文摘

背景。越来越多的证据表明necroptosis相关性强,抗肿瘤免疫力。然而,精确的表达模式necroptosis-related基因在皮肤黑色素瘤(CM)没有被清楚地阐明他们也没有影响肿瘤微环境中的免疫细胞浸润。方法。我们调查necroptosis-related基因的表达模式的基于67 necroptotic皮肤黑色素瘤相关基因和有条不紊地表达模式与肿瘤免疫微环境的综合表征。利用主成分分析方法,NRG分数是量化necroptotic基因的表达模式在CM的病人。结果。三种不同necroptotic亚型测定与生存显著差异,显示不同的免疫细胞渗透的特点。NRG分数高集团全面免疫抑制为特征的严重免疫治疗疗效和预后不良,而低NRG分数组表示一个健壮的激活免疫功能和更好的应对免疫疗法,这可能是负责一个更好的预后。此外,NRG分数预后的预测能力和免疫治疗效益进一步重新检验它使用皮肤黑色素瘤的其他独立的数据集。结果表明,NRG分值较低的患者表现出长期生存。令人惊讶的是,所有的病人与CM的临床反应,包括完整的响应/部分反应,属于低NRG分数组。结论。我们目前的工作显示necroptosis-associated基因的表达模式之间的密切联系和肿瘤免疫微环境。NRG的分数可以作为一个潜在的预测进行独立评估患者的预后与CM和有效地估计响应免疫疗法,从而促进合适候选人的识别与CM免疫疗法和制定个性化的治疗方法。

1。介绍

皮肤的黑色素瘤(CM)是最致命的皮肤癌,在早期转移和预后不良(1]。流行病学证据表明,CM的发病率已大大增加了170%,至289950例全世界从1990年到2019年,导致皮肤癌症死亡人数的80% (2,3]。此外,厘米每年导致约55500人死亡,不到20%的人拥有先进的CM诊断后存活5年以上(4,5]。在过去的十年中,高级厘米治疗景观发生了翻天覆地的变化,随着免疫疗法的发展由免疫检查点封锁(ICB),从而有效地促进免疫系统的重建和诱导抗肿瘤免疫反应持续6]。然而,银行独立委员会的一个明显的限制,所观察到的,仅仅是一小部分患者CM持久的反应可能会从中受益,虽然没有客观的反应患者免疫治疗60 - 70%的厘米,20 - 30%的患者没有客观缓解复发与肿瘤复发和进展(7- - - - - -9]。因此,可靠的指标或预测需求量很大,以帮助确定适当的CM个体免疫疗法。

Necroptosis是一种新型的细胞程序性死亡与形态特征类似于坏死依靠半胱天冬酶量独立的死亡受体的激活机制,从而增加互动的各种磷脂膜透性,从而促使趋化因子和细胞因子的释放,诱导炎症和免疫反应(10,11]。在过去的五年里,增加碎片的证据已经证明了一个强大的抗肿瘤免疫和necroptosis之间的联系。肿瘤细胞经历necroptosis一直显示的特点是免疫系统激活,尤其是CD8 + T细胞抗原表达和激活的肿瘤微环境(时间)12,13]。此外,许多研究发现免疫检查点之间的可能的组合影响封锁(ICB)和诱导necroptosis在促进长期抗肿瘤免疫(10,14,15]。靶向免疫刺激性机制,necroptotic肿瘤细胞模仿纳米疫苗证明增加抗肿瘤免疫,诱导自然杀伤(NK)细胞的扩张和CD8 + T细胞,和multiepitope T细胞反应(16]。此外,疫苗接种的抗肿瘤效应可以优化结合免疫抑制剂检查站(艾多酷)体内16]。这些结果表明,necroptosis强烈的生物过程与抗肿瘤免疫力有关,这表明necroptosis可能是一个潜在的免疫治疗目标和necroptosis-related基因的表达模式可能作为一种有效的预测因子的响应厘米患者的免疫治疗和预后。

目前的工作评估necroptosis-related基因的表达模式之间的联系与时间相结合的免疫细胞浸润水平TCGA基因组和转录组数据和GEO-derived厘米样本。此外,三个不同的表达模式necroptosis-related基因已经被鉴定通过无监督聚类,显示明显的差异在预后和肿瘤免疫微环境的景观。此外,在这项研究中,一个可靠的评分系统,NRG得分,建造评价necroptosis-related基因的表达模式在个体肿瘤和全面评估患者免疫治疗的反应厘米,从而协助制定个性化的治疗策略。

