文摘
背景。作为最常见的肝脏恶性肿瘤,肝细胞癌(HCC)发生率高;因此,在本文中,生物标记物的免疫相关基因寻找肝癌。方法。在这项研究中,一个微分表达式分析lncRNA mRNA在癌症基因组图谱(TCGA)数据集之间的肝细胞癌组和正常对照组。富集分析被用来屏幕的几种差异表达基因。Cox回归分析和生存分析是用来确定肝癌预后的基因,其表达是由分子检测实验。最后,重要的免疫细胞被免疫细胞浸润和流式细胞仪探测到。结果。1613年与正常组相比,差异表达的差异表达lncRNAs mrna (DEmRs)和1237 (DElncRs)在肝细胞癌中被发现。其中,143年的几种DEmRs 39的几种DElncRs筛选出来。这些基因主要是与MAPK级联、PI3K-AKT信号通路,及护。通过Cox回归分析和生存分析、MMP9 SPP1, HAGLR, LINC02202, rp11 - 598 f7.3终于决定作为肝癌的潜在诊断生物标记。基因表达是经由RT-qPCR和免疫印迹。此外,CD4 + T细胞记忆休息和CD8 + T细胞识别作为肝癌的总体生存的保护性因素,他们发现通过流式细胞术HCC中高度表达。结论。研究探讨了几种基因的失调机制和潜在的生物标记物,进一步确定了免疫细胞对肝细胞癌的预后的影响,为预后预测提供理论基础和肝细胞癌患者的免疫治疗。
1。介绍
肝细胞癌(HCC),主要在肝细胞肝癌,是一个普遍的健康问题,最常见的一种恶性肿瘤(1]。据2018年统计,HCC排名第六世界上发病率和死亡率第四,约有840 000例新病例和每年780多000人死亡2]。尽管肝癌患者总生存期(OS)的速度提高了由于外科技术的进步,即。,5年生存率是18%,它仍然很低3]。大多数肝癌晚期患者在治疗后复发和转移率高,这可能是预后不良的原因之一(4]。可怜的临床结果势在必行,我们对HCC的理解应该改进和早期诊断和治疗方法。
肝癌的发生是一个复杂的过程,涉及多个风险因素,主要感染乙肝和丙肝肝硬化,过度饮酒、肥胖、脂肪肝、黄曲霉毒素、糖尿病(5]。众所周知,肝癌细胞非常抵抗几乎所有传统的化疗;因此,到目前为止,只有数量有限的化学疗法可以用于治疗肝细胞癌患者6,7]。即使在手术切除或消融,70%的患者在5年内仍有肿瘤复发(8]。一旦肿瘤发展到后期,目前药物治疗只能产生一个小的生存利益,不符合成本效益(9]。事实上,大多数病人发展成一种无法治愈的晚期之前发现。因此,早期发现和预防肝癌是最有效的发展战略,改善患者的预后。
的确切分子机制的启动和发展肝癌仍不清楚;然而,众所周知,肝癌的发生和发展与肝内肿瘤微环境(时间)10]。肝癌肿瘤微环境是一个动态的系统由肿瘤细胞、细胞因子复杂的环境中,细胞外基质,免疫细胞亚群等。11]。在这个复杂的网络,许多免疫抑制机制,包括免疫抑制细胞的聚集、抗原表达,和激活多种信号通路支持免疫耐受和促进肝癌的进展(12,13]。肝细胞癌免疫治疗是目前的研究热点(14]。
长非编码RNA (lncRNAs) RNA分子长度超过200个基点(15),它可以调节基因的表达和蛋白质合成在许多方面16]。lncRNAs扮演重要的角色在人类肿瘤的发病机理和发展,包括肝癌(17)在肝细胞癌扩散的规定,涉及凋亡迁移,肿瘤生成和转移(18]。lncRNAs分为两类:一是促进癌症,另一种是抑制肿瘤的发展,这两个是同样重要的是在癌症治疗19]。
和其他固体癌症一样,大量的基因改变积累在肝癌的发展。因此,本研究筛选差异表达的基因免疫相关肝细胞癌与对照组进行比较,找到潜在的诊断标志物。差异表达基因在肝细胞癌的分子机制通过生物信息学被发现。
2。材料和方法
2.1。数据收集和差异分析
基因表达谱收集从374年50正常和肿瘤肝组织的癌症基因组图谱(TCGA)数据库,包括mRNA和lncRNA表达谱。DESeq R软件包用于正常基因的表达水平。mRNA表达的不同和差异表达lncRNA肝癌与正常样本分析使用DESeq R软件包。| log2(褶皱变化)| > 2P值< 0.05被认为是显著性差异。
