文摘
胚胎癌细胞(二者)可能会导致不同类型的癌症,一种技能,使他们比其他癌细胞更加危险。使用天然产品识别二者是一个很好的选择,因为它能够抑制癌症的复发与温和的各种影响。乌索酸(UA)是一个五环三萜从水果中提取和草药,已知抗癌功能对各种癌症细胞。然而,其潜在的对二者仍不确定。本研究计划检查UA的诱导细胞凋亡。细胞信号传导的研究,我们进行了实验,实时qPCR和免疫印迹。此外,使用流式细胞仪分析了各种细胞过程。结果提高了细胞增殖障碍的UA NTERA-2和NCCIT细胞。形态学研究也证实了UA导致胚胎二者的细胞死亡的能力。检查细胞死亡进口表明UA伊诺的表达,从而形成细胞生成和线粒体活性氧生成,它创建了一个对细胞DNA损伤反应通过提高phospho-histone ATR和ATM的蛋白质含量。 In addition, the UA created the binding of the G0/G1 cell cycle to NTERA-2 and NCCIT cells, improved the expression levels of p21 and p27, and reduced the expression levels of CDK4, cyclin D1, and cyclin E, confirming the UA’s ability to initiate cell cycle arrest. Finally, the UA created an internal mechanism of apoptosis in the embryonic CSC using BAX and cytochrome c regulation as well as the regulation of BCL-xL and BCL-2 proteins. Therefore, UA could be the best candidate for targeting CSCs and thus suppressing the emergence of cancer.
1。介绍
干细胞分化成各种类型的组织。胚胎干细胞可以分化存在于人体所有类型的组织。然而,胚胎癌干细胞(二者)这些属性以及无限制的增殖,使他们比其他类型的癌细胞(更危险1,2]。胚胎二者有可能分化成不同的癌症,如肺癌、结肠癌和乳腺癌3]。因此,测试抗癌药物不仅依赖于他们的识别癌细胞的能力,也导致二者的细胞死亡的能力。
癌症患者也受到化疗药物的副作用4,5]。癌症治疗使用天然成分是一个更好的选择,因为它的能力目标靶向治疗化疗药物相比,副作用更少(6,7]。二者导致癌症复发,促进肿瘤发生。外部刺激或基因表达的改变可能导致CSC激活血管生成,细胞增殖,抑制细胞凋亡,最终导致肿瘤,从而转移(8]。癌症治疗使用传统药物减少肿瘤的大小,但二者并不是对传统医学。有针对性的治疗二者可以阻止肿瘤的生长,消除癌症复发的风险9]。乌索酸(UA)是一个五环三萜隔绝草药、水果和药用生物功能(10]。它有各种抗癌特性如诱导细胞凋亡、抑制血管生成、炎症反应、抗氧化、肿瘤转移。相比之下,分子细胞信号主要是与使用促炎细胞因子如il - 1抗炎作用β、IL-17 IL-7, TNF -α或cyclooxygenase-2和一氧化氮合酶通过核因子-κB,参与炎症反应的重要组成部分[11]。研究UA说明激活细胞周期阻滞和抑制细胞生长,诱导细胞凋亡的内在和外在的通路在体外和在活的有机体内在胃癌(12和乳腺癌13)细胞。在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞,UA可以抑制自噬和抑制TGF -β1-guided EMT由整合素的调节αVβ5 / MMP的信号,这被认为是其抗癌活性的原因在非小细胞肺癌细胞14- - - - - -16]。UA也已被证明能够导致细胞死亡和减少肿瘤的生长通过调节autophagy-related自噬5-dependent自噬在宫颈癌细胞(17]。然而,UA的角色在胚胎二者仍不明朗,它将会是很有趣的,以确定UA可以二者目标。
