文摘

本研究旨在利用生物信息学工具,qPCR,免疫组织化学分析,找出相关因素的早期诊断和预后肾肾透明细胞癌(KIRC)。lncRNA的表达谱,microrna,信使rna KIRC从癌症基因组图谱数据库下载。龙头、监管网络构建是基于这三个差异表达基因之间的相互作用。CIBERSORT反褶积算法被用来分析22的微分分布类型的免疫细胞。屏幕用于kaplan - meier生存和考克斯分析基因的龙头、网络以及相关免疫细胞亚型的临床和预后预测KIRC。Co-expression监管关系被发现在LINC01426、LINC00894 CCNA2, L1细胞粘附分子(L1CAM)和T卵泡辅助细胞,作为潜在的生物标记物。定量反向transcriptase-polymerase连锁反应的结果表明,LINC01426 KIRC调节L1CAM表达下调的时候,但是没有发现差异表达水平LINC00894和CCNA2癌症和相邻样本。免疫组织化学分析表明,T卵泡辅助细胞更集中在KIRC的核心组织和转移。总之,co-expression关系被发现在LINC01426 L1CAM,和T卵泡辅助细胞,它们可以作为生物标志物KIRC的早期诊断和预后评估。

1。介绍

肾脏肾透明细胞癌(KIRC)源于近端小管上皮细胞(1]。这是最常见的和侵略性的亚型肾癌,大约占75% - -80% (2]。大多数病人在晚期诊断因为最初的临床症状和KIRC相对隐蔽的迹象3]。与其它亚型肾癌相比,KIRC高复发率和转移率。虽然手术治疗,分子靶向治疗(索拉非尼和舒尼替),免疫疗法(白介素2),和其他治疗方法近年来发展大大提高了患者的生存时间;5年生存率仍不到10% (4,5]。因此,生物标志物,可以及早发现KIRC并预测其预后需要确认。

Salmena等人在2011年制定一个假设对电抗器;他们认为长非编码rna (lncRNAs)使用一些核心种子吸附相应的microrna的序列,从而干扰目标基因mRNA的丰度和影响基因表达6]。大量的研究表明,电抗器发生中发挥了重要作用,发展和预后的肿瘤(7]。例如,王等人通过实验证明lncRNA UCA1被用作mir - 182 - 5 - p的电抗器,积极规范的表达Delta-like4 (DLL4),从而促进肾肿瘤细胞的恶性表型,发挥致癌作用在肾癌的发病机制8]。人类免疫监测是一个重要的身体的免疫功能,防止肿瘤,和逃避的破坏人体的免疫功能是肿瘤的重要机制之一9,10]。近年来,局部免疫细胞的分布和密度得到了学者们的广泛关注在肿瘤的诊断和预后评估11]。研究显示差异渗透在不同类型的免疫细胞肉瘤(12]。梁等人发现,Janus激酶3 (JAK3)适度强烈与大量的B细胞呈正相关,CD8 + T细胞CD4 + T细胞,中性粒细胞,并在KIRC树突细胞,这可能成为潜在生物标志物KIRC [13]。尽管大量的研究探讨了免疫细胞浸润与肿瘤发生之间的相关性,发展、预后,等等,具体的作用机制在肿瘤尚未清楚地阐明。

这一主题分析的潜在角色龙头、网络和肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤发生KIRC,转移和预后。流程图解释这个过程在图给出1。总之,这项研究可能提供新想法KIRC患者预后的监测和研究新的治疗方法。


图1
流程图描述分析过程。

2。材料和方法

2.1。数据采集和差异表达基因的分析

元数据文件、清单文件,和车文件KIRC转录组和microrna的病人临床信息从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载。购物车解压文件之后,Perl脚本运行获得最初的转录组和microrna的矩阵文件。使用人类基因名字是转换。gtf文件下载从运用数据库和成熟。足总文件从miRBase数据库下载。DESeq2包在R4.0.2软件被用于微分表达式分析得到差异表达lncRNAs, microrna,信使rna((错误发现率,富兰克林·德兰诺·罗斯福)< 0.05,日志(褶皱变化)| | > 2)。

2.2。龙头、建设网络

从miRcode LncRNA-miRNA和miRNA-mRNA交互预测(14和母星15)数据库,分别显示显著结果超几何检验和相关性分析,被选为龙头的可视化网络使用Cytoscape 3.7.2章软件。

2.3。在KIRC临床意义的龙头、网络

单因素Cox回归,套索回归,考克斯和多因素回归分析中所有基因进行电抗器,网络,和风险评分模型是建立为选定的基因。模型的诊断价值是通过风险评估存活曲线和接受者操作特征(ROC)曲线。kaplan meier生存法执行网络中所有基因的生存分析批次。