2。方法和材料

2.1。CM数据采集和预处理

这项研究的详细工作流程如图1(一)。首先,我们从公共数据库搜索和下载的基因表达数据集,以及完整的临床癌症基因组图谱的注释(TCGA)基因表达数据库和综合(GEO)数据库。个人,选择完整的生存信息进行进一步分析。总的来说,685厘米样本数据集(TCGA-SKCM和GSE65904)被确定为进一步评估。此外,独立的CM数据集(GSE19234),包括个人44厘米,分析验证NRG的预后价值得分。此外,一个独立的CM数据集(GSE91061),分析了包括个人接受免疫治疗49厘米,再次确定NRG分数免疫治疗的预测能力。关于TCGA的数据集,RNA序列数据,是相对于基因表达(FPKM值),已获得来自加州大学圣克鲁斯齐娜浏览器(基因组数据共享(环球数码创意))。地理数据集,我们直接导出矩阵归一化后的文件。更具体地说,我们转换FPKM值记录每千碱基百万(TPM)值。我们从非生物技术偏差纠正批处理效果的“战斗”算法。 In addition, from the TCGA database, the somatic mutation data were obtained. R Bioconductor and R (version 4.1.1) packages were used to perform data analysis.

2.2。Mutation-Related基因和肿瘤Mutation-Related签名

一组基因被发现包括necroptosis相关的67个基因通过基因集富集分析(GSEA) (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jspnecroptosis(上)和先前的研究17]。本研究采用显然MutSigCV算法来确定突变基因。具体而言,MutSigCV应用来确定不同的充实non-silent体细胞突变的单基因通过消除背景突变速率在一个特定的突变上下文。此外,我们使用瀑布R的函数包“maftools”来描述SMG和基因的突变景观相关necroptosis TCGA-SKCM队列。67年的CNV景观necroptosis-related基因存在于23对染色体与“RCircos”包了。

2.3。临床验证通过免疫组织化学染色

一些代表necroptotic基因的表达模式(RIPK3, HSP90AA1, PLK1、SLC39A7 SQSTM1)在正常和CM组织临床验证使用免疫组织化学染色源自人类蛋白质图谱(HPA) (https://www.proteinatlas.org/)[18]。这些免疫组织化学图像得到了本研究从CM 53至88岁的患者。抗体用于这些图片如下:RIPK3 (HPA055087 Sigma-Aldrich) HSP90AA1 (CAB002058 Sigma-Aldrich) PLK1 (HPA053229 Sigma-Aldrich) SLC39A7 (HPA053999 Sigma-Aldrich)和SQSTM1 (CAB004587 Sigma-Aldrich)。

2.4。无监督聚类为Necroptosis-Related基因

这些基因相关的预后价值necroptosis患者CM透露了单变量Cox回归模型。我们使用无监督聚类分析来确定不同亚型的necroptosis和分裂厘米个人后续分析,基于necroptosis相关的67个基因。集群的稳定性和数量被确定通过共识聚类算法。之前的流程进行了通过ConsensusClusterPlus包(19),分类的稳定性是保证通过1000重复。

2.5。(度)的差异表达基因不同Necroptotic亚型

基于选定necroptosis相关的基因,患者CM被分成三个不同的necroptosis集群。经验贝叶斯方法是用来确定不同necroptosis集群之间的度。此外,意义过滤标准识别度确定的调整值小于0.001。

2.6。免疫细胞的渗透时间估计通过定时器数据库,Single-Sample e基因集富集分析(ssGSEA)和反褶积算法

我们利用了“CIBERSORT”包来量化的水平各种免疫细胞的浸润在CM 1000排列。此外,基质/免疫细胞(基质/免疫分数)进行评估使用估计算法(20.]。各种免疫细胞的浸润程度在身上也评估single-sample基因集富集分析(ssGSEA)算法。基因板应用于标签不同免疫细胞类型的时间被Charoentong通过研究et al。21]。各种免疫细胞类型的相对丰度在时间是通过浓缩得分由ssGSEA表示。此外,计时器数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)提供了详细信息系统调查的免疫渗透在各种类型的肿瘤22]。基于基因表达谱,先前描述的算法中使用计时器数据库评估水平的免疫细胞浸润(23]。我们应用计时器与渗透评估RIPK3的关系水平的几个亚型的CD8 + T细胞。

2.7。基因变异分析(GSVA)和功能注释

在生物过程中三个免疫集群的差别被GSVA进一步评估,这是一个无监督和非参数方法来评估生物过程的变化活动和样品的信号通路24]。一个调整值小于0.05被认为是重要的统计。使用clusterProfiler R包的功能注释基因本体论(去)和基因和基因组的京都百科全书(KEGG)度也进行分析,用截断值对应错误发现率< 0.05。我们从MSigDB数据库下载基因集RIPK3相关性的分析的几种途径。

2.8。代的NRG的分数

度决定从不同necroptosis集群首次规范化所有样本,选择重叠度。个人被分为不同的亚型通过无监督聚类分析为后续分析根据重叠度。然后我们使用一致聚类算法确定的数量和稳定三个基因簇。此外,每一个基因的预后分析这个签名进行了单变量Cox回归,我们提取的基因与著名的预后价值进行后续分析。接下来,主成分分析(PCA)进行建立免疫基因签名,与主成分1和2被签名的分数。方法的优越性的焦点的这组包含显著well-associated或anticorrelated基因,但downweighing基因的贡献不联系与他人的方法。定义NRG的分数在我们的研究中是GGI(类似于执行25]: 在哪里我代表necroptosis-associated基因的水平。