GSE149614获得基因表达综合(GEO)数据库,其中包括192个滑膜成纤维细胞的基因表达谱10 HCC患者和8没有ntumor肝脏样本通过单细胞RNA-seq基于GPL24676 (scRNA-seq)。
2.2。免疫相关基因的识别
筛选出了几种DEmRs是相交的几种mrna与DEmRs ImmPort数据库,和几种DElncRs筛选由相交的几种lncRNAs DElncRs ImmLnc数据库中。
2.3。蛋白质相互作用网络(PPI)
几种DEmRs被放入搜索工具相互作用的基因(STRING)检索的数据库(https://string-db.org.uk/分数> 0.7),其交互是筛选构建PPI网络,然后使用Gephi可视化软件。PPI网络导入Cytoscape软件识别中心基因网络的筛选基因之间的联系程度。
2.4。生物功能分析
上述ImmPort数据库被用来进行生物过程(BP)分析基因本体论(去)和KEGG通路富集分析几种DEmRs。KEGG通路的分析了几种lncRNAs ImmLnc数据库。P值< 0.05用作截止条件。
2.5。对中心基因在肝细胞癌的临床意义
操作系统分析与生存R软件包。Cox回归分析用于识别的影响关键基因在肝细胞癌患者的预后。的接受者操作特征(ROC)曲线下的面积被用来评估潜在的诊断精度选择的异常表达的基因。
2.6。处理scRNA-Seq数据
GSE149614,过滤标准是300 < nFeature_RNA < 3000和百分比。无监督聚类的可视化进行了使用t-distributed随机邻居嵌入(tSNE)方法。不同的细胞群被单一的包带注释的。
2.7。主题
共有十名肝癌和十名正常全血样品和肝组织样本从患者获得承认新疆医科大学第一附属医院。患者签署知情同意。这个研究是医学伦理委员会批准的新疆医科大学第一附属医院(没有。K202010-06)。
2.8。RNA提取和RT-qPCR
组织样本的总RNA提取了试剂盒(豆类,大连,中国)肝细胞癌和正常组织和相对地转录成互补DNA(互补)使用PrimeScript RT试剂盒(豆类、大连、中国)根据制造商的协议。实时定量PCR (RT-qPCR)进行使用SYBR GreenPCR工具包(美国马萨诸塞州热费希尔科学)。基因的表达规范化GAPDH和计算使用2−ΔΔCt方法。本研究的引物如表所示1。
2.9。免疫印迹
中心mrna的蛋白质表达水平验证使用免疫印迹(WB)方法。肝脏组织样本细胞溶解在冰里帕缓冲区的存在。蛋白质是用BCA量化蛋白质分析工具包(Beyotime、上海、中国)和sds - page和随后转移到PVDF膜分离,一夜之间被孵化的主要抗体(Abcam,麻萨诸塞州,美国)。与二次孵化后抗体(Abcam,麻萨诸塞州,美国),蛋白质乐队可视化使用化学成像(Vilber Lourmat,法国)。GAPDH作为内部参考蛋白质。
2.10。流式细胞术
淋巴细胞分离的解决方案(TBD,天津,中国)被用来从血液样本中提取淋巴细胞。细胞与anti-CD4-FITC surface-labeled(美国加州BD) anti-CD8-PE抗体(美国加州BD) anti-CD45RO-PE(美国加州BD),或anti-CD38-PC5.5(美国加州BD)在4°C。使用Kaluza v2.1.1软件检测的结果进行了分析。
2.11。统计分析
使用SPSS 21.0软件进行统计分析(IBM、纽约、美国)。测量数据被表示为平均值±标准偏差。团体之间的意义不同的表达式是使用学生进行了测试t以及。immuno-related rna和免疫细胞之间的相关分析测试用皮尔逊相关分析。检验水准α= 0.05,P< 0.05是统计学意义的象征。
3所示。结果
3.1。差异表达基因在肝细胞癌