2.4。丰度分析和微分表达式分析免疫细胞浸润

基因表达特性的22集类型的免疫细胞亚型从CIBERSORT网站下载。基于基因表达谱,e1071包运行得到大量的免疫细胞浸润和统计的准确性( 值)22类型的免疫细胞在每个样本(排列的数量设置为1000)。的样品 被保留,以备后续分析。免疫细胞之间的差异KIRC组织和邻近组织由两个独立样本进行了分析t测试。

2.5。相关分析KIRC浸润免疫细胞的生存

单因素Cox回归,套索回归,并进行了多因素Cox回归分析浸润免疫细胞构建风险评估模型。存活曲线和ROC曲线被吸引到风险评估模型的诊断价值。免疫细胞亚型之间的相关性及临床转移预测使用Wilcoxon rank-sum测试(临床研究的对象都是T TNM分期)。kaplan meier生存方法被用来分析所有免疫细胞的生存与不同的分布。

2.6。Co-expression分析基因的龙头、网络和免疫细胞

电抗器和22之间的关系类型的免疫细胞是调查使用皮尔逊相关系数。

2.7。定量反向Transcriptase-Polymerase连锁反应

定量反向transcriptase-polymerase连锁反应(存在)被用来定量表达的关键基因,电抗器网络。临床组织cDNA芯片购自上海超越生物技术有限公司有限公司芯片批号是cDNA-HKidE030CS01(15例肾透明细胞癌,1的癌症/相邻,RNA的冷冻样本reverse-transcribed cDNA,发现在96孔板,和样本覆盖临床第一阶段,第二阶段,第三阶段。)。lncRNA的相对表达水平和mRNA在癌症和邻近KIRC样品检测使用PerfectStart绿色qPCR SuperMix TransGen生物技术,中国制造商的指示。引物lncRNA和mRNA如表所示1。反应条件在94°C predenaturation 30秒;94°C 5秒,60°C 30秒,40周期;最后,温度降至37°C为20分钟,直到反应完成。TCGA的基因表达谱下载数据库在R统计分析软件(GDCRNATools、ggplot2 DESeq2,生存,glmnet, survminer)。分析了存在2的结果−△△Ct和独立t测试在IBM SPSS 25.0统计。

表1
引物lncRNA和信使rna。
2.8。在临床组织免疫组织化学

临床组织芯片是购自上海超越生物技术有限公司有限公司芯片批号是KidE085CS01(26例肾透明细胞癌,癌/邻/远端一个地方,和7转移,一个站点/转移,和样品覆盖临床第一阶段,第二阶段,第三阶段),免疫组织化学染色(包含IHC)进行使用徕卡BOND-MAX auto-stainer(徕卡仪器有限公司,德国),和CD4 (EP204)兔马伯(48274年,细胞信号技术,中国)稀释至1:200。CD4 T卵泡辅助细胞的标记,分别为(16]。包含IHC进行如下。简单地说,4μ米厚的组织切片机部分被削减,deparaffinized在二甲苯中,通过分级脱水乙醇(100%和95%),用水冲洗。随后,部分受到燥热引起抗原检索和最后装上基准auto-stainer,和检测使用债券聚合物进行完善检测设备(徕卡仪器有限公司)。

2.9。数字病理免疫组织化学分析

CD4的表达水平估计QuPath(开源软件定量病理学,0.2.0版)(17]。每个片包括26个核的肿瘤组织,相应peritumor正常肾组织,远端正常肾组织和7芯的转移性肾癌。数字化包含IHC CD4的微阵列获得100×放大使用奥林巴斯幻灯片扫描仪(奥林巴斯机动BX61VS)。每个核心的注释是手动划定的病理切片,而瘤旁tumoral核心区域和非特异性染色被排除在外。然后,检测细胞内的注释。阳性细胞比例、奥尔雷德得分和H的每个核心计算评估CD4的表达水平。数字分析的过程显示了包含IHC补充材料3。

2.10。统计分析

所有统计分析的基因表达谱下载,TCGA CIBERSORT算法获得的数据库和免疫细胞进行使用R版本4.0.2软件。使用2中存在结果计算−△△Cq方法和配对样本t测试和IHC使用非参数测试结果进行了分析。上述分析使用IBM SPSS 25.0统计软件。只有两面 值< 0.05被认为是统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。差异表达基因的识别

KIRC转录组数据611例(正常组72例和539例癌症组)和microrna的数据616例(正常组71例和545例癌症组)从TCGA数据库下载。基因差异表达分析显示126 DElncRNAs(119调节和7表达下调),25 DEmiRNAs(12调节和13个表达下调),和957年DEmRNAs(688调节和269个表达下调)。见补充材料1差异基因的名字。