活性氧(ROS)发挥重要作用在肿瘤发生导致DNA损伤导致DNA损伤反应(DDR)机制。通常,长期的压力会导致活性氧生成,导致双链DNA碎片,基因组不稳定性,杂合性丢失。为了应对这种情况,DDR激活DNA-altering方法对异常DNA (18,19]。这DDR感应启动依赖dna的激活的蛋白激酶(DNA-PKcs) Rad3-related (ATR),和ataxia-telangiectasia突变(ATM) (20.,21]。ATM信令激活肿瘤蛋白的表达53 (p53)为了应对DNA损伤导致细胞周期阻滞,DDR,和细胞凋亡机制22]。抗癌药物产生ROS生成可引起DNA损伤导致增加DDR激活由于增加ATM / ATR信号通路的信号。
肿瘤发生的主要检查站是不受控制的细胞周期进展,无法诱导细胞凋亡,抑制肿瘤抑制基因。破坏细胞分裂或细胞周期阶段会导致不受控制的细胞分裂,导致肿瘤发生。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)被认为是重要的细胞周期的监管机构,虽然CDK抑制剂可以调节细胞周期连续性,防止正常细胞癌症。在DNA损伤,CDK抑制剂,p21 (p21WAF1 / Cip1),作为一个肿瘤抑制的反应和刺激细胞周期23]。它也被称为肿瘤抑制通路的主效应由于p53-independent抑制细胞增殖的能力24]。p21和p27蛋白(KIP1)有能力抑制CDK蛋白质和细胞周期蛋白的蛋白质如细胞周期蛋白D1;因此,其抗癌的活性取决于开发p21和p27的表达和细胞周期蛋白的抑制和CDK蛋白(25]。长时间的细胞周期阻滞导致细胞死亡,细胞凋亡。当正常细胞对刺激做出反应不能刺激DNA修复和细胞凋亡等突变,肿瘤发生发生。损失的能力,诱导细胞凋亡是肿瘤发生的一个重要因素,和这种技术可用于抗癌治疗(26,27]。
这项研究证明了诱导细胞凋亡的UA NTERA-2 NCCIT胚胎二者,和分子机制UA胚胎癌干细胞的诱导细胞凋亡也进行了分析。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
胚胎细胞癌(NTERA-2和NCCIT细胞)在韩国买细胞株银行(首尔,韩国)。DMEM NTERA-2细胞被维护,NCCIT与rpmi - 1640细胞培养媒体包含10%的边后卫和1%青霉素37°C公司5%2。融合在成长80%,细胞参与或治疗UA然后进一步培养24小时。
2.2。试剂和抗体
胎牛血清(12483 - 020),rpmi - 1640中(11875 - 093),0.05% trypsin-EDTA(25300 - 054),和penicillin-streptomycin(15140122)从Gibco购买(热费希尔)。DMEM培养基(LM001-51)从Welgene购买公司的主要抗体特定β肌动蛋白(sc - 47778), p21 (sc - 756), bcl - 2 (sc - 7382),细胞周期素E (sc - 481),并到(sc - 260)和二级抗体anti-rabbit抗体(sc - 2357)和anti-mouse抗体(sc - 516102)从圣克鲁斯生物技术获得,Inc ., p27的主要抗体特定Kip1(# 3686),细胞色素c (# 11940), pATR(# 2853),伯灵顿(# 2772),pCHK2 (# 2197), BCL-xL (# 2764), pATM (# 5883), pBRCA1(# 9009),和pCHK1(# 2348)从细胞信号技术,获得Inc .细胞周期蛋白D1 (ab6152)抗体从Abcam购买。伊诺抗体(nb300 - 650)是获得罗福斯生物制剂。乌索酸(U6753)在Sigma-Aldrich买了。
2.3。免疫印迹分析
所有获得的蛋白质样本里帕在冰上裂解缓冲了20分钟。蛋白质分离(100μg /)解决SDS-polyacrylamide凝胶,然后确定目标蛋白质免疫印迹分析。
2.4。细胞生存能力分析
