文摘
Kruppel-like因素(KLFs)是一些调节的转录监管机构广泛的细胞功能,并与某些恶性肿瘤的发展。KLF表达模式和预后价值在结直肠癌(CRC),然而,很少受到调查。探讨微分表达式,预测价值和基因突变的KLFs CRC患者中,我们使用不同的在线分析工具,包括ONCOMINE TCGA, cBioPortal,计时器数据库。KLF2-6、KLF8-10 KLF12-15, KLF17 mRNA表达水平在CRC组织大幅下调,但KLF1 KLF7, KLF16 mRNA表达水平明显升高CRC组织。根据Cox回归分析的结果,upregulation KLF3, KLF5, KLF6 KLF15的差别,对这些基因与CRC更好的预后。功能丰富,我们的研究结果显示,KLF成员参与各种各样的癌症相关的生物过程。在结肠癌和直肠癌,KLFs也显示与多种免疫细胞。这项研究的结果显示,KLF家庭成员的信使rna表达水平可能的CRC患者预后指标。
1。介绍
结直肠癌(CRC)是世界上第三大常见的癌症,第二个癌症相关死亡的主要原因。全球大约有190万新发病例的CRC,和超过910000病人死于CRC(2020年1]。尽管在早期发现和治疗方案重大努力,CRC患者的预后仍然贫穷。大约50%的CRC患者出现转移或复发,这阻碍了CRC治疗的治疗效果2]。结果,关键是要找到有用的生物标记物,可以预测CRC患者的临床结果和CRC疗法作为治疗靶点。
Kruppel-like因素(KLFs)是一个转录因子家族,包括17个成员国特性锌指域。三个cys2 / his2锌指DNA结合域,通过绑定GC-rich调节基因的转录DNA序列和5-CACCC-3元素区分这些进化保存KLF成员。KLFs正常运转所需的各种生物细胞过程,包括增殖、分化、凋亡、迁移(3]。在过去的几年里,大量的证据表明,几个KLF家庭成员的表达在许多人类恶性肿瘤特异表达,在那里他们可以作为肿瘤抑制和/或致癌基因在癌症特异性的细胞环境中(4]。最近,越来越多的研究也认为KLFs小说在人类癌症预后标记。例如,KLF4被证明是一个肿瘤抑制肺癌,胡锦涛等人报道,KLF4的表达是减少在大多数肺癌组织和upregulation KLF4导致显著抑制细胞生长和集落形成5]。相比之下,致癌活性KLF4被发现在乳腺癌,高KLF4表达式被认为在乳腺导管癌与正常组织(6];此外,过度KLF4导致早期乳腺癌预后不良。过度的KLF6前列腺癌抑制增殖和诱导细胞凋亡,表明KLF6作为前列腺肿瘤抑制功能(7,8]。KLF7超表达与胃和肺癌预后差,据研究[9,10]。此外,刘等人报道,KLF17抑制肝细胞癌(HCC)细胞的能动性和入侵可能通过抵消EMT和减少KLF17与不良预后有关的表达在肝细胞癌(11]。KLF8已经被证明可以促进CRC入侵和转移通过转录激活FHL2监管(12]。一类可以通过转录调节LDHB监管,从而影响糖酵解(13]。
之前的研究表明个人KLFs CRC的表达模式及其链接CRC患者。不过,KLF家族的整体CRC尚未充分地分析,这是急需的。目前工作的表达状态和预后价值分析整个KLF家庭CRC使用更新的公共数据库,允许一个更好的了解这个巨大的家庭和新型治疗药物的发展。
2。材料和方法
2.1。分析ONCOMINE数据库
ONCOMINE数据库(https://www.oncomine.org),一个开放的公共数据库,使复杂的全基因组表达分析,用于确定KLF家族基因的表达水平。以下水平的意义被用于这项研究: ,| logFC |≥1,表达基因排名在前10%。的值的差异KLF基因表达在CRC计算使用学生的学习任务。
2.2。TCGA的分析数据库
在我们的研究中,647位CRC 51组织和正常对照组得到癌症基因组图谱(TCGA)数据库。随后,与临床参数包括性别、年龄、阶段,T分类、N分类,分类,生存状态和总生存期(OS)提取时间使用环球数码创意二次分析数据传输工具。使用R 3.6.0中的corrplot程序软件,我们使用皮尔逊KLF家族基因之间的相关性分析的方法。limma包是用来看看KLF家庭mRNA表达差异CRC组织和正常对照组(FPKM值)。pheatmap和ggpubr包被用来可视化结果。
2.3。KLF基因遗传变化分析
cBioPortal探索是一个基于网络的工具,可视化和解释多通道癌症基因组数据。癌症基因组学是用来调查KLF cBioPortal CRC的基因和基因突变。