3.2。龙头、建设网络基于差异表达基因

龙头、网络,由97对lncRNA-miRNA 41对miRNA-mRNA预测miRcode和母星数据库,分别构造(图2),其中包括57 lncRNAs 7 microrna, 34 mrna。lncRNA, microrna和信使rna基因名称列出了龙头、网络辅助材料2。


图2
在KIRC龙头、网络。
3.3。在KIRC龙头、网络的生存分析

龙头、网络上执行Cox回归分析后,九个基因(SIX1、PCSK6 CCNA2, L1细胞粘附分子(L1CAM) DUXAP8, AL590094.1, LINC01426, LINC00894,和AC107021.2)得到构建风险评分模型(数据3(一)-3(c))。风险存活曲线表明,存活率显著降低高危人群的较低风险组( )(图3(d))。曲线下的面积(AUC)(1 -, 3 -, 5年存活率为0.757,0.729和0.757,分别)ROC曲线的表示更高的诊断模型(图的效率3(e))。kaplan meier生存分析显示,LINC00894、LINC01426 CCNA2, L1CAM重要KIRC患者数据4(一)- - - - - -4 (d))。

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图3
关键基因的筛选。((一)- (c))的建设风险评分模型。(d) kaplan meier风险KIRC患者的生存曲线。(e) ROC曲线评价诊断模型的有效性。
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图4
kaplan meier存活曲线的关键基因。(一)kaplan meier LNC00894存活曲线。(b) kaplan meier LINC01426存活曲线。(c) kaplan meier CCNA2存活曲线。(d) kaplan meier L1CAM存活曲线。
3.4。在KIRC免疫细胞组成

CIBERSORT算法被用来获取所有样本的免疫细胞渗透丰富,和223个样本 被保留,以备后续分析。热图和小提琴地图显示分布的差异之间的免疫细胞癌症和邻近样本(图5)。


图5
不同比例的22种免疫细胞癌症和邻近样本。
3.5。临床相关分析KIRC的免疫细胞

三个潜在的预后标志物(CD4记忆T细胞激活,T卵泡辅助细胞和肥大细胞休息)被认为是主要成员在22日类型的免疫细胞和集成到一个新的多变量模型(数据6(一)-6(c))。存活曲线风险建议高危人群的存活率显著高于低风险组( )(图6(d))。ROC曲线(AUC的1 -,3 -和5年生存率为0.587,0.642和0.616,分别)演示了模型的敏感性和特异性(图6(e))。

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图6
识别重要的免疫细胞。((一)- (c))套索和Cox回归分析。(d)风险高和低风险组的存活曲线。(e) ROC曲线分析预测1 -,3 -,5年生存率。

休息的Wilcoxon rank-sum测试表明,肥大细胞在T阶段和阶段(显著差异数据7(一)和7 (b))。kaplan meier生存分析的结果表明,浆细胞(图7 (c)(图),T卵泡辅助细胞7 (d)),和调节性T细胞(图7 (e))与KIRC患者的生存。

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图7
重要的免疫细胞和肿瘤之间的关系和生存阶段。(一)框块T的肥大细胞休息阶段。(b)框块肥大细胞休息阶段。(c) kaplan meier浆细胞的生存分析。(d) kaplan meier T卵泡辅助细胞的生存分析。(e) kaplan meier调节性T细胞的生存分析。
3.6。Co-Expression分析

重要co-expression免疫细胞(图之间的模式8(一个))、龙头、网络的主要成员和co-expression一些重要co-expression模式的免疫细胞(图的关键成员8 (b))进行了分析。结果显示CCNA2之间的正相关和T卵泡辅助细胞(R= 0.37, )(图8 (c)L1CAM和T卵泡辅助细胞之间),(R= 0.30, )(图8 (d)LINC00894和T卵泡辅助细胞之间),(R= 0.35, )(图8 (e)LINC01426和T滤泡之间),辅助细胞(R= 0.24, )(图8 (f))。这些结果表明,他们的关系可能KIRC的诊断和预后的生物标志物。

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图8
Co-expression肿瘤浸润免疫细胞之间的分析和关键龙头、网络的成员。(一)Co-expression热图免疫细胞之一。(b) Co-expression热图中两个风险评分模型。(c)之间的正相关关系被发现CCNA2和T卵泡辅助细胞(R= 0.37, )。(d)之间的正相关关系被发现L1CAM和T卵泡辅助细胞(R= 0.30, )。(e)之间的正相关关系被发现LINC00894和T卵泡辅助细胞(R= 0.35, )0.001。(f)之间的负相关发现LINC01426和T卵泡辅助细胞(R=−0.24, )。