2.9。免疫反应的量化预测:Immunophenoscore (IPS)

ip是一个验证因素由Charoentong et al .,预测响应anti-CTLA-4或anti-PD-1疗法,因为它量化免疫原性肿瘤和免疫景观特征的决定因素在肿瘤和癌症anti-genome [26]。估计算法,使用不同的转录模式来推断肿瘤纯洁和多孔性,用于确定基质/免疫分数预测基质/免疫细胞的浸润程度(27]。肿瘤组织具有显著的免疫细胞渗透意味着更高的IPS和纯度较低的肿瘤。

2.10。统计分析

R以下4.4.1软件应用统计分析在这项研究。斯皮尔曼和距离的相关性分析申请获得两个变量的相关系数。单向方差分析和克鲁斯卡尔-沃利斯测试是用来评估在三组的差异(28]。的最佳分界点为每个组,使用survminer R包,被确定基于NRG评分之间的关系和病人的生存。此外,我们利用surv-cutpoint“生存”的函数包重复地检查所有截止点识别的最大秩统计,帮助二分NRG的分数,和明年分离患者CM分成高低NRG分数组。使用kaplan meier方法,存活曲线是描述进行预后分析,和log-rank测试用于检查的意义变化。此外,独立prognosis-related因素由多变量Cox回归。患者选择完整的临床信息进行更全面的多元预后分析。临床病理的特点包括RIPK3表达式与CM的总体生存TCGA个人使用Cox回归分析。此外,多元预后分析的数据NRG得分在CM组使用森林情节R程序可视化。所有的统计值是双边值< 0.05被认为重要的统计。

3所示。结果

3.1。景观在皮肤黑色素瘤Necroptosis-Related基因的遗传变异

最后,在本研究共有67 necroptosis-related基因被确定。我们首先总结了拷贝数变异的发生率(CNVs)和67 necroptosis-related基因在CM的体细胞突变。467个样本中,359表现出necroptosis-related基因的突变,频率为76.87%。得分最高的20个基因,突变的比例最高,在图所示1 (b)。值得注意的是,BRAF突变频率最高,其次是HDAC9;然而,在CM中没有观察到11 necroptosis-related突变基因样本,包括IDH2 MPG, STUB1, ID1、TNF, BNIP3, SLC39A7, SIRT2,暗黑破坏神,SIRT3和IPMK。我们调查的差异这些基因突变与正常样本的水平去理解这些突变的影响necroptosis-related基因的表达水平。统计上显著的结果补充图所示2。CNV的频率变更调查显示显著的CNV改变67年18监管机构。FADD的拷贝数放大频率,叔,BRAF, RIPK1, MYC, IDH2, TNF, SLC39A7, TRAF2, HDAC9,和SPATA2高于删除频率,而HSPA4 MYCN, ITPK1, CYLD, BACH2, CDKN2A, HSP90AA1显示更重要的CNV频率比放大(图删除1 (c))。了解突变影响necroptotic监管者的细节,我们标志着CNV的网站改变染色体图1 (d)。此外,CM样本可能完全分化与正常样本根据水平相关的67个基因necroptosis(图1 (e))。necroptosis-related基因与肿瘤样本和健康之间的微分表达式或tumor-adjacent图所示1 (f)(logFC > 0.6, )。此外,免疫组织化学染色图像的一些代表necroptosis-related基因在正常和CM组织图所示1 (g)。显著表达差异在这些基因已经被观察到的组织和正常组织之间的厘米,这是按照以前的生物信息学分析的结果。显然,necroptotic监管机构的表情显然不是CNV相关变更。因此,上面显示的遗传变异可能不是关键因素差异表达necroptotic监管因素。

我们使用了单变量Cox回归分析来确定的预后价值67 necroptosis-related基因,这些基因necroptosis-related与预后价值图所示1 (h)。结果显示,大多数基因都有利的CM病人的预后因素,而PLK1 (HR = 1.225,值= 0.003),HSPA4 (HR = 1.215,值= 0.041),USP22 (HR = 1.204,值= 0.045),TSC1 (HR = 1.297,值= 0.016)与负面影响有关的生存患者CM。此外,综合景观necroptosis-related基因之间的相互作用与预后价值,以及各自的预后预测价值厘米的情况下,分析了使用网络的necroptosis-related基因(图1(我))。结果显示,绝大多数之间的正相关性观察necroptosis-related基因与预后价值,而USP22展品与TNF负相关性,RIPK3, FASLG, MLKL, ZBP1和CD40。此外,影响necroptotic感应通过促进刺激器的表达可能是有限的由于明显的诱导和抑制之间的正相关性。

