21,50,56]。因此,自噬已成为一个强大的中介的程序性细胞死亡20.,21,56]。在我们之前的研究中,我们表明,蜂毒凋亡在肺癌细胞凋亡通路(19]。尽管一些研究已经表明蜂毒行为与癌症诱导细胞凋亡,蜜蜂venom-induced细胞凋亡的机制尚不清楚。
在目前的研究中,蜜蜂venom-induced自噬被证明autophagosomal标记LC3的转换和LC3斑点状结构的形成。我们还发现,蜜蜂venom-induced自噬发生在人类胶质母细胞瘤(A172),结肠癌(SW480)、乳腺癌(mda - mb - 231)和肝癌细胞系(Hep3B)。我们检查是否水平的增加LC3-II蜂毒治疗后诱发autophagosome-lysosome融合蛋白在细胞细胞器退化。LC3-II和LC3 puncta增加蜜蜂venom-treated细胞HCQ autophagosome-lysosome融合抑制剂的存在。总的来说,这些结果表明,蜂毒能导致肺癌细胞自噬流量。
我们进一步表明蜂毒诱发自噬通过mTOR信号通路。mTOR调节细胞命运通过蛋白质合成和细胞周期控制在回答几个信号,诸如能源状况、营养状况、胰岛素水平,生长因子(58]。最重要的蛋白质自噬是mTOR, mTOR通路被报道参与自噬在各种癌症。mTOR的知名基质4 e - bp1 S6K1,调节蛋白质合成的过程(58]。一些基因参与肿瘤细胞的渗透调节通过4 e - bp1翻译抑制mTOR的因素。mTOR,如西罗莫司、everolimus temsirolimus,批准或处于临床阶段的癌症治疗,可以抑制mTOR信号通路,抑制癌细胞的发展为侵袭性癌症(66年]。我们发现4 e - bp1的磷酸化和S6K1在蜜蜂venom-treated细胞减少。它也是众所周知,ULK1自噬起始的主要监管机构,由mTOR监管。在目前的研究中,我们发现的磷酸化ULK1在蜜蜂venom-treated细胞减少。这些数据表明,蜜蜂venom-induced自噬是依赖于mTOR信号通路。
自噬作用在癌症细胞生存和死亡在癌症治疗20.,56]。因此,我们证实了蜜蜂venom-induced自噬是否会影响细胞凋亡。我们发现HCQ,自噬抑制剂,可能减弱蜂毒对NCI-H460细胞的细胞毒性效应。此外,我们发现HCQ治疗可以显著降低蜜蜂venom-induced NCI-H460细胞凋亡。阻断自噬体形成的损耗Atg5使用核,蜜蜂venom-induced细胞毒性和细胞凋亡是减毒的;这些发现的类似HCQ联合治疗。自噬的阻塞和蜂毒疗法可以减少细胞凋亡。许多研究显示小分子酪氨酸激酶抑制剂等mTOR或HDAC抑制剂触发autophagy-induced细胞凋亡在活的有机体内和在体外肺癌细胞(52,53]。这些发现表明蜂毒可能在各种肿瘤细胞诱导自噬,自噬的诱导可能在蜜蜂venom-induced细胞凋亡发挥重要作用。
5。结论
总之,我们表明蜂毒可以诱导自噬在许多类型的癌细胞。我们的数据表明,mTOR信号通路的关键调节器是蜜蜂venom-induced自噬。此外,我们发现HCQ——或者si-ATG5-induced自噬抑制进一步降级蜜蜂venom-induced细胞凋亡。这些数据表明,蜜蜂venom-mediated对蜜蜂venom-induced凋亡,自噬可能是重要和mTOR通路可能发挥作用的潜在机制。
数据可用性
期间产生的所有数据或分析本研究包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
霁Eun Yu和尤里金同样这项工作。
确认
这项工作是财务支持的韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府资助(MSIP)(没有;MRC2017R1A5A2015541)。
补充材料
补充图S1。蜂毒影响A549和NCI-H460细胞的可行性。补充图S2。蜂毒诱发自噬在各种癌症细胞系。补充图S3。在蜜蜂venom-treated autophagy-related mRNA的表达水平增加细胞。(补充材料)