4所示。结果临床组织标本验证

存在结果表明lncRNA LINC01426调节而mRNA L1CAM在肾癌组织中表达下调,这是符合TCGA的表达式模式数据库( )(数据9(一)和9(b))。然而,没有差别的表达水平lncRNA LINC00894 CCNA2 mRNA在肾癌组织和邻近组织( )(数据9(c)和9(d))。IHC结果表明,水平T卵泡辅助细胞(CD4标记阳性)最高的肿瘤组织的核心,这明显不同于相应的正常肾组织毗邻癌症、远端正常肾组织和转移性肾癌核心组织( )。T-follicular辅助细胞的水平是第二个最高的转移性肾细胞癌的核心组织,这是一个重大区别相邻正常肾组织和远端正常肾组织( )(数据9(e)和9(f))。结果表明表达的特点lncRNA LINC01426 mRNA L1CAM以及T卵泡辅助细胞在临床样本验证。这表明co-expression LINC01426之间存在的关系,L1CAM,和T卵泡辅助细胞,他们可能被用作生物标记KIRC的早期诊断和预后评估。

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图9
在临床样本验证。((一)- (d))差异表达CCNA2, L1CAM, LINC01426, LINC00894癌变和paracancerous组。LINC01426调节,L1CAM在肾癌组织中表达下调( ),LINC00894和CCNA2没有差异( )。(e)包含IHC结果(包括26个核的肿瘤组织,对应peritumor正常肾组织,远端正常肾组织和转移性肾癌的七个核心)。(f)包含IHC使用非参数测试结果。T卵泡辅助细胞(CD4标记阳性)显示肿瘤组织的核心不同,和相应的正常肾组织毗邻癌症、远端正常肾组织,转移性肾癌的核心( )。

5。结论

目前,许多KIRC患者的诊断主要是根据临床症状和成像方法已经开发这个时候远处转移;手术彻底治疗后复发率高(18]。近年来,大量的研究都集中在探索基因的机制,肿瘤浸润免疫细胞,和两者之间的相互作用发生,发展,转移和预后KIRC,表明基因和免疫细胞与肿瘤密切相关,并提供诊断和治疗的方向在未来KIRC [19- - - - - -22]。例如,争艳彩常等人分别构建的风险评分模型龙头、网络和免疫细胞浸润在结肠癌,发现T卵泡辅助细胞和hsa - mir - 125 b - 5 - p,巨噬细胞M0和hsa - mir - 125 b,和巨噬细胞M0和FAS可能成为潜在生物标记物通过co-expression分析,并验证了该结论在临床组织(23]。本研究模型基于骨转移性黑色素瘤,胃癌,乳腺癌骨转移,间皮瘤骨转移,和其他肿瘤已经采用各种研究[24- - - - - -26]。本研究也使用这个模型和使用生物信息学分析识别co-expression LINC01426之间的调控关系,LINC00894, CCNA2 L1CAM, T卵泡辅助细胞。这些关键成员可能成为KIRC诊断和治疗潜在的生物标记物。

LINC01426在肾透明细胞癌组织和调节其超表达是与一个令人失望的预后相关(27]。到目前为止,数据L1CAM表达在肾透明细胞癌是矛盾的;研究表明,细胞粘附、转移和入侵能力显著增加了upregulation KIRC L1CAM表达式的LICAM表达的差别,反过来,对这些降低肾癌细胞的增殖和细胞周期蛋白D1的表达减少(28,29日]。然而,这只是说明L1CAM在KIRC的发展的重要性。T卵泡辅助细胞是专门的子集的CD4 + T细胞在扁桃体在人类首次发现。他们在生发中心形成起着关键作用,和Xiaoliang华等人发现肿瘤高危患者有较高的相对丰度T卵泡辅助细胞(30.]。目前的研究证实LINC01426的高表达,L1CAM,肿瘤浸润的T卵泡辅助细胞因为这些细胞密切相关的临床和预后预测KIRC。因此,这些细胞被发现更容易KIRC生物标志物。

总之,目前LINC01426 bio-report分析表明关系,L1CAM,和T卵泡辅助细胞,这是有意义的。是很难检测患者的免疫细胞,大量的T卵泡辅助KIRC决心通过检测细胞的表达水平LINC01426 L1CAM,有co-expression关系的早期诊断提供新的前景KIRC开发新的治疗药物。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在目前的研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

本研究经伦理委员会批准的宁夏医科大学总医院遵守赫尔辛基宣言的原则。所有组织和互补脱氧核糖核酸微阵列购买上海超越生物技术有限公司有限公司符合伦理要求。

的利益冲突

没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Aoran香港和回族盾同样这项工作。

确认

支持的研究是宁夏重要研发项目(2021)和中国国家自然科学基金(82002955)。

补充材料

差异表达lncRNA, microrna mrna在补充材料1。基因lncRNAs ID, microrna和mrna在电抗器,网络显示在补充材料2。综合数字包含IHC Qupath图像分析,请参考协议补充材料3。(补充材料)