MTT(热费希尔;M6494)用于细胞的可行性。细胞的3×103每口井在96孔培养板24 h。接下来,这些细胞被孵化与车辆控制或不同浓度的DMSO UA (1-50μ米)24 h。第二天,5毫克/毫升的MTT试剂处理和孵化4 h 37°C。甲瓒产品被溶解在DMSO溶液清洗后用1 x PBS。在波长590纳米,甲瓒产物的吸光度测定的超多功能微型板块读者(Tecan、杜伦、数控、美国)。所有的测量和实验进行了一式三份。
2.5。定量实时聚合酶链反应(qPCR)
总RNA孤立使用试剂盒的方法。随后,热周期计被用来准备cDNA从使用第一链cDNA总RNA合成装备(Bioneer)存在。qPCR使用LightCycler执行480年二世(罗氏)。所有反应进行三次和规范化GAPDH基因,并使用了Cp值量化进行了分析。
2.6。流仪结果
与prewarmed培养培养基培养细胞后,1×106细胞被resuspended 1毫升染色缓冲区包含CM-H2DCFDA (5μM;表达载体;C6827)细胞ROS, MitoTracker深红色(40 nM;表达载体;M22426)线粒体膜电位或MitoSOX (5μM;表达载体;M36008)线粒体ROS。这些细胞被然后孵化有限公司230分钟的孵化器在37°C。最后,实验仪进行使用FACScalibur™(BD生物科学),然后使用FlowJo软件分析。
2.7。碱性和中性彗星试验
彗星试验设备(3张幻灯片;Abcam;ab238544)用于检测细胞DNA损伤。执行的分析是根据制造商的指示,并使用荧光显微镜观察细胞形态(奥林巴斯IX71 / DP72)。
2.8。细胞周期分析
UA-untreated和UA-treated细胞的DNA含量测定采用BD Cycletest + DNA试剂盒(BD生物科学;340242)。1×10的细胞6每个样本用于DNA分析的内容。然后,细胞样本分析使用FACScalibur™(BD生物科学),然后使用FlowJo软件分析。
2.9。细胞凋亡检测
UA-untreated或UA-treated细胞被洗1 x PBS和resuspended绑定缓冲1×10的浓度6细胞。细胞凋亡检测设备(Biolegend;640914)是购买,细胞凋亡检测试验是根据制造商的协议执行。的执行分析FACScalibur™(BD生物科学)和凋亡细胞使用FlowJo软件进行了分析。
2.10。隔离的线粒体/胞质分数
线粒体和胞质分数进行的隔离使用线粒体/胞质分离设备(Abcam;ab65320)。隔离执行根据制造商的协议。免疫印迹分析的细胞色素c是如上所述。
2.11。统计分析
结果表示为平均值±标准错误的意思。统计分析进行了使用单向方差分析(方差分析)或学生的t以及。单向方差分析也使用图基的事后测试执行。使用SAS 9.3的分析软件。
3所示。结果
3.1。UA抑制胚胎二者的传播
首先,我们分析的能力,抑制胚胎CSC的UA扩散函数使用MTT试验。我们发现了一个浓度抑制细胞的生存能力UA治疗在二者(图1(一))。我们用20μM UA作为集成电路50剂量,浓度为10和20μM UA;还包括用于研究。这些结果提升了UA目标二者的能力。然后我们评估胚胎的状态二者UA治疗后用DAPI染色法和观察到的细胞数量减少UA治疗(图1 (b))。亮场显微分析也证实NTERA-2和NCCIT细胞生长的抑制UA治疗。这些结果也推动了UA防止CSC的扩散的能力。
(一)
(b)
3.2。UA诱导线粒体和细胞ROS的生成
我们确定了UA封锁潜力CSC NTERA-2和NCCIT细胞增殖。我们假设的抗肿瘤活性UA始于ROS的产生。套用这个神话,我们首先检查UA治疗后伊诺的模式表达式。我们的研究结果表明,增加UA浓度调节进气阀打开蛋白质的表达水平在NTERA-2和NCCIT细胞(图2(一个))。来证实这些发现,我们分析了伊诺mRNA的表达在胚胎CSC UA治疗后,发现同样的效果,观察到蛋白质水平(图2 (b))。伊诺的推出表明潜在的活性氧产量UA的胚胎二者。正如预期的那样,我们发现UA已经成功地诱导细胞内活性氧的产生(图2 (c))和线粒体活性氧(图2 (d)),这表明活性氧生成抗肿瘤活性UA的原因。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。UA诱发DDR胚胎二者