本研究的流程图如图1。TCGA通过比较不同数据库之间的肝细胞癌和正常对照组,1613个差异表达mrna和1237个差异表达lncRNAs(数字2(一个)和2 (b))获得。1368年调节基因和245个表达下调基因(图2 (c)1129年)被发现在DEmRs调节基因和108个表达下调基因被发现在DElncRs(图2 (d))。
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3.2。免疫细胞差异表达mrna
比较差异表达与免疫相关基因mrna Immport数据库,143年的几种DEmRs(图3(一个))被确定。富集分析表明这些基因主要参与细胞增殖的积极监管、炎性反应,激活MAPK的生物过程(BP)(图3 (b)),还富含KEGG信号通路如细胞因子受体相互作用,PI3K-AKT信号通路,MAPK信号通路(图3 (c))。这些相关的几种DEmRs受到PPI网络分析来识别他们的互动关系(图3 (d)),最大程度的连通性的十大基因网络中筛选和确定为中心mrna (EGF、SST、GCG SAA1,安全系数,CALCA, MMP9, CXCL12, FPR2,和SPP1)(图3 (e))。ROC曲线表明EGF的AUC值,GCG, SAA1,安全系数,MMP9, CXCL12, FPR2, SPP1大于0.6(图3 (f))。
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3.3。识别关键DEmRs
十中心风险评分的基因进行分析,和他们的表达变化与肝细胞癌的预后风险(图有关4(一))。Cox回归分析发现EGF、GCG MMP9, SPP1 HCC的危险因素(图4 (b))。重要的是,低MMP9的表达和SPP1显著提高肝癌的总体生存时间(图4 (c)),其表达在肝癌病人TCGA数据高(图4 (d))。这也证实了RT-qPCR和免疫印迹实验的结果(数据4 (e)和4 (f))。使用免疫组织化学结果从人类蛋白质图谱数据库(https://www.proteinatlas.org/),结果表明,MMP9的表达以及SPP1 HCC患者显著高于控制(图4 (g)和4 (h))。
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此外,根据GSE149614的结果,我们聚集细胞(图33单独的集群5(一个))。通过与临床表型比较,我们发现不同的集群匹配的肝细胞癌或对照组(图5 (b))。有趣的是,我们发现MMP9 SPP1主要是表达了在集群12中,肝癌组(对应数字5 (c)和5 (d))。集群注解为巨噬细胞(图125 (e))。
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3.4。免疫细胞差异表达lncRNAs
此外,通过比较与ImmLnc数据库,39的几种DElncRs(图6(一)),与B细胞,CD4 + T细胞、CD8 + T细胞,树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞相关性和也显著参与KEGG免疫炎症信号通路相关,如鉴定及家庭成员、细胞信号通路,白细胞介素受体(图6 (b))。通过ROC曲线的39 DElncRs 11 DElncRs AUC值大于0.85被确定为中心lncRNAs(图6 (c))。风险评分的结果分析表明,11 DElncRs的表达变化影响肝细胞癌的预后(图6 (d))。Cox回归分析进行11 DElncRs,及其对肝细胞癌的预后影响被列线图(图展示6 (e))。低表达HAND2AS1 FENDRR和高表达LINC02202和HHIPAS1肝癌预后的危险因素。此外,HAGLR LINC02202, rp11 - 598 f7.3对肝癌患者的生存产生重大影响(图6 (f))。