总之,上述结果表明,转录组和基因组景观necroptosis-associated厘米之间的基因组织和tumor-adjacent组织或正常组织高度异构,表明necroptosis-related基因可能对CM的发生和发展有至关重要的影响。

3.2。RIPK3表达显著相关的免疫微环境

越来越多的证据显示强大的抗肿瘤免疫和necroptosis之间的相关性。肿瘤细胞经历necroptosis已被证明是与免疫系统的激活密切相关。因此,我们进一步探讨之间的关系necroptosis-related基因表达模式的渗透CM组织的免疫细胞。结果显示necroptosis-related基因的表达水平与免疫细胞的浸润程度密切相关厘米组织(图2(一个))。一些necroptosis-related基因,如USP22、TSC1 PLK1,和HSPA4显著各种免疫细胞的浸润程度成负相关。这些基因也决定风险因素和不良预后相关。同时,RIPK3显著正相关,大多数免疫细胞的浸润程度。RIPK3也被确定为有利因素和与更有利的临床结果(图相关联2 (e))。多变量COX回归分析表明RIPK3黑色素瘤是一个独立的预后因素,以及患者的年龄( ),与T阶段( ),和N阶段( )(图2 (f))。此外,我们选择RIPK3, necroptosis广泛使用的标志,作为一个例子来进一步阐明这些免疫功能的关系与necroptosis-related基因。如数据所示2 (b)- - - - - -2 (d),观察到显著的正相关性之间的表达式RIPK3程度和水平的各种CD8 + T细胞,如CD8 +幼稚T细胞、CD8 +效应记忆T细胞,CD8 +中央记忆T细胞。上面的结果已经被验证使用各种算法,包括CIBERSORT,史诗,伊势亚,MCPCOUNTER CIBERSORT-ABS, QUANTISEQ(补充图3a e)。先前的研究已经表明RIPK3可以推动炎症趋化因子和细胞因子的分泌,从而激活细胞毒性T淋巴细胞,在细胞死亡的过程中(29日]。进一步检测免疫渗透RIPK3相关的差异表达。RIPK3表达式的中值被用来分类个人分成两组(高和低RIPK3组)。在免疫细胞浸润显著差异水平,关键的几种途径,受体分子的表达水平,免疫检查站已经观察(补充图3F-H)。从上面,我们可以推测,RIPK3-mediated necroptosis肿瘤细胞可能促进各种tumor-killing激活免疫细胞,增强免疫细胞浸润在肿瘤组织中,从而提高瘤内抗肿瘤免疫反应。此外,这些结果与之前的研究一致,提供了更多的证据的碎片RIPK3作为小说的潜在能力目标在黑色素瘤,特别是在加强“热”肿瘤表型和改善现有的免疫疗法的功效。

3.3。Necroptotic亚型的识别

进一步探索的潜在的生物学特性不同的表达模式necroptosis-related基因在CM中,本研究将病例分为不同的基于67年的水平necroptosis-related necroptotic亚型的基因。共有686个肿瘤样本的临床数据和操作系统信息配置文件可用基于meta-cohort (GSE65904;的癌症基因组图谱(TCGA) -SKCM)参与分析。使用R的ConsensusClusterPlus包软件,进行无监督聚类分析把患者CM分成三个独立的子类型显著差异(补充图生存1)。根据预后分析,necroptosis集群中显示一个特别明显的生存优势三个不同necroptosis集群,集群而necroptosis C最糟糕的预后(图3(一个))。此外,PCA展示了三种不同的necroptosis集群之间的明显差异相对于67年的转录概况necroptosis-related基因(图3 (b))。根据热图分析,67 necroptosis-related基因的表达水平集群necroptosis C个人的价格相比明显降低患者necroptosis集群和集群necroptosis B(图3 (c))。

3.4。免疫不同Necroptosis集群的景观和功能注释

探讨三种不同necroptosis集群之间的生物学特性,我们执行GSVA富集分析。与necroptosis集群相比,B和C, necroptosis集群信号通路的呈现显著的浓缩,与免疫激活和细胞凋亡有关,包括B细胞受体信号通路,T细胞受体信号通路,toll样受体信号通路,趋化因子信号通路,cytokine-cytokine受体信号通路相互作用,表明necroptosis集群施加强大的免疫活动,这是与预后分析的结果(数据一致3 (d)和3 (e))。necroptosis集群的强大的免疫功能可能是一个合理的解释,发现相关性necroptosis-related基因的高表达与更好的生存。