先前的结果显示ROS生产通过胚胎CSC的UA治疗,这可能是一个因素在UA的抗癌活性。因此,我们假设UA有潜力产生DDR NCCIT和NTERA-2细胞。我们检查了UA的能力招募DDR用彗星试验确定复制DNA碎片,和获得的结果表明,UA DNA复制DNA NCCIT和NTRA-2细胞(图3(a))。我们也观察到显著增加的长度彗星和comet-positive UA-controlled细胞细胞比未经处理的控制细胞(图3(b))。这些结果证明了CSC UA-mediated DDR导入到胚胎的能力。为了证实这一点,我们检查了DDR-binding蛋白质暴露水平,发现增加磷酸化自动取款机,ATR, CHK1相关,BRCA1当治疗UA关注NTERA-2浓度增加和NCCIT细胞(图3(c))。这些结果表明,ATM或ATR作为主要控制器的DDR UA。
3.4。UA诱发G0 / G1细胞周期阻滞
根据以前的结果,我们已经表明,UA有潜力产生活性氧和诱导DDR胚胎二者。因此,我们分析了它在启动细胞周期阻滞中的作用。首先,在胚胎细胞周期分析二者或没有治疗UA使用流式细胞仪显示绑定在G0 / G1期的UA细胞周期NTERA-2和NCCIT细胞(图4(一))。慢子群的形成subG1 NTERA-2治疗UA的细胞也观察到,可能是由于细胞凋亡的早期引入UA。这一结果表明,引入DDR导致长时间的细胞周期阻滞,为了证实这一点,我们分析了细胞蛋白质西方终止测试水平。获得的结果显示高浓度的此种蛋白质,p21, p27和减少暴露在细胞周期蛋白D1的水平,细胞周期蛋白E,到蛋白质(图4 (b))。然后我们验证这些结果通过分析基因表达模式负责细胞周期在mRNA水平。结果证实了细胞周期的介绍绑定通过分析到的表达模式,CDKN1B, CCNE1 CDKN1A, CCND1 mRNA(图4 (c))。这些结果显示关闭细胞周期的UA胚胎CSC,表示可能引入UA的细胞凋亡。
(一)
(b)
(c)
3.5。UA诱发胚胎二者的内在细胞凋亡
我们决定,UA有潜力表现出一代的ROS, DDR,胚胎CSC和细胞周期阻滞,表明潜在的细胞凋亡的诱导治疗UA NTERA-2和NCCIT细胞。因此,我们研究了细胞凋亡的诱导治疗UA的胚胎CSC使用流式细胞术,和结果表明,UA诱导细胞凋亡细胞(图5(一个))。在此基础上引入细胞凋亡,我们接下来研究细胞凋亡的方法通过检测细胞凋亡的主要控制BCL2-associatedX(伯灵顿),b细胞淋巴瘤2 (bcl - 2), b细胞lymphoma-extra-large (BCL-xL)和细胞色素蛋白c(图5 (b))。我们的结果显示bcl - 2表达水平的降低和BCL-xL蛋白质和伯灵顿暴露水平的提升和细胞色素c在UA治疗,表明可能引入的内在途径UA胚胎二者的细胞凋亡的机制。因为内在细胞凋亡是高度依赖伯灵顿/ bcl - 2比,我们证实了伯灵顿和bcl - 2表达模式在胚胎CSC UA治疗后。我们发现UA可以导致胚胎二者内在的细胞凋亡。确认从线粒体细胞色素c的释放细胞溶质在UA治疗中,我们分析了cytosol-derived蛋白质和获得的线粒体和细胞色素c蛋白免疫印迹(图5 (c))。获得的结果显示,减少生产的线粒体细胞色素c在UA治疗,而相反的观察模式,让细胞色素c在NTERA-2和NCCIT细胞胞质蛋白,清楚地表明驱逐在细胞线粒体细胞色素c进行细胞凋亡的内在途径。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
所选药物的抗癌活性是高度依赖于它是如何工作的针对肿瘤细胞及其识别二者的能力,从而防止癌症的复发。复发的癌症是一个主要的并发症在不同化疗药物,因为尽管它有效地抑制肿瘤的生长,它可能无法目标二者(28]。这个问题使得研究天然抗癌化合物一个有吸引力的方法,因为这些化合物可用于长期接触,因为他们减少副作用,可以帮助目标肿瘤细胞,二者29日,30.]。有一些天然的化合物有可能对二者的工作(3]。UA验证执行抗肿瘤活性对不同类型的肿瘤细胞,从而证明它对胚胎的影响研究二者可能阐明其关注二者的能力。我们的研究结果表明,UA已成功抑制NTERA-2 NCCIT细胞增殖,这表明UA可以目标肿瘤细胞,二者。形态分析还显示潜在的预防UA对胚胎二者扩散。
