文摘

背景。芍药苷是一种广泛使用的中药的活性成分抗肿瘤活性通过ferroptosis归纳。最近有报道说,ferroptosis新兴在某些类型的癌症;然而,其相关性在神经胶质瘤还没有深入研究。方法。CCK8对细胞增殖试验进行。信使rna和蛋白质的表达被qPCR和免疫印迹检测,分别。临床部分包含IHC标本进行检测。NEDD4L之间的关系和STAT3 coimmunoprecipitation试验验证。细胞凋亡被TUNEL分析确定。一个异种移植小鼠模型是用来验证芍药苷对神经胶质瘤肿瘤细胞的潜力。结果。数据表明,芍药甙能增加NEDD4L表达在神经胶质瘤细胞。NEDD4L表达水平低在神经胶质瘤肿瘤组织与邻近正常组织相比,它与不良预后相关。与此同时,NEDD4L介导STAT3的泛素化。此外,增加NEDD4L显著抑制细胞生存能力和诱导细胞内活性氧的积累水平,伴随着减少的表达关键ferroptosis因素Nrl2 GPX4,当NEDD4L击倒了扭转的影响,表明ferroptosis可能涉及。NEDD4L-induced ferroptosis可以获救迫使STAT3的表达。一个异种移植裸鼠模型表明,芍药苷抑制肿瘤的生长并进一步RSL3糖分会让神经胶质瘤的细胞,另一个知名的ferroptosis诱导物。结论。总之,本研究表明芍药苷可能函数作为神经胶质瘤的有效的药物诱导ferroptosis通过upregulation Nrl2 NEDD4L和镇压,GPX4, STAT3。

1。介绍

神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤源自人类中枢神经系统(1]。尽管已经尽最大努力提高胶质瘤的预后在过去的40年里,有限的进步已经实现,特别是在高恶性肿瘤患者(2]。癌症治疗的新模式针对胶质瘤本质上一直是必要的。我们最近的发现表明芍药苷(PF)显示有前途的抗癌潜力在神经胶质瘤细胞3]。PF的活性成分芍药棺罩。(又名p·阿尔巴),传统的中医。最近的研究表明,PF可能是一种有效的抗肿瘤药物对各种类型的癌症。例如,PF诱导细胞周期阻滞在大肠癌HT29 p53/14-3-3ζ通路(4]。此外,研究发现,PF可以增强5-fluorouracil-induced在人类胃癌细胞凋亡抑制NF -κB通路(5]。

到目前为止,如何在神经胶质瘤PF功能的机理还没有被报道。然而,我们以前的研究表明STAT3的泛素化水平升高在PF-treated神经胶质瘤细胞(3]。传感器的信号和转录激活3 (STAT3)是研究转录因子,夫妇细胞外刺激信号和基因表达。众所周知,STAT3参与多种重要的细胞过程,如细胞周期,血管生成和细胞凋亡6,7]。癌症作为一种重要的蛋白质在肿瘤发生过程中,STAT3的功能已被广泛的研究(8- - - - - -10]。据报道,STAT3的表达以及激活也与低存活率和可怜的神经胶质瘤患者预后的结果(11,12]。因此,STAT3显然是一个有吸引力的目标治疗神经胶质瘤。已经证明,通过各种方法抑制STAT3会引发增长逮捕以及细胞凋亡的神经胶质瘤细胞(13- - - - - -15]。此外,据报道,STAT3提高细胞的抗氧化能力通过激活核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)。Nrf2是一种转录因子,防止氧化损伤通过调节多种抗氧化蛋白的表达(16]。据报道,活性氧(ROS)可能会导致异常的氧化分子如蛋白质、脂质和DNA。因此,肿瘤细胞进化到开发一个抗氧化防御系统来处理活性氧水平升高为了成功建立肿瘤,这使得有效规避癌症细胞死亡的最重要的特征之一(17- - - - - -19]。作为nonapoptotic形式的监管相对于凋亡细胞死亡,通常necrosis-like ferroptosic细胞形态学的标志性的积累致命的iron-dependent脂质生物化学ROS水平。多个氧化和抗氧化机制在ferroptosis控制氧化损伤。据报道,Nrf2 / STAT3信号通路可能参与调节ferroptosis [20.]。细胞接受ferroptosis不同于凋亡、坏死和自噬在细胞形态、蛋白表达以及基因表达水平。Ferroptosis逐渐成为科学研究的热点概念后,在2012年被首次提出。根据出版物,Erastin和RSL3诱发ferroptosis [21,22]。谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4) ferroptosis是监管的关键分子,和GPX4的表达式或活动可以诱导ferroptosis [22]。因此,我们提出调查ferroptosis是否参与PF-triggered神经胶质瘤细胞死亡的研究上述因素。