进一步调查necroptotic基因的表达模式之间的关系和免疫功能,免疫细胞的组件在时间中三necroptotic亚型进行了分析。ssGSEA分析,正如所料,显示各种免疫细胞浸润显著富集在necroptosis集群,包括CD4 + T细胞,MDSC,巨噬细胞,激活B细胞,肥大细胞,γδT细胞,嗜酸性粒细胞,CD8 + T细胞和自然杀伤细胞(图3 (f)),而B necroptosis集群被全面压制免疫功能的区分。我们进一步评估的比例不同亚型的免疫细胞浸润的CM基于“CIBERSORT”方法。结果还显示更高水平的免疫效应细胞necroptosis集群,包括M1巨噬细胞和记忆CD4 + T细胞和CD8 + T细胞激活,这是符合上述分析ssGSEA(图3 (g))。身上的构成也评估通过可靠的估计算法。此外,我们计算了基质/免疫成绩来验证基质/免疫细胞的渗透程度。结果表明,集群免疫得分最高的显示和基质得分最高,而集群B免疫得分最低,显示和集群(图C基质最低分数3 (g))。此外,我们评估了几种重要基因的表达与免疫相关的检查点,包括CTLA-4 PD-L1, LAG3, PAF1, PD-1, CD80、CD86和每个necroptosis TNFRSF9集群。necroptosis集群中的一个,这些基因的表达除了PAF1明显高于necroptosis集群C或集群B(图3 (h))。

总之,necroptosis-related基因的表达模式与免疫功能密切相关。显著差异被发现在三个不同的necroptotic亚型之间的免疫状态。Necroptosis集群高67 necroptosis-related基因的表达显示更强的免疫功能以及更好的生存。

3.5。建设Necroptosis-Related基因签名和Necroptotic基因亚型的识别

为了揭开每个necroptosis集群的潜在生物学特性,与Limma包、微分分析基因表达在三个necroptosis集群进行识别转录组的区分,最终确定1242年重叠(度)相关的差异表达基因necroptosis(图4(一))。然后,我们利用clusterProfiler包执行KEGG浓缩为这些度分析。正如预期的那样,这些度显著富集在生物过程与necroptosis和免疫功能,包括淋巴细胞分化、T细胞分化和T细胞活化,再次确认necroptosis-related基因的表达模式发挥了至关重要的作用在免疫调制时间(数字4 (b)和4 (c))。接下来,上面的重叠度是用来进行生存分析对每个基因通过单变量Cox回归。527度与预后相关的标识( ),这完全构成necroptosis-related基因签名。更好的验证上述监管机制,我们执行这些necroptotic签名的无监督聚类基因中发现三个necroptosis集群,GSE65904和TCGA-SKCM群体划分为不同基因亚型(补充图1)。符合necroptotic亚型,三个不同的基因表型是公认的通过无监督聚类算法,称为基因簇,B和C,连带。这些预后度基于基因的转录组概要集群被表示为一个热图(图4 (d))。

三个基因簇的预后特征进行调查和预后组合信息。总体而言,266年的300厘米的患者聚集在基因簇,表明更好的生存结果,而病人基因簇C(159名患者)是观察与贫穷紧密相关的结果。此外,257厘米的患者属于基因簇与中间预后(图B4 (e))。此外,免疫细胞浸润时间的风景一直在调查三个基因簇使用“CIBERSORT”和“ssGSEA”方法(数据4 (f)和4 (g))。我们发现基因簇免疫分数和基质显著高于成绩与其他基因集群和它相比呈现最高激活CD4 + CD8 + T细胞,激活记忆T细胞浸润。如图4 (g),B基因簇,免疫分数低得多,被显著immunosuppression-related M2巨噬细胞浸润为特征。此外,我们还研究了一些重要的表达免疫checkpoint-relevant基因的三个基因簇解开生物行为在不同的基因簇,显示明显的差异。基因簇免疫检查站与更高的表达基因,而较低的基因表达水平观察基因簇B和C(图4 (h))。总之,预后之间的相关性的概要文件和免疫概要文件在不同的基因簇表明排序方案是合理和科学。

