文摘
目的。食管鳞状细胞癌(ESCC)是一种致命的恶性肿瘤,其特征是一个总体5年生存率低于20%,中国占全球约50%的情况下。我们先前的研究已经表明,高integrin-linked激酶(同类)表达式ESCC的开发和发展中扮演着重要角色在体外和在活的有机体内。在这里,我们使用美国fda批准的药物再利用的方法来确定一个小说抗癌抑制剂对ILK-induced肿瘤发生和发展。方法。我们筛选ZINC15数据库和预测之间的分子对接能力fda批准的和公开的药物的同类,然后计算对接和执行目视检查分析排名前十的药物。两个计算机虚拟筛选药物进行评估在体外的能力直接绑定纯化的同类表面等离子体共振。两种候选药物的细胞毒性是验证在体外使用CCK-8和LDH化验。结果。我们最初选择了10个化合物,基于最低的同类晶体结合能,分子对接后,并对其进行进一步筛选。10−千卡每摩尔的结合能随着阈值,我们选择两种药物,即nilotinib、替尼泊苷、湿实验室实验。表面等离子体共振(SPR)透露,nilotinib替尼泊苷和平衡离解常数(KD)值为6.410E−6和1.793E−6分别低于2.643E−6中观察到ILK-IN-3作为阳性对照。nilotinib的IC50值、替尼泊苷ESCC细胞系是40μ分别和200 - 400 nM。CCK-8试验的结果表明,nilotinib和替尼泊苷显著地抑制细胞的增殖( )。LDH的结果显示,两种药物显著抑制细胞死亡的速度( )。结论。药物重新定位过程可以有效地确定治疗ESCC的新工具。我们的研究结果表明,nilotinib和替尼泊苷有效的抑制剂的同类,因此有潜力目标ILK-mediated信号通路ESCC的管理。
1。背景信息
食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,威胁人类健康和生命。疾病排名7日和6日关于全球恶性肿瘤发病率和死亡率,分别。在中国,食道癌占全球约43.0%和37.0%的新发病例和死亡人数在世界范围内,分别与食管鳞状细胞癌(ESCC)是主要的亚型1,2]。ESCC的5年生存率是30%,由于其典型的早期症状,高恶性肿瘤,咄咄逼人,更有限的治疗方案(3]。
尽管癌症生物学领域取得巨大进步,进步领域的药物研究与开发(R&D)仍低于预期[4]。承诺解决相当新颖的化合物的药物开发挑战是药物再利用(也称为药物重新定位,重新安排或retasking),识别新的临床适应症的策略批准或试验性药物(5]。批准药物经过各个阶段的临床试验以达到市场,从而认识和接受了安全数据,大幅降低研发风险,时间,成本(6]。西地那非,5型磷酸二酯酶抑制剂(PDE5),是一个成功的药物再利用的例子。西地那非最初开发治疗高血压,但后来被FDA批准用于治疗勃起功能障碍和肺动脉高压的7,8]。
计算机辅助药物设计(CADD)的参与可以减少研究和开发的失败率,进一步巩固药物重新定位的优势,主要包括两种类型的药物设计技术:ligand-based药物设计(LBDD)和基于结构的药物设计(SBDD) [9]。作为在硅片中最常用的方法之一,SBDD利用3 d蛋白质结构的结构信息来预测高分子结合位点和配体的亲和力10]。分子对接是一个典型的SBDD方法用来评估结合蛋白质与配体之间的共用性(11]。例如,随着分子配合执行计算3671年fda批准的药物在2335年人类蛋白质晶体结构,Dakshanamurthy甲苯咪唑等人筛选,一种抗寄生虫药物,有结构潜在的抑制血管生成中血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2),血管生成的中介,由实验还证实[12]。
Integrin-linked激酶(亲属),一个细胞内的蛋白激酶,不仅参与了几个信号转导过程也调节细胞周期、移民和经济增长等生物过程(13]。之前有研究表明,高的同类表达介导调控细胞增殖、迁移和分化的肿瘤和肿瘤也会影响治疗效果14- - - - - -16]。与此同时,我们发现同类ESCC中高度表达,而其使用慢病毒干扰明显抑制ESCCs[的存在和发展17]。这个项目旨在屏幕有些小分子抑制相同的高选择性和活动,通过计算机辅助药物已成为药物研究和开展主要药理活性的筛选和验证提供实验和理论支持的研究小说anticancer-led化合物。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和试剂