另一方面,鉴于PF能促进根据我们之前研究STAT3的泛素化3),我们试图屏幕和识别ubiquitinase (CBL SYVN1, NEDD4L, SOCS5)绑定和调解泛素化的STAT3基于我们的数据分析结果。我们发现PF大大促进人类NEDD4L的表达式。作为一个成员E3-ubiquitin蛋白连接酶NEDD4家庭,NEDD4L表示各种类型的癌细胞和可能致癌的属性(23,24]。通过分析细胞、数组和RNA序列TCGA神经胶质瘤患者的数据,我们发现NEDD4L神经胶质瘤(表示在一个相对较低的水平25]。此外,据报道,NEDD4L的差别,对这些基因的相关进展和恶性神经胶质瘤(23]。此外,过度NEDD4L诱导胶质瘤细胞死亡(25]。然而,这些表型NEDD4L如何驱动机制是众所周知的。因此,本项目旨在研究和机制的影响PF / NEDD4L / STAT3在神经胶质瘤的扩散。

2。方法和材料

2.1。细胞培养

神经胶质瘤细胞株U251和U87保持在DMEM培养基(Hyclone SH30243.01;洛根、UT、美国)和10%的边后卫(16000 e044 GIBCO;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)补充,一个额外的1% penicillin-streptomycin (Solarbio P1400,中国北京)补充道,和细胞培养在37°C公司5%₂孵化器。

2.2。质粒构建

NEDD4L的编码序列(NM_001144966.2)和STAT3 (NM_139276.3)是通过使用包含限制性内切酶切割的引物合成和BamH EcoR我网站,和插入pLVX-Puro向量生成NEDD4L STAT3超表达质粒,如下:NEDD4L-F: 5′-CGGAATTCATGGAGCGACCCTATACATTTAAG-3′(EcoR I)NEDD4L-R: 5′-CGGGATCCTTAATCCACCCCTTCAAATCC-3′(BamH I)STAT3-F: 5′-CGGAATTCATGGCCCAATGGAATCAGC-3′(EcoR I)STAT3-R: 5′-CGGGATCCTCACATGGGGGAGGTAGCG-3′(BamH I)

NEDD4L干扰序列(如表所示1克隆到pLKO。)1-puro plasmid to downregulate NEDD4L expression.

2.3。细胞转染

当在对数生长阶段,U251或U87细胞使胰蛋白酶化和播种6-well板在2×10⁶细胞/。细胞培养在37°C在5%的股份有限公司₂孵化器。confluency当细胞长到60 - 70%,U251或U87细胞转染oeNEDD4L (MOI = 5, 5μl)和空质粒(向量,莫伊= 5,5μl)、shNEDD4L-1 shNEDD4L-2 shNEDD4L-3 (MOI = 5, 5μl)和shNC (MOI = 5, 5μl)或oeSTAT3 (MOI = 5, 5μl)和空质粒(向量,莫伊= 5,5μl)使用转染试剂Lipo2000根据制造商的协议。转染24小时后,取而代之的是一个完整的介质无血清培养基,细胞培养48小时。

2.4。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

细胞增殖是访问CCK-8化验使用细胞增殖和细胞毒性试验设备(SAB CP002;美国马里兰州大学公园)按照制造商的协议。简单地说,包含2×10 100 ul的解决方案³U251或U87细胞被播种在每个的96孔板和孵化过夜。细胞被分成不同的治疗方法。后来,10μl CCK-8解决方案被添加到每个。吸光度在每个测量在450海里一盘读者评价细胞的可行性。

2.5。生化检测

的水平MDA(丙二醛)和铁^{2 +}在细胞,分别测量使用MDA (A003-4-1、南京建成生物技术研究所、江苏、中国)和铁试验(ab83366 Abcam)工具根据制造商的指示。分析进行了一式三份,手工计算每个样本的平均值。