3.6。建立Necroptosis-Related基因的分数(NRG分数)和NRG分数和时间之间的联系

necroptosis的过程是复杂和异构的不同个体。获得定量预测necroptosis-related基因的表达模式在个别患者厘米,基于上述necroptosis-related基因签名,我们开发了评分系统量化necroptosis-associated基因的表达模式与CM的个人,叫做NRG得分。详细的建设性的NRG得分的过程提供了部分的方法。进一步探索NRG评分的特点,我们分类患者CM低或高NRG分数组最优截断值确定使用survminer的包。冲积图表示属性不同模式的改变。如图所示,大多数患者在B基因簇和几乎所有个人属于C基因簇对应于高NRG得分。相比之下,大多数病人从属于较低的基因簇NRG分数组。此外,necroptotic亚型与集群相关基因(图一致5(一个))。克鲁斯卡尔-沃利斯检验进一步揭示NRG的显著差异分数在不同的基因簇和necroptosis集群(数字5 (b)和5 (c))。平均得分最低的是相关的基因簇,而基因簇C与不同集群之间的平均得分最高,表明NRG得分与免疫功能可能是负相关。分数越高可能表明免疫抑制,而低分可能与免疫激活有关。接下来,ssGSEA分析表明显著更高程度的免疫细胞浸润的多数低NRG分数组,包括高渗透水平的激活树突状细胞,MDSC, CD8 + T细胞激活,激活B细胞,活化的CD4 + T细胞、NK细胞(图5 (d))。此外,随后的分析进一步表明,NRG得分显著负相关的各种免疫细胞的渗透程度,包括CD4 T细胞、B细胞、激活和CD8 T细胞,这进一步证实了上述假设(图5 (e))。此外,我们计算了水平的几个重要的基因免疫检查点,包括CTLA-4 PAF1, CD80、PD-L1, LAG3, CD86, PD-1, TNFRSF9,连同表达式与免疫相关的签名活动,如CXCL9、TNF, PRF1, GZMB, CXCL10, IFNG, GZMA CD8A, TBX2。有趣的是,Wilcoxon测试显示最相关的关键基因免疫检查站和激活免疫功能显著调节低NRG分数组,除了TBX2(数字5 (f)和5 (g))。此外,GSEA表明细胞凋亡信号通路相关的几种途径和低NRG分数组升高,如T细胞受体和toll样受体信号通路,NK细胞介导细胞毒性通路,和B细胞受体信号通路(图5 (h))。此外,在条款,NRG得分较低组仍以necroptosis-related生物过程的激活和浓缩等immune-associated通路的B细胞增殖,对肿瘤细胞的免疫反应,和NK细胞活化,进一步坚定表示,较低的NRG分数可能意味着更多活跃的免疫功能和更强的比高necroptosis NRG分数组(图5(我))。

3.7。NRG的预后能力得分

NRG的后续分析评估值评分在预测患者CM的结果。结果显示,那些低NRG分数显示相当大的生存优势NRG分数高集团(值小于(图0.001)6(一))。此外,NRG的预后价值得分进一步验证基于CM (GSE19234)患者的另一个独立的数据集。正如所料,属于低分组患者的生存也优于高分集团(值小于(图0.001)6 (b))。此外,进一步探索NRG评分在预测的准确性黑色素瘤的预后个人,中华民国TCGA NRG分数曲线绘制在队列和与其他出版模式。如图6 (c),合并后的ROC曲线表明,AUC NRG得分为0.651分,这是优于其他的模型,这表明NRG得分相对准确的预测能力。此外,本研究也探讨NRG的分数是否CM个体预后的独立预测指标。基于多变量Cox回归模型分析,预测能力的NRG分数显示是独立于患者性( )、年龄( ),或者ACJJ T阶段( ),表明该评分系统可以发挥其作为一个独立的预测效果,可靠和有效的生物标志物(数字6 (d)- - - - - -6(我))。

许多研究表明,肿瘤突变负担(三甲)可能会影响结果的CM病人和应对银行独立委员会(30.,31日]。增加三甲总是关联到一个更好的免疫治疗效果和延长无进展生存32]。考虑到三甲的突出的临床意义、功能之间的关系NRG分数和三甲了破译不同免疫的基因签名集群。首先,基于设置点的三甲,被分为不同的亚型患者厘米,我们观察到病人属于高三甲组表示一个更好的预后与三甲较低的个体相比,如补充图所示4,这是与以往的研究一致33]。接下来,我们将三甲的个体与低NRG分数和高NRG分数组。然而,无统计差异在三甲之间的低和高集团(补充图4)。使用分层生存分析,我们目前的工作进一步表明,预测基于NRG分数没有影响三甲的状态。无论在低或高三甲子组,观察预后显著变化之间的高、低NRG分数组(图6 (j))。总而言之,上述结果进一步证明了NRG分数是一个独立的预测,可以有效地评估患者CM的结果。

3.8。NRG的影响分数预测免疫治疗的好处

尽管银行独立委员会已经取得令世人瞩目的成果与前所未有的增加癌症治疗患者生存,不幸的是,只有一小部分厘米个人可以受益于持久的反应,而大多数病人经验几乎没有临床益处。NRG分数的影响评估CM的反应患者请在后续的验证分析。基于immunophenoscore Charoentong等人开发的预测反应免疫疗法(26),我们发现anti-PD-1免疫疗法单独或结合anti-PD-1 anti-CTLA-4免疫疗法,和immunophenoscore总是低NRG分数组高于高NRG分数组TCGA-SKCM队列,表明患者属于这个组织可以受益于这两种免疫疗法(数字7(一)和7 (b))。进一步验证这种猜测,我们使用另一个独立的数据集组成的CM接受免疫治疗的病人(GSE91061)探索NRG分数的预测效果免疫治疗的好处。结果表明NRG分值较低的个体表现出长期生存与高分患者相比(图7 (c))。令人惊讶的是,进一步的分析表明,在这种免疫治疗组,所有患者的临床反应,包括部分响应(PR) /完全缓解(CR),属于低NRG分数组,表明NRG分数非常敏感(图在预测免疫治疗的好处7 (d))。强劲总的来说,这些发现表明,NRG的分数可以作为免疫治疗和预后的生物标志物,从而评估免疫治疗的反应。