人类ESCC细胞系KYSE150和关冲购自中国科学院细胞库(上海,中国)。在RPMI1640培养基培养细胞,补充10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco,罗克维尔市,医学博士,美国)和1% penicillin-streptomycin(不合格品生物技术、苏州、中国)。所有细胞培养在37°C和5%孵化有限公司2在湿润的气氛中。Nilotinib购买从MedChemExpress有限公司有限公司(上海,中国),而从目标获得的替尼泊苷和ILK-IN-3分子公司(上海,中国)。所有化合物溶解在DMSO溶液在使用前(多国评价、上海、中国)。
2.2。虚拟筛选
首先,我们获得了家族的家族蛋白的三维结构/ alpha-parvin核心复杂晶体结构从数据库(PDB下载18),然后提取同类蛋白(连锁)使用PyMOL工具。随后,同类的潜在绑定口袋蛋白质测定使用DoGSiteScorer在线工具(19),开发预测绑定口袋和排名根据大小、表面积和druggability得分。选择绑定的口袋被fpocket进一步验证(20.]和CASTp [21)工具。接下来,我们得到的列表1615年fda批准的药物从锌数据库(22虚拟筛选)。这些药物被转换为使用MGLTools PDB格式,然后进行分子对接使用七弦琴AutoDock对接程序(23]。我们排名的药物他们绑定亲和力当绑定到绑定的口袋。最后,我们选择2药物和最小自由能湿实验室验证。
2.3。在体外评估药物直接绑定到的同类
SPR实验进行了使用Biacore售价仪器(美国Biacore,通用电气医疗集团,波士顿,MA)在25°C。概要,同类(配体)是第一固定化激活CM5胺耦合传感器芯片的pH值5.0和乙酸钠浓度的46μ克/毫升。nonreaction组然后被注入盐酸乙醇胺1 M (35μL)。这种药物(分析物)溶解在100% DMSO(10毫米)的初始浓度和稀释到200μ(最后5% DMSO浓度)与20 mM玫瑰,150毫米氯化钠和0.005%的表面活性剂P20缓冲区(HBSP)。这是进一步稀释HBSP + 5% DMSO (HBSP5%D)。然后我们确认化合物浓度根据溶解度和传感器芯片的测试结果来衡量样本。从基线增加俄罗斯价值表明,地层复杂,高原地区代表一个稳态阶段的交互(RUeq),而减少俄罗斯100年代之后表明分离分析物的注射后固定化的同类HBSP5%D缓冲区。最后,我们执行sensorgram分析使用Biacore售价评价软件。
2.4。评估两个筛选化合物的抗癌活性
2.4.1。CCK-8化验
KYSE150关冲细胞,分别播种到96 -文化板块(5×104细胞每)和孵化24小时37°C, 5%的公司2,100μL候选药物制备和不同浓度的添加到1640培养基,其次是48小时孵化。媒介是刷新;然后,100年μL培养基的10% CCK-8添加到每个测试好,其次是2 h的孵化37°C。标(BioTek仪器有限公司、Winooski VT,美国)是用来测量OD在每个450海里,以及检测细胞增殖能力的变化。
2.4.2。LDH测定
KYSE150关冲细胞,分别播种到96孔板(5×104细胞/)和孵化24 h在37°C, 5%的公司2。150年μL候选药物的不同浓度添加到1640年中期和孵化48 h,紧随其后的是15μL LDH的释放与最大酶活性试剂。内容被孵化1 h和离心机;然后,100年μL每个上层清液的添加到相应的96孔板。标仪是用来测量在每个测试在490 nm, OD和细胞毒性的变化被发现。
3所示。结果
3.1。识别潜在的绑定药物虚拟筛选
3.1.1。相同的蛋白质和三维晶体结构
同类的蛋白质的三维结构是获得从亲属/ alpha-parvin核心PDB数据库中复杂的晶体结构(3 kmu)根据同类蛋白序列(补充文件)。接下来,家族蛋白(连锁)是使用PyMOL提取的,和它的三维结构如图1。
3.1.2。预测具有约束力的口袋
我们使用在线工具DoGSiteScorer预测和描述潜在的绑定口袋同类的蛋白质。前9预测绑定表中列出1。我们只考虑第一次绑定的口袋在分子对接,由于它的接触表面积比别人的要大得多。与此同时,我们使用两个其他流行的工具,fpocket CASTp,预测绑定口袋,发现类似的结果。