2.6。实时定量PCR(存在)

mRNA水平由存在决定的。与三总RNA提取试剂(σT9424)。互补脱氧核糖核酸生成使用RevertAid合成第一链cDNA工具包(Fermentas,汉诺威,医学博士,美国)。SYBR绿色qPCR主混合(# K0223,热费希尔,罗克福德,美国)是用于qPCR根据制造商的指示。相对mRNA水平正常化GAPDH和计算2^−ΔΔCt。表中列出使用的引物2。

2.7。免疫沉淀反应(IP)检测

总蛋白质是分组与1孵化μ克Rabbit-IgG (sc - 2027,圣克鲁斯生物技术)和1μ克IP-indicated抗体在4°C一夜之间,而未经处理的蛋白质作为输入控制,其次是孵化的蛋白质A / g PLUS-Agarose 2小时在室温下形成免疫复合物。使离心后4分钟rpm在4°C, 1毫升的裂解缓冲了洗蛋白质A / G Plus-Agarose珠3次,和适当的蛋白质加载缓冲区添加和煮5分钟洗提免疫沉淀反应。离心后1分钟的rpm,上层清液收集进行免疫印迹分析。anti-NEDD4L抗体(Ab46521 Abcam)和anti-STAT3 (Ab32500 Abcam)申请IP检测,而anti-NEDD4L (13690 - 1 - ap, Proteintech)和anti-STAT3 (10253 - 2 - ap, Proteintech)被用于免疫印迹分析。

2.8。免疫印迹分析

确定蛋白质水平,样本细胞溶解产物分离与SDS聚丙烯酰胺凝胶。感兴趣的蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜然后堵塞5%脱脂奶了至少一个小时。膜被涂抹在一夜之间优化主要抗体4 C和二级抗体一小时在室温下,分别。蛋白质丰度是由化学发光成像系统(Tanon 5200年,中国上海)。Anti-SYVN1 (Ab170901) anti-CBL (Ab32027) anti-SOCS5 (Ab97283) anti-NEDD4L (Ab46521) anti-GPX4 (Ab125066) anti-STAT3 (Ab68153) anti-p-STAT3 (Ab76315)提供从Abcam和anti-Nrf2 (16396 - 1 - ap)和anti-GAPDH (60004 - 1 - 1 g)从Proteintech获得。

2.9。测量细胞内ROS水平

细胞内ROS水平测量使用活性氧测定工具包(S0033 Beyotime)。2′,7′-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA),这是很容易氧化荧光二氯荧光素(DCF)细胞内ROS,是它的主成分,因此,ROS水平量化。短暂,接受各种治疗后收集细胞球然后resuspended 1毫升的酷PBS。一个10μM探针染色工作解决方案是由稀释10毫米DCFH-DA探测解决方案1:1000年的无血清培养基。细胞培养与DCFH-DA探测解决方案在黑暗中30分钟的37°C。管是每5分钟反向混合细胞和解决方案。样本用无血清培养基三次,然后以488海里励磁和525海里排放流式细胞分析仪(CytoFLEX,贝克曼)。

2.10。免疫组织化学(包含IHC)

组织切片第一次冲洗三次0.02 PBS和固定在4%多聚甲醛溶液(10010018,国家医药有限公司)30分钟。接下来,幻灯片是permeabilized H为3%₂O₂(10011218,上海国药控股)10分钟,然后被封锁在1%牛血清白蛋白(A8010 Solarbio)在室温下一个小时。之后,组织切片被孵化与初级抗体NEDD4L (13690 - 1 - ap, Proteintech)和STAT3 (Abcam ab68153)加湿盒1小时在室温下。组织切片与PBST冲洗三次删除任何剩余的抗体。接下来,组织幻灯片中孵化HRP-labeled二级抗体(d - 3004,长岛各)在室温下30分钟。幻灯片是沾轻拍(fl - 6001,长岛各),然后用自来水冲洗去除染色方案。幻灯片与苏木精复染色(714094年,贝索)3分钟,其次是孵化与1%盐酸酒精分化。幻灯片然后用自来水洗了10分钟,然后后来受到一个烤架,透明和关闭,后片是在显微镜下成像(ECLIPSE倪,尼康)。IHC结果由两名有经验的病理学家独立访问。染色信号被分级为0,阴性;1、弱阳性; 2, moderate positive; and 3, strong positive. The percentage of positive cells was scored as 0, < 5%; 1, 5%–25%; 2, 25%–50%; 3, 50%–75%; and 4, > 75%. The staining index was defined as follows: staining index = staining intensity × percentage of positive staining cells. The sample was categorized as a high expression if the staining index was higher than 3.