4所示。讨论

免疫疗法的象征,银行独立委员会带来了革命性的进步领域的癌症治疗,导致病人生存(空前增加7,34]。到目前为止,美国食品和药物管理局已批准艾多酷针对三种不同的分子(CTLA-4 PD-1,及其配体,PD-L1)用于人类,病人的预后改善厘米(35,36]。然而,银行独立委员会的一个明显的局限性疗法只不过是一个小比例的CM个人实现持久的反应从这个治疗,而多数将经验几乎没有临床益处,这还远远没有满足临床需求(37]。因此,它是非常必要的适当的个人认同厘米的免疫疗法的候选人。

增加碎片的证据表明necroptosis,一个新形式的程序性细胞死亡,对炎症具有至关重要的影响,抗肿瘤反应,和抗肿瘤免疫反应,涉及免疫系统激活,包括抗原表达和CD8 + T细胞cross-priming时间(38,39]。此外,可能的协同效应之间的感应necroptosis观察到在时间和ICB促进持久的抗肿瘤免疫力,进一步支持necroptotic过程之间的密切相关性和肿瘤的免疫反应。因此,necroptosis可能是一个潜在的免疫治疗目标和necroptosis-related基因的表达模式可能作为有效的预测患者的预后厘米和免疫治疗的反应。然而,免疫渗透的综合特征景观中不同的表达模式与necroptosis-associated基因的表达不认识一般。

在这项研究中,67个necroptosis-related基因的基础上,我们确定了三种不同necroptotic表达模式特征有明显差异的免疫细胞的渗透时间和患者的生存。热图分析显示,大多数necroptosis-related基因的表达水平在集群的一个重要的生存优势明显高于在集群C最糟糕的预后。在三种不同的模式,necroptosis集群特色的几种途径激活和高水平的免疫细胞浸润,包括激活B细胞、CD8 T细胞、NK细胞、CD4 T细胞,激活DC细胞,这表明免疫细胞浸润的程度与个体生存时间显著正相关。这些发现与之前的研究一致40,41),这也可能是一个合理的解释,发现相关性necroptosis-related基因的表达与患者的预后。

随后的分析表明,不同的三个不同的表达模式之间的信使rna转录组necroptosis-related基因密切相关necroptotic生物过程和几种生物通路。特别是,1242度三个亚型之间的重叠使用Limma定义包的R软件和KEGG去分析显示,这些基因主要富集在necroptosis-related生物过程和NFκB信号通路,这是最重要的一个necroptotic信号通路(42]。此外,浓缩的这些基因在免疫细胞生物学途径也观察到,包括T细胞的活化和分化,淋巴细胞分化,PD-L1表达式和PD-1检查点信号通路,进一步表明necroptosis之间的密切相关性和抗肿瘤免疫力。然后,527度明显预后价值终于被生存分析对每个基因的单变量Cox回归模型,一起构成necroptosis-related基因签名。符合基于necroptosis-related基因的聚类分析(necroptosis集群A、B和C),我们发现三个基因簇(基因集群A、B和C)根据选定necroptotic签名基因,显示预后显著差异和时间特性。进一步分析表明,基因集群与著名的生存优势基质分数和免疫分数最高,以及高免疫细胞的渗透时间,建议一个immunoactivated表型。巨噬细胞的渗透度M1,有趣的是,当观察到集群,显著高与其它亚型相比,而M2巨噬细胞的浸润的程度最低。M2巨噬细胞可以分泌多种免疫抑制细胞因子,促进肿瘤进展和转移,与不良预后相关(43]。此外,作为免疫治疗的目标,一些至关重要的免疫检查点的表达水平也调查了在三个基因簇。基因簇表达水平更高的相关免疫检查点,而预后最差的C基因簇表达水平最低。这些结果有力证明的重要性,全面评估necroptosis-related基因的表达模式,从而更好地理解的描述时间和可能有助于估计响应CM患者的免疫治疗和预后。

有必要建立评分系统量化necroptosis-related基因的表达模式在个别患者厘米,考虑个体异质性necroptotic模式。基于上述necroptotic签名基因,本研究构建了一个得分模式称为NRG的分数。随后GSEA证明了细胞凋亡信号通路相关的几种途径和低NRG分数组升高,如T细胞受体信号通路,B细胞受体信号通路,NK细胞介导细胞毒性通路。此外,在术语中,一个低NRG分数仍以激活necroptosis-related生物过程的浓缩的几种途径如B细胞增殖、免疫反应肿瘤细胞,NK细胞活化。此外,各种免疫细胞的渗透度时间的低NRG分数组更高比NRG分数组高,所有这些都进一步表明,较低的NRG分数可能意味着更积极的免疫功能和更强的necroptosis,相比高NRG分数组。