一种天然化合物,它可以引发DDR从而结合细胞周期和细胞凋亡在肿瘤细胞可以被视为一个潜在的候选人进行进一步的研究。先前的研究已经表明,UA可以诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡在多种癌症类型(31日- - - - - -33]。ROS生成巨大的扮演着一个重要的角色在抗癌活性的天然化合物(34]。我们发现治疗UA高架伊诺的表达在转录和翻译水平,伊诺感应导致活性氧生成(7]。因此,治疗UA显著增加细胞活性氧和线粒体ROS生成,这可能表明UA抗癌活性。然后,我们证明了UA的能力与双链DNA的DNA序列,合成DDR和结果表明,UA可以生产的双链DNA链胚胎二者。ATM或ATR激酶被认为是中央控制DNA损伤反应,可以检测细胞DNA损伤的发生(20.]。我们的结果也显示这些DDR激酶的表达水平增加,进而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。这导致等底物磷酸化BRCA1, CHK1和相关的35,36]。我们指出,UA治疗已经成功地影响了细胞和线粒体活性氧的生产,在胚胎二者激活DDR,这显然表明治疗UA的细胞死亡的可能性。
感应的DDR可能导致长时间最后细胞周期阻滞和细胞凋亡。提高ATM或ATR信号导致增加在抑制肿瘤p21和p27基因,导致细胞周期阻滞的感应。在流式细胞仪分析,UA治疗提高了p21和p27表达水平降低到的表达水平,细胞周期蛋白D1,和细胞周期素E,表明可能的细胞周期阻滞。同时,胚胎二者建议G0 / G1细胞周期阻滞NTERA-2和NCCIT细胞。表达式的监管模式的细胞周期检查点NTERA-2 UA和NCCIT细胞也支持细胞周期阻滞的感应。这些结果表明细胞凋亡可能引入的胚胎CSC UA治疗。凋亡通路分为内在和外在途径,线粒体发挥关键作用的内部通路通过伯灵顿的差别监管和对这些基因bcl - 2增强线粒体细胞色素c的释放到胞质蛋白激活激活半胱天冬酶蛋白,然后继续向细胞凋亡(27,37]。bcl - 2家族蛋白质凋亡作为孔隙拮抗剂在线粒体凋亡和有能力判断细胞凋亡的结果(38]。一个proapoptotic伯灵顿有助于毛孔在细胞线粒体膜的形成。也负调节bcl - 2的表达,以确定细胞凋亡可以进步37]。我们的流式细胞术结果显示细胞凋亡诱导NTERA-2和NCCI细胞。根据这个指示,我们分析了途径的凋亡诱导UA,和我们的结果与我们的预期一致,当我们观察到巴克斯表达水平的增加和减少bcl - 2和BCL-xL UA胚胎二者的治疗后,这表明UA细胞凋亡的线粒体。我们观察到的增加胞液中细胞色素c的表达。我们还研究了降低控制线粒体细胞色素c含量在胚胎CSC UA治疗后,指示可能释放细胞色素c从线粒体释放细胞溶质通过毛孔由伯灵顿/ bcl - 2规定。内在的细胞色素c指导细胞线粒体凋亡通路。因此,UA有可能诱导线粒体凋亡NTERA-2 NCCIT细胞,为了目标二者。
5。结论
总之,本研究表明,五环三萜的天然化合物,UA,目标胚胎二者通过抑制NTERA-2和NCCIT细胞的扩散。此外,UA明显诱导细胞和线粒体ROS生成和DDR反对胚胎二者。我们还证明了G0 / G1期的感应UA逮捕,然后导致线粒体通过调节内在细胞凋亡的表达水平伯灵顿和bcl - 2以及细胞色素c的水平。总的来说,UA可以被视为一个潜在的候选人辅助化疗,因为它可以通过针对二者抑制癌症的复发。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
DYK, NS, K-JJ贡献了同样的工作。本研究YMY和K-JJ构思。DYK, NS, K-JJ执行所有的实验,和NS K-JJ写的手稿。ESJ和主客观提供反馈和担任科学顾问。所有作者检查和批准了最终版本的手稿。
确认
这项工作于2020年建国大学的支持。