2.4。信使rna表达和甲基化的CRC KLF成员
人类甲基化450 k组TCGA-CRC Illumina公司项目从UCSC的齐娜下载(https://xenabrowser.net)。的β值的CG网站在CRC KLF基因的启动子区域提取使用Perl 5.26软件。后来,DNA甲基化水平和信使rna表达水平之间的相关性在KLF家族基因在CRC corrplot包组织进行了分析。
2.5。分析KLF基因CRC的预后价值
根据最佳分界点,CRC患者综合生存数据分为高、低组。kaplan meier方法用于构造操作系统曲线,和log-rank测试被用来确定生存曲线之间的差异。后,进行单变量Cox比例风险回归分析来确定KLF基因和大幅过滤基因与操作系统。通过单变量和多变量回归分析,我们得到的基因与独立KLF基因家族的预测价值。
2.6。计时器的分析数据库
我们使用了定时器模块验证数据库的基因之间的联系KLF基因表达和免疫细胞浸润在结肠癌和直肠癌14]。
2.7。GSEA
我们使用基因集富集分析(GSEA)推导出可能的进程KLF基因导致结直肠癌的致癌作用15]。TCGA样本分为高、低KLF基因表达的类别。 和错误发现率(罗斯福)的0.25被认为是高纯度。
3所示。结果
3.1。异常的mRNA在CRC KLF家族基因的表达
ONCOMINE数据库被用来观察KLF基因的转录水平CRC和健康控制样本。褶皱的变化(Log2)的mRNA的表达主要KLF基因在CRC患者大大减少,如图1和表S1。皮尔逊相关系数的KLF家族基因然后计算,看看他们是否彼此连接。KLF家族相关的基因在某种程度上,如图2。我们也分析了mRNA的表达KLF家庭成员在CRC和正常组织使用数据从TCGA数据库。limma软件被用来检查差异表达KLF家族基因表达模式及其使用的热图(图所示3(一个))。KLF11 CRC和控制组织的表达并没有发生显著的变化。
(一)
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3.2。差异KLF家庭CRC患者的基因变异
基因改造的17个基因是通过使用cBioPortal数据库调查的参与KLF家族基因在CRC患者。这项研究的结果发表在《癌症研究》杂志上。见图4 (b)KLF家族基因被发现在328年改变样本524 CRC患者(63%)。KLF10有最大的基因变异改变率(15%),而KLF14最低(4%)。其他KLF家族基因的遗传改变利率签名在CRC (KLF1, 5%;KLF2, 6%;KLF3, 6%;KLF4, 5%;KLF5, 14%;KLF6, 7%;KLF7, 7%;KLF8, 7%; KLF9, 7%; KLF11, 5%; KLF12, 12%; KLF13, 6%; KLF15, 6%; KLF16, 6%; KLF17, 6%).
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3.3。相关分析KLF家族基因启动子甲基化和表达水平
使用,TCGA数据库样本,我们研究之间的关系KLF CRC家族基因启动子甲基化和表达水平。几乎所有的CG KLF2网站在启动子区域,KLF7, KLF13, KLF14, KLF15,和KLF16 CRC -与表达式,根据皮尔逊相关结果(图4 (c))。然而,大多数的CG网站其他KLF家族的基因(KLF1、KLF3 KLF4, KLF5, KLF6, KLF8, KLF9, KLF10, KLF12,和KLF17)没有显示一个负面连接表达式,表明不当DNA甲基化可能不是上述基因的异常表达的来源。
3.4。总体生存KLF家族在CRC基因签名
KLF2 mRNA表达高,KLF14, KLF15 KLF17与可怜的操作系统,而高表达KLF3 KLF4, KLF5, KLF6关联到一个更高的整体存活率(图5)。后,KLF家族基因的预后价值CRC患者使用Cox回归方法研究。单变量分析表明,KLF2 KLF14, KLF15和KLF17 OS CRC患者较差显著相关,而KLF3 KLF4, KLF5, KLF6能显著改善OS CRC患者(表1)。调整临床因素(年龄、性别、T、N和M阶段),多变量分析(图6)证实,高表达的KLF3 KLF5和KLF6 CRC患者更好的操作系统的独立危险因素,而高表达KLF15是独立的危险因素为贫困OS CRC患者。