基于队列TCGA-SKCM和GSE65904组成的,我们进一步评估NRG分数的值作为预后预测指标。结果显示,NRG分值较低的个体显示比高分患者长期生存。此外,上述结论再次验证基于另一个独立的CM数据集(GSE19234),坚定表明NRG分数可能作为有效的CM病人预后标记。此外,我们探讨这个评分系统的预测能力厘米患者的免疫治疗的好处。Wilcoxon测试显示所有与免疫相关的关键基因检查站调节低NRG分数组,如CTLA-4 PAF1, CD80、PD-L1, LAG3, CD86 PD-1, TNFRSF9。基于immunophenoscore评估反应免疫疗法由Charoentong et al。26),我们表明,患者CM NRG得分较低可以受益于anti-PD-1或者anti-CTLA-4和anti-PD-1免疫疗法。此外,使用一个独立的免疫治疗组(GSE91061)组成的CM个人接受免疫治疗,我们再次验证NRG的预测能力得分厘米患者免疫治疗的好处。结果表明,较低的个体NRG分数显示一个更长期的生存与高分患者相比。令人惊讶的是,所有患者的临床反应,包括完全缓解(CR) /部分反应(PR),属于低NRG分数集团强劲验证,NRG的分数是一个极其敏感的免疫治疗效益预测指标。因此,NRG的分数可以作为一个独立的免疫治疗和预后指标,从而促进适当的候选免疫疗法的识别和制定个性化的治疗方法。

然而,我们应该注意到,这些结果是基于TCGA和地理公共数据库和缺乏生物验证。我们当前厘米的情况下是非常有限的,远远不够用来进行临床characteristic-related分析。此外,根据上面的分析,我们认为,necroptosis-related基因与免疫功能的关系和潜在necroptotic刺激器促进抗肿瘤免疫机制确实是一个有趣的和有前途的研究。我们将付出更多努力在临床样本收集和跟进,试图说明底层机制在未来的研究。

5。结论

我们目前的工作显示之间的密切相关性necroptosis-related基因的表达模式和肿瘤免疫微环境。评分系统,NRG得分,建立了综合评估necroptosis-related基因表达模式和肿瘤免疫微环境的特征与CM的个人,提供一个基础的确定肿瘤immunophenotype和有效的临床实践。此外,NRG分数已被证明作为一个潜在的指标进行独立评估厘米个人的预测和有效地估计响应与CM的个体免疫疗法,已进一步验证,分别在我们的研究基于其他独立的数据集。最后,评估个体肿瘤的necroptosis-related基因的表达模式可能有助于加强我们的理解肿瘤免疫微环境的综合特征和免疫治疗提供有价值的见解。

数据可用性

支持本研究使用的数据都包含在这篇文章。

信息披露

冬冬,魏王,恒王co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

冬冬和魏王写的手稿,开发的软件,和概念化,可视化,调查研究。恒王写了初稿,调查研究,提供资源,参与形式分析。梁陈写的审查和编辑了手稿,提供资源和概念化的研究。天翼刘写、检讨,并修改了手稿,提供资源,管理项目,监督的研究,并获得了资助。王董D, W,王H本研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项研究由医疗指导项目上海市科学技术委员会(19411962300)和特殊的临床研究项目健康委员会上海市(201940400)。

补充材料

补充图1。筛选基因的共识矩阵。(一)- 67 (D)一致矩阵necroptosis-related基因的预后价值k通过1000次迭代,显示稳定的聚类分层聚类(k= 2 - 5)。(E) -矩阵(H)共识necroptosis-related基因签名k通过1000次迭代,显示稳定的聚类(k= 2 - 5)。补充图2。necroptotic基因的表达差异突变体与正常样本。(一)——(Y) necroptotic基因表达之间的差异necroptotic野生基因和基因突变组。四分位范围数据表示的上部和下部的盒子。盒子的黑点表示异常值,而线框表示中位数。”“是明显价值。补充图3。不同免疫景观高低RIPK3表达式组。(一)——(E)使用各种算法,包括QUANTISEQ CIBERSORT, CIBERSORT-ABS,史诗,MCPCOUNTER,验证明显的积极关系的水平RIPK3水平渗透的CD8 + T细胞。(F) - (H)免疫cell-infiltrating差异水平,相关的几种途径,受体分子的表达水平,免疫检查点之间的高、低RIPK3表达式组。补充图4。协会的NRG得分与肿瘤突变的负担。(A)、(B)瀑布图表明三甲构建基于得分高低NRG的病人。(C)生存分析患者的低和高三甲。(D)散点图表明,三甲的NRG的分数是不相关的。 (E) The difference in TMB in the low and high NRG score groups.(补充材料)