2.11。在活的有机体内实验

U251细胞(6×10⁶)接种的侧翼4 5-week-old无胸腺的裸小鼠(上海实验动物有限公司、上海、中国)皮下注射来生成一个皮下异种移植肿瘤模型。2周后,肿瘤模型成功建立,老鼠单一治疗,结合100毫克/公斤RSL3(2次/周)和1.0克/公斤/天PF。肿瘤体积测量每4天绘制生长曲线。老鼠牺牲细胞注射后4周。收集肿瘤异种移植、拍照和称重和肿瘤细胞凋亡被Tunel染色分析。所有关心和实验室的实验动物进行协议批准后湖州分医院,附属医院分湖州大学(浙江、中国)。

2.12。检测细胞凋亡

检测凋亡细胞,终端原位脱氧尿苷三磷酸生物素尼克结束标记(TUNEL)法。总之,标本首先脱蜡、水化,然后孵化的蛋白酶K (40μ在37°C g / ml)一小时。幻灯片被接受3% H₂O₂(甲醇稀释)在室温下30分钟。与PBS洗涤后,部分被孵化与平衡缓冲在室温下五分钟,然后孵化与末端转移酶酶在37°C两个小时。部分被孵化100 ul的挡车器30分钟37°C。幻灯片是覆盖在anti-digoxigenin过氧化物酶30分钟37°C。幻灯片被可视化与苯二胺与苏木精复染色。总共500个细胞数为每个部分。凋亡指数计算凋亡细胞的比例数/总细胞数乘以100。肿瘤标本分类根据TUNEL染色为≤10%或染色细胞> 10%。

2.13。统计分析

所有统计分析在当前项目进行GraphPad Prism 7.0软件(美国圣地亚哥,CA)。至少三个独立重复实验的结果。给出的数据平均值±SD。单向方差分析(方差分析)与图基posthoc测试申请平均值的比较。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。PF治疗显著增加NEDD4L表达在神经胶质瘤细胞

我们之前的研究表明,PF可以促进STAT3的泛素化3]。识别潜在ubiquitinase执行STAT3泛素化,首先,我们选择了4个候选人(CBL SYVN1, NEDD4L, SOCS5),可以结合STAT3通过数据分析。然后U251细胞的表达这四个候选人在回应PF治疗检查mRNA和蛋白水平。我们只注意到PF在存在剂量依赖的相关性显著促进NEDD4L的表达方式而不影响其他3 ubiquitinases(人物1(一)和1(b))。来验证这一观点,我们研究了NEDD4L的表达水平在另一个神经胶质瘤细胞系U87 PF治疗。在U87细胞的表达NEDD4L作为PF用量的增加逐渐增加(数据1(c)和1(d))。此外,PF时间的方式促进NEDD4L的表达在神经胶质瘤细胞(数字1(e)和1(f))。综上所述,我们的数据表明,PF可能诱发STAT3泛素化通过促进NEDD4L的表达。

3.2。NEDD4L低表达在神经胶质瘤和与患者的预后相关

为了探索NEDD4L在神经胶质瘤的潜在作用,我们首先比较168年NEDD4L癌症样本的表达和5 TCGA的正常组织数据库。数据显示NEDD4L神经胶质瘤(图中明显表达下调2(a))。此外,我们进行了基因集富集分析(GSEA)识别信号通路显著改变随着NEDD4L水平。原来NEDD4L负调节STAT3通路的激活(图2(b))。为了验证NEDD4L和STAT3的表达水平在胶质瘤组织中,我们进行了免疫组织化学染色NEDD4L和STAT3在商用神经胶质瘤组织芯片,并发现NEDD4L表达水平负相关神经胶质瘤组织中STAT3的表达,而这两个基因的表达水平在正常组织(图类似2左面板(c))。此外,kaplan meier分析表明,NEDD4L-low-expressing神经胶质瘤患者表现出更糟糕的预后与患者NEDD4L-high-expressing神经胶质瘤(图2(c)右面板),这表明潜在的NEDD4L作为生物标志物预测神经胶质瘤病人的临床结果。