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3.5。TIICs之间的相关性和Prognosis-Related KLF家族基因在CRC患者
因为免疫特征都与癌症的预后,我们使用了定时器数据库调查肿瘤浸润免疫细胞之间的关系(TIICs)和prognosis-related KLF家族基因在结肠癌和直肠癌。图7描述了结果。所有TIICs的渗透程度,包括B细胞、CD4 + T细胞,CD8 + T细胞,中性粒细胞,巨噬细胞、树突细胞,积极与KLF3的表达,KLF5, KLF6结肠癌。KLF3 KLF6表达式和积极渗透水平相关的免疫细胞类型除了直肠癌CD4 + T细胞。KLF5表达式B细胞呈正相关,CD8 + T细胞,巨噬细胞在直肠癌。此外,KLF15表现的积极与CD4 + T细胞和巨噬细胞水平在结肠癌患者而不是直肠癌患者。
3.6。GSEA
进一步探索KLF家族基因的潜在机制影响CRC患者的预后,我们进行了GSEA之间增加和减少KLF3, KLF5, KLF6 KLF15表达数据集,是重要的生存分析。GSEA图所示的结果8。
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3.7。KLFs和免疫检查点
我们分组KLF3的表达,KLF5 KLF6, KLF15根据他们的高、低表达和免疫的差异相比不同群体之间的检查点。我们发现大多数免疫检查点之间的明显不同的两组在高和低表达组KLF6(图9)。
4所示。讨论
KLFs最初是在1993年发现的人类同源染色体黑腹果蝇Kruppel蛋白质和绰号“Kruppel-like。“哺乳动物KLF家庭现在有17个成员,每个都有一个守恒的c端域和一个显著不同的氨基端部分。KLFs越来越被证明发挥关键作用的促进和抑制各种恶性肿瘤(16,17]。直到最近,没有出版物概述了如何KLF家族基因与大肠癌。为了更好地理解临床实践价值观的CRC KLF基因,我们使用生物信息学分析检查表达模式,预后价值,可能所有KLF家人CRC的函数。
先前的研究已经表明,KLF家族的成员在肿瘤组织和细胞株。在胃癌KLF5过度被发现,它已经与更大的肿瘤大小和后肿瘤(T)阶段(18]。KLF8被显示在人肝癌细胞株和样本个体疾病(19]。KLF15显示胃癌中表达下调,但增加在肺癌20.,21]。KLF16表达在乳腺癌组织更大的比正常组织和推倒KLF16大大减少细胞增殖在体外和体内。一贯的一些调查显示,KLF3 KLF4, KLF6显著下调CRC (22]。
生存分析,发现KLF2的表达增加,KLF14, KLF15, KLF17 KLF3表达降低,KLF4, KLF5, KLF6 CRC是糟糕的操作系统。KLF3、KLF5 KLF6, KLF15被证明是独立预后变量影响操作系统的多变量Cox比例风险回归。大量的研究表明,异常KLF表达式也可以用来预测病人的结果。KLF4已被证明是在多种恶性肿瘤,肿瘤抑制和减少KLF4表达式与一个更糟糕的整体存活率在肝细胞癌,胰腺癌,肾细胞癌(23]。在肺癌和肝癌,过度KLF8与降低患者生存的24]。KLF17在CRC是低表达,表达与淋巴结转移和可怜的总生存期,根据最近的研究(25]。
KLF3调节肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移,涉及到修改蛋白质被发现在许多恶性肿瘤。KLF3表达式显示是低肺组织,它被发现反向与TNM阶段和淋巴结转移有关。根据体外和体内研究,KLF3抑制加速肺癌EMT和促进肺癌转移通过STAT3信号通路(26]。过度的KLF3体外抑制细胞增殖和细胞凋亡增加,它也被证明在人类胰腺癌(表达下调27]。在我们的研究中,人类CRC KLF3表达水平是低于正常组织,和单变量和多变量Cox回归分析的结果表明,KLF3与更好的CRC患者的预后相关。先前的研究发现,减少KLF3表达式与积极的表型和CRC患者不良的生存状况,这与我们的研究结果是一致的。这些发现可能会指向KLF3充当CRC的肿瘤抑制基因。