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TCGA的数据库,发现HAGLR和LINC02202调节和rp11 - 598 f7.3表达下调与对照组相比(图7(一))。RT-qPCR实验的结果验证了HAGLR和LINC02202 HCC中高度表达rp11 - 598 f7.3虽然卑微表示(图7 (b))。
(一)
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3.5。在肝细胞癌免疫细胞浸润
进一步确定免疫细胞在肝细胞癌的作用,22免疫细胞的渗透水平进行了分析使用CIBERSORT(图8(一个))。生存分析显示,嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的低表达,高表达的CD4 + T细胞记忆休息和CD8 + T细胞能显著改善肝癌患者(图的操作系统8 (b))。Cox回归分析表明,CD4 + T细胞记忆休息和CD8 + T细胞是肝细胞癌的预后保护性因素(图8 (c))。此外,通过研究嗜酸性粒细胞之间的差异,嗜中性粒细胞,CD4 + T细胞记忆休息,CD8 + T细胞在肝细胞癌患者的血和控制组织通过流式细胞术(图8 (d)),不同级别的内存CD4 + T细胞和CD8 + T细胞之间的肝细胞癌和正常组织被证实。统计结果表明,CD4 +和CD8 + T细胞记忆休息HCC T细胞含量明显高于对照组。
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此外,我们将肝癌样本分成MMP9或SPP1高表达(5样品)和低表达组(5)样品,分别。的内容和CD4 + CD8 + T细胞记忆T细胞在肝癌样本休息与高表达SPP1高于低表达SPP1(图8 (e))。然而,并没有显著的区别的内容CD8 + T细胞和CD4 + T细胞记忆休息肝癌样品高MMP9的表达高于那些低MMP9的表达。相关分析的结果表明,CD8 + T细胞和CD4 + T细胞记忆休息与MMP9呈正相关,SPP1, HAGLR,和LINC02202,有负相关rp11 - 598 f7.3(图S1)。
4所示。讨论
免疫疗法是一种很有前途的,但复杂的治疗策略由于肝脏本身也是一个免疫器官,它可以增强或抑制肿瘤生成的体内的免疫反应20.]。发现约25%的肝癌被归类为“immune-specific阶级”根据基因表达谱(21]。本研究确定了MMP9和SPP1关键DEmRs与肝癌免疫有关。免疫细胞浸润发现差异渗透的CD4 + T细胞记忆休息和CD8 + T细胞可能影响肝细胞癌的预后。MMP9和SPP1 HCC患者的巨噬细胞中高度表达,积极调整CD4 + T细胞记忆休息和CD8 + T细胞。这些结果加强免疫细胞和免疫相关基因之间的关系。
免疫相关基因筛选参与大量的生物功能和信号通路与肝细胞癌的发生和发展有关。细胞增殖和细胞凋亡的分子指标评估肝细胞癌的发展和进展(22,23]。可以调解antigen-dependent肿瘤细胞毒性T细胞受体,通过膜结合Fas配体直接诱导细胞死亡,抑制肿瘤增殖通过分泌IFN-gamma [24]。PD-1 / PD-L1通路还能抑制T细胞的生存和发展在HCC通过抑制T细胞受体信号14]。MAPK级联的几个组件和PI3K-AKT信号通路是承诺的目标在肝细胞癌(25]。最终影响MAPK通路的ERK 1/2,物和p38。ERK 1/2的表达和调节物,导致细胞增殖相关基因的转录,生存、分化和迁移26]。诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,迁移和入侵通过抑制PI3K-AKT通路是治疗肝癌的治疗目标(27,28]。TGF -β也是一种常见的治疗目标治疗肝细胞癌(29日自血清TGF -β水平升高在肝细胞癌患者和一个长期的生物标志物对于肝细胞癌(30.]。一种蛋白激酶信号转导是促进肿瘤形成通过抑制TGF -β全身的细胞凋亡,进而激活Wnt /β连环蛋白的信号,从而进一步促进肝癌的发生(15]。炎症细胞促进肝癌的发生通过释放活性氧,RNS,脂质过氧化反应和异常表达的细胞毒性细胞因子(31日]。不同的促炎因子的复杂的相互作用(如白细胞介素- 6和TNF -α)和抗炎细胞因子(TGF -α和TGF -β)及其信号通路参与肝癌的发生和发展32]。