3.3。NEDD4L结合STAT3在神经胶质瘤细胞并诱导其泛素化

为了确定NEDD4L之间的交互和STAT3在神经胶质瘤细胞,我们工程神经胶质瘤U251细胞过度表现NEDD4L,由qPCR和免疫印迹(验证数据3(一)和3(b))。然后,事实证明,迫使NEDD4L显著抑制蛋白质的表达水平的总以及磷酸化STAT3 (Ser727)而不影响STAT3 mRNA水平(数字3(c)和3(d))。另一方面,这一过程由治疗MG132显著抑制,表明NEDD4L可能下调STAT3的表达水平的蛋白质降解途径(图3(e))。然后我们进行了coimmunoprecipitation (Co-IP)分析确定STAT3与NEDD4L在神经胶质瘤U251细胞。正如我们所料,NEDD4L之间的绑定和STAT3阐明了正向和反向IP(图3(f))。此外,强制表达NEDD4L显著增加STAT3的泛素化(图3(g))。

3.4。被迫表达NEDD4L显著抑制胶质瘤细胞的增殖,增加细胞内ROS水平,而有反向影响差别NEDD4L对这些

我们之前建议的数据,高水平的NEDD4L改善神经胶质瘤患者的总生存期,我们建议调查是否操纵NEDD4L神经胶质瘤细胞增殖的影响。我们生成一个U251 NEDD4L-overexpression (oeNEDD4L)细胞株如上所述,执行CCK8化验检查细胞增殖每隔12小时48小时。事实证明,被迫表达NEDD4L禁止转染后细胞增殖显著24小时(图4(a))。此外,细胞内ROS水平增加(图4(b))。同时,Nrf2的表达和GPX4,两个著名ferroptosis信号通路的关键因素,是抑制(图4(c))。与此同时,道达尔和磷酸化STAT3的水平显著下降。为了进一步验证这一观点,我们生成NEDD4L-knockdown (shNEDD4L) U87使用三个独立的shrna瞄准NEDD4L神经胶质瘤细胞系。如数据所示4(d)和4(e)的表达NEDD4L明显禁止mRNA和蛋白水平。相反oeNEDD4L细胞增殖是NEDD4L-knockdown提升神经胶质瘤细胞(图4(f))。同样,细胞内ROS水平明显下降后推倒NEDD4L(图4(g))。Nrf2的表情,GPX4, STAT3磷酸化STAT3都增加,而NEDD4L shRNA推倒后表达降低(图4(h))。这些数据表明,NEDD4L负调节以及STAT3 ferroptosis关键因素。

3.5。Upregulation STAT3的显著逆转NEDD4L-Induced神经胶质瘤细胞增殖抑制和细胞内ROS水平标高

为了调查是否通过操纵STAT3 NEDD4L调节神经胶质瘤细胞增殖,我们生成STAT3-overexpressing U251胶质瘤细胞,和STAT3的超表达是qPCR和免疫印迹(数据进行验证5(一)和5(b))。此外,我们感应STAT3的过度表达,(oeSTAT3)单独或连同NEDD4L过度(oeSTAT3-oeNEDD4L)。有趣的是,我们注意到oeNEDD4L引起的细胞增殖的抑制是cooverexpression获救的STAT3(图5(c))。符合这个观察,细胞内活性氧水平升高引起NEDD4L超表达也被强迫拯救STAT3的表达(图5(d))。同样,NEDD4L-induced Nrf2和GPX4表达下降后恢复到正常甚至更高水平的过度STAT3(图5(e))。STAT3和磷酸化STAT3的蛋白质含量增加的超表达甚至STAT3在oeNEDD4L背景(图5(e))。综上所述,这些数据暗示NEDD4L进行操纵STAT3的对神经胶质瘤的影响,这似乎是下游因子信号通路。