KLF5在癌症中的作用是上下文相关的;在大多数恶性肿瘤,它是致癌基因,而其他人,肿瘤抑制属性(28]。乳腺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌都得益于KLF5 [29日- - - - - -31日]。此外,KLF5表达与肺癌的预后不良,和体外试验表明,减少KLF5可能克服顺铂耐药性在肺癌32]。KLF5表达显著下调在食管鳞状细胞癌与正常食管上皮细胞相比,和恢复KLF5激活物途径表达,导致细胞凋亡,减少癌细胞生存(33]。我们的研究结果显示,低KLF5表达CRC与不良预后有关。
KLF6广泛表达于正常组织,但这是灭活或多种人类恶性肿瘤中表达下调,通常由于杂合性丢失,体细胞突变,启动子甲基化或非编码RNA抑制(34,35]。而野生型KLF6减少肿瘤的生长和发展,几个tumor-derived KLF6基因突变或者拼接变异促进增殖和致瘤性。KLF6表达式在卵巢癌的肿瘤是低于在正常卵巢上皮细胞,而其变体KLF6-SV1表达式拼接高和与先进的肿瘤相关年级36]。沉默KLF6促进增殖和入侵,而下调KLF6-SV1了相反的效果。KLF6-SV1表达的有针对性的减少引发肺癌细胞死亡单独和与顺铂治疗(37]。过度的KLF6-SV1有关穷人生存在肺癌。低KLF6表达与预后差OS次CRC患者在我们的研究中,表明KLF6作品作为一个肿瘤抑制,这与早期的发现是一致的。我们发现许多免疫检查站时两组患者之间的不同分为高、低表达组基于KLF6表达式,这也给了我们一个暗示可能KLF6表达式可能影响免疫疗法。
KLF15在癌形成的作用是刚刚开始出现。KLF15已经被证明可以减少各种癌细胞的扩散,包括胰腺癌、子宫内膜癌和乳腺癌38- - - - - -40]。在肺癌高等人发现KLF15表达是异常高的癌症组织和细胞相比non-tumorous周围组织,和体外的调查表明,降低KLF15表达抑制肺癌细胞增殖和迁移21]。瞿等人发现了KLF15参与神经胶质瘤肿瘤耐药性及其功能测试显示,推倒KLF15 temozolomide神经胶质瘤敏感性增加细胞毒性通过调制O6-methylguanine-DNA甲基转移酶的表达。我们的研究结果显示,KLF15是在CRC组织和正常组织的表达高于低KLF15表达式与可怜的CRC患者的结果。KLF15是负面的表达与Cg网站CRC的甲基化水平。因此,很容易推断出KLF15表达式的损失是由于在其启动子区域甲基化的一部分。由于缺乏相关的研究主题,进一步设计良好的研究关注KLF15生物学和预后相关性的CRC是必要的。
结果表明:四个KLF基因CRC患者的预后密切相关。因此,我们使用GSEA调查这些基因的潜在机制。作为这项研究的结果,结果表明,这些基因参与WNT信号通路,子宫内膜癌,adherens结,等等,所有这些都被认为是与发病率和CRC的进展密切相关。KLF5,这些发现表明,差异表达KLF3 KLF6,和KLF15 CRC可能被利用作为潜在的预后指标和治疗目标,单独或组合。
肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤的形成和发展中扮演着重要的角色,越来越多的研究表明在肿瘤微环境(时差)。有证据表明,“富含多种免疫细胞,它们与临床结果和免疫反应(41- - - - - -43]。KLF3的表达、KLF5 KLF6, KLF15 CRC被证明是高度与免疫渗透水平,该研究的主要成果之一。我们的研究结果显示,这四个基因的转录水平与渗透的水平呈正相关,B细胞的CD4 + T细胞,CD8 + T细胞,中性粒细胞,巨噬细胞和树突细胞。这些发现可能有助于发展的新型免疫治疗药物通过提供广泛的免疫信息。
尽管我们的研究产生了强大的结果,有一定的局限性。因为数据在我们的研究RNA表达数据从互联网获得的资源,我们需要证实我们的结果通过观察蛋白质水平变化及其预后的影响。更多的体内和体外研究,以及临床研究,需要确认我们的结果和调查可能的流程KLFs和CRC之间。
5。结论
KLF表达谱和预后价值的家庭成员在CRC广泛调查在网上工作,给未来的分析独特的见解KLF成员CRC的潜在目标。
数据可用性
的数据公开支持本研究的发现可以在癌症基因组图谱(TCGA)项目https://portal.gdc.cancer.gov/。
的利益冲突
作者宣称他们没有潜在的利益冲突。
确认
这项研究受到了宁波的自然科学基础(2018 a610366)。
补充材料
表S1:重大KLF表达在转录水平的变化之间的CRC和正常样本(ONCOMINE数据库)。(补充材料)