多变量分析证实的表达基质金属蛋白酶9 (MMP9)是一个独立的预测系统在肝细胞癌(33),这与我们的研究结果是一致的。大量的研究已经证实,肝细胞癌的高MMP9的表达促进增殖,迁移和入侵肝癌细胞(34,35]。MMP9的肿瘤浸润和转移尤为重要,它可以降低ColIV [36]。磷蛋白质分泌1 (SPP1)已被证明是调节在肝细胞癌患者预后较差37]。骨桥蛋白(OPN;基因SPP1)也与肝硬化患癌症的风险38]。它被认为是一个潜在的早期复发和预后不良的标志以及metastasis-related肝癌的基因(39]。
微分表达式HAGLR是调节在肝细胞癌(40,41]。越来越多的证据表明,HAGLR的高表达与临床病理的特点如肿瘤大小、淋巴结转移、分化、TNM阶段,预后[42,43]。LINC02202可以调节PIK3R1和FOXO1基因的表达在PI3K信号通路(44]。rp11 - 598 f7.3被发现与肿瘤的肿瘤分期和组织学分级45]。很少有研究LINC02202之间的直接关系,rp11 - 598 f7.3和肝癌,但我们的研究结果表明,LINC02202和rp11 - 598 f7.3肝癌预后的危险因素。
此外,研究发现,CD4 + T细胞记忆休息和CD8 + T细胞是肝细胞癌的保护性因素。CD8 + T淋巴细胞及CD4 + T细胞记忆显著增加在肝细胞癌(46]。在HCC的淘汰阶段,新兴癌症细胞可以识别和被许多免疫细胞,如CD8 +、CD4 + T细胞(47]。已报告CD4 + T淋巴细胞抑制肝癌的发展以及调节肿瘤回归(48]。增加细胞毒性CD4 + T细胞的比例与强有力的预后无病生存和操作系统(49]。CD8 + T细胞的重要子集与抗肿瘤活性介导T细胞释放细胞毒性分子,在确定临床疗效的作用在许多癌症是显而易见的50]。此外,CD4 + T细胞记忆休息和CD8 + T细胞都增加了肝癌SPP1组的高表达。郑等人发现SPP1的高表达可能参与调节巨噬细胞的极化对M2表型和减少CD8 + T细胞(51]。还有一项研究显示,SPP1可能导致肿瘤恶化通过促进免疫细胞浸润(52]。进一步扩大样本进行临床研究和基本实验还需要验证我们的结果。
因此,HCC患者免疫相关分子疗法的作用是毋庸置疑的,而这项研究的结果可能会提供一个新的方向对肝癌的诊断和治疗。然而,本研究也有一些局限性。我们的分析数据来自公共数据库,使用的样本容量实验验证本研究的重要成果是很小的。随后的细胞培养和动物模型也需要进一步研究肝癌的潜在机制。此外,应用潜力的关键标记识别研究中需要进一步验证。
5。结论
在这项研究中,MMP9、SPP1 HAGLR, LINC02202,和rp11 - 598 f7.3视为潜在的肝细胞癌诊断的生物标志物,CD4 + T细胞记忆休息和CD8 + T细胞被认为是参与肝癌免疫控制。这些结果将为分子水平上提供一个新的视角介入肝癌的研究和治疗。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者声明没有潜在的利益冲突。
确认
这项工作是支持的项目为天山创新研究团队的新疆维吾尔自治区,中国(2020 d14020),中国国家自然科学基金(11961071和11961071),和新疆的自然科学基金(2016 d01c169)。
补充材料
图S1:基因和免疫细胞之间的相关性。红色表示正相关,和蓝色表示负相关。∗∗ ,∗∗∗ 。(补充材料)