3.6。PF治疗能抑制细胞增殖,增加细胞内ROS水平在神经胶质瘤细胞通过调节NEDD4L表达式

正如上面提到的,我们之前的研究中隐含PF的抗肿瘤效应之间的关系和STAT3泛素化。为了进一步阐明机制参与了这一过程,我们首先检查了细胞内ROS水平应对PF治疗。如图6(一)细胞内ROS水平随着PF用量的增加逐渐增加。为了确定ferroptosis影响PF治疗,我们检查了STAT3的表达/ p-STAT3, Nrf2,神经胶质瘤和GPX4 PF-treated U87细胞,发现所有这些因素都抑制蛋白质水平是剂量依赖性的方式(图6(b))。此外,治疗PF显著抑制细胞增殖(图6(c))和MDA的水平增加(图6(d))和铁^{2 +}(图6在神经胶质瘤细胞(e)),而ferroptotic抑制剂柴油可以部分逆转PF的影响,表明PF治疗能引起ferroptosis神经胶质瘤细胞。为了测试这个假设PF可能通过高程NEDD4L函数,我们撞倒NEDD4L U87神经胶质瘤细胞24小时之前对这些细胞PF治疗。我们推测,NEDD4L消融后,促进了细胞的细胞内ROS水平与PF治疗是降低(图6(f)),与细胞内ROS水平一致,消融的NEDD4L减毒PF的生长抑制作用(图6(g))。同样,Nrf2的表达水平,GPX4, STAT3和p-STAT3(图6(h)),以及MDA的水平(图6(我))和铁^{2 +}(图6(j))接受PF治疗后恢复接近正常NEDD4L的缺失。综上所述,我们的数据表明,PF进行抗肿瘤效果通过调节NEDD4L的表达,这可能会进一步操纵ferroptosis在神经胶质瘤细胞。

3.7。通过增加Ferroptosis PF抑制肿瘤生长的肿瘤细胞体内和体外

接下来,我们试图评估疗效的PF U251异种移植肿瘤模型。一般来说,U251细胞植入裸鼠皮下注射,和轴承建立小鼠肿瘤注射2周后,他们受到的四个以下治疗:车辆;RSL3(100毫克/公斤,2次/周),一个实验验证药物诱导ferroptosis [26];PF(1克/公斤/天);伴随政府RSL3和PF。肿瘤生长密切监控。我们的结果表明,单一药物疗法显著减毒肿瘤的生长。此外,RSL3和PF相比,显著降低肿瘤负荷和长期发展结果RSL3或PF单一疗法(数字7(一)和7(b))。老鼠牺牲接受治疗后28天。肿瘤组织收集之后,受到TUNEL分析评估凋亡状态。显然,PF治疗大大最终导致凋亡抑制肿瘤的生长,和增强RSL3诱导细胞凋亡,这可能会进一步使敏感神经胶质瘤细胞RSL3治疗(图7(c))。符合在活的有机体内结果,在体外结果表明,RSL3和PF优于RSL3或PF单一疗法更显著地抑制细胞增殖(图7(d))和MDA上升(图7(e))和铁^{2 +}(图7神经胶质瘤(f))的水平。在一起,我们的数据表明,PF和RSL3可能通过诱导ferroptosis有利于抑制神经胶质瘤。

4所示。讨论

寻找活性成分的中药和发现潜在的机制已经成为医学研究的热点话题。作为一个活跃的化合物,它的主要成分是一种芍药笼罩。(a.k.。p·阿尔巴),芍药苷(PF)表现出巨大的潜在抗肿瘤效应在各种类型的癌症通过瞄准不同的细胞活动,如细胞周期阻滞、凋亡、迁移、和epithelial-mesenchymal过渡(EMT) [27- - - - - -29日]。此外,PF的抗癌效果已报告在胶质母细胞瘤(30.- - - - - -32]。我们之前的研究表明,PF抑制人类神经胶质瘤细胞增殖抑制STAT3通路通过调节其营业额通过泛素化途径3]。

在这项研究中,我们推动知识的PF治疗价值和机制呈现PF的抗肿瘤能力。我们的数据表明,PF可以诱导STAT3泛素化通过促进NEDD4L的表达。作为一个成员的E3连接酶NEDD4家庭,NEDD4L不仅目标膜蛋白包括离子通道和转运蛋白,但也触发某些蛋白质的降解参与癌症信号通路如Dvl2 SMAD2, SMAD7 [33,34]。已经证明NEDD4L抑制ferroptosis退化的调停lactotransferrin (LTF)蛋白质功能的激活ferroptosis [35]。Ferroptosis被定义为一种氧化iron-dependent脂质peroxidation-induced程序性细胞死亡。ferroptosis的最重要特征之一是快速积累的活性氧(ROS)引起的高水平的细胞不稳定铁(36]。和活性氧的作用在癌症已经得到充分的研究。例如,它已经被证实高浓度的活性氧渲染的破坏性影响细胞功能和结构导致氧化应激,随后的发展各种疾病包括炎症、老年性疾病和癌症(37,38]。,众所周知,ROS在促有丝分裂的信号级联扮演重要角色以延长激活生长因子,促进细胞信号因子(39,40]。

然而,在神经胶质瘤NEDD4L的确切作用还没有完全阐明。在这项研究中,我们注意到的表达NEDD4L由PF调节剂量和时间的方式。然后我们发现NEDD4L下调在神经胶质瘤肿瘤组织与正常组织相比,这是符合公布的数据(25),和NEDD4L的表达水平与癌症患者的预后相关。我们还提供确凿的证据表明NEDD4L负调节STAT3水平通过调停其泛素化,弥合差距PF和STAT3在先前的研究报道。STAT3的致癌作用已经被广泛的研究在过去的几十年里8- - - - - -10]。据报道,STAT3可能是一个有前途的目标治疗神经胶质瘤(41]。它也被报道,STAT3的表达和激活相关的低存活率和神经胶质瘤患者的不良预后11,12]。此外,STAT3一直建议参与神经胶质瘤细胞进展通过塑造免疫微环境(42]。另一方面,有人建议,STAT3在ferroptosis中扮演关键角色,展示了一种新方法减弱耐药性在骨肉瘤20.]。综上所述,这些数据支持解决的重要性在战斗中STAT3通路的战斗神经胶质瘤。

此外,我们的数据表明,迫使NEDD4L抑制胶质瘤细胞生长的表达可能通过诱导ferroptosis,表现为细胞内活性氧积累和抑制表达的关键因素等ferroptosis Nrf2 GPX4。据报道,Nrf2需要神经胶质瘤干细胞自我更新(43- - - - - -45]。GPX4也参与了增殖,迁移,和神经胶质瘤细胞的凋亡46]。因此,Nrf2的表达式和GPX4由oeNEDD4L可能有助于抑制胶质瘤细胞生长的多个意思。此外,NEDD4L驱动器STAT3的泛素化,也扮演着关键的角色在ferroptosis正如前面所讨论的那样。此外,我们的异种移植数据表明,PF可以抑制神经胶质瘤肿瘤的生长通过激活NEDD4L / STAT3 / Nrf2 /轴最终触发ferroptosis GPX4信号。和抗肿瘤效果可以增强相伴PF RSL3总局。

众所周知,ferroptosis诱导物,通过瞄准GPX4 RSL3抑制肿瘤的生长。然后,PF可以提高RSL3治疗彻底抑制GPX4或诱导ferroptosis和细胞凋亡。因此,需要进行更多的研究来探索特定的潜在机制。

5。结论

综上所述,本研究表明,PF可以函数作为神经胶质瘤治疗的抗肿瘤剂通过瞄准NEDD4L-dependent STAT3泛素化以及通过调节Nrf2 / GPX4信号轴,这可能引发ferroptosis。此外,PF神经胶质瘤病人受益,通过增强抗肿瘤效果的其他ferroptosis RSL3等诱发,这可能为新的治疗模式铺平了道路。

数据可用性

中给出的数据支持当前的研究文章。

伦理批准

所有关心和实验室的实验动物进行协议批准后湖州分医院,附属医院分湖州大学(浙江、中国)。

信息披露

小胡聂是第一作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

zz的构思和设计研究。XHN、平方、YX JX,提单,SFZ, YTL完成该实验,收集和分析数据。zz写的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿,同意负责确保所有方面的研究的准确性或完整性的任何部分工作适当的调查和解决。小胡聂盛和秋同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(81703752),和浙江省重点研发项目,中国(2021号c03067)。

补充材料

补充图1。NEDD4L的表达在神经胶质瘤细胞株U251, U87 - 293 t细胞。补充图2。治疗芍药苷和NEDD4L upregulation可能通过增加ferroptosis抑制神经胶质瘤细胞系增殖。与Erastin U251细胞治疗(10μ米)单独或结合PF或与NEDD4L过度表达质粒转染24小时。(一)对细胞的增殖是由CCK8化验。(b)脂质ROS水平通过流式细胞仪检测。(c) - (d)水平的MDA (c)和铁^{2 +}U251细胞(d)测量使用MDA和铁试验装备。 与车辆;^{# #} 与10μM Erastin-Vector。(补充材料)