3.1.3。分子对接和筛选结果
我们筛选了fda批准的药物库,从锌15下载数据库,为潜在在我们的虚拟筛选。库包含1615年fda批准的药物。检索到的药物MOL2格式,然后转换成使用MGLTools .pdbqt格式。转型期间,Gasteiger指控和极地氢原子都补充道,和药物准备对接。
接下来,我们利用AutoDock七弦琴工具码头fda批准的药物和同类的蛋白质分子对接使用以下参数:一个有约束力的站点区域( )埃的坐标(X:6.292,Y:18.998,Z:12.265)。数据的输出格式是按最低结合能这些药物的晶体。接下来,我们选取了前10支安打的分子对接进行进一步的筛选,如表所示2。10−千卡每摩尔的结合能随着阈值,两种药物,即nilotinib (ZINC6716957)、替尼泊苷(ZINC4099009),被选为后续湿实验室实验。对于每个药物,ligand-target复杂最少的结合能带来如图2和图3他们的化学公式,而信息列在表中3。
3.1.4。评估药物直接绑定到的同类在体外
来验证虚拟筛选结果,我们进行SPR在体外评价药物的生物分子的相互作用。立刻,同类重组蛋白固定在一个激活CM5芯片的pH值最合适的耦合反应。结果的能力的蛋白质结合两种药物在不同浓度图所示4。ILK-IN-3作为一个积极的控制(24]。SPR结果表明,顶部2药物虚拟筛选预测的强关联性确实可以绑定到的同类。Biacore售价软件显示,药物的离解常数(KD)值在微摩尔的范围和类似的控制(表4)。有趣的是,替尼泊苷(KD = 1.793μ米)有较高的亲和力的同类比ILK-IN-3 (KD = 2.643μ米)。
(一)
(b)
(c)
3.2。评价两种化合物的抗癌活性
接下来,我们使用CCK-8和LDH释放化验确定函数的两种化合物ESCC细胞的增殖和死亡。为此,我们针对kyse - 150和关冲人食管鳞状细胞癌细胞,同类的表达水平相对高于其他ESCC细胞根据我们先前的研究[17]。值得注意的是,nilotinib的IC50值40μ米,而替尼泊苷的IC50值范围从162.7到396.2 nM在这些ESCC细胞系(数字5(一个)和5 (b))。这表明替尼泊苷细胞毒性影响ESCC细胞相对高于nilotinib,与SPR结果一致。此外,药物浓度的增加与减少ESCC细胞的生存和死亡的增加(数据5 (c)和5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
ESCC治疗研究进展缓慢;因此,目前迫切需要找出有效的抗肿瘤治疗的药物靶点。一般来说,药物开发是一项艰巨的任务,需要很长一段时间,伴随着高成本和高风险低回报。相比之下,药物重定位,这是一个方法去发现一个新的效应已经批准的药物在小说疾病类型,提供了一个更高的成功率,降低了风险率,缩短了时间在临床使用(6]。值得注意的是,研究人员目前使用虚拟筛选(VS)基于目标结构作为新药发现的有效方法。这种方法不仅可以快速筛选大量的化合物在药物在一个短的时间,但也是一个新颖的方法来发现新的药物,就是明证最近成功(25,26]。由于大多数小分子可能有多个分子的目标,新的药物治疗靶点的发现是至关重要的新适应症(27]。
同类最初认为是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶与胞质域的交互β1整合素介导的细胞和细胞外基质之间的连接。功能,它也影响细胞外信号的传输和中起着重要的作用在调节基本过程,如细胞形态、能动性、成长、生存、分化和基因表达13]。迄今为止,潜在的确切分子机制的同类信号转导已相当有争议(28]。然而,最近的一项研究表明,同类pseudokinase [29日]。随后,大量研究表明,家族中扮演着重要角色在epithelial-mesenchymal过渡(EMT)入侵,血管生成,表明它可能是肿瘤治疗的一个有吸引力的目标(30.- - - - - -32]。事实上,一些研究表明,家族不仅是调节多种恶性肿瘤,但也与病人预后有关。与此同时,我们的研究小组先前表明,干扰亲属可以显著抑制增殖,入侵,ESCC细胞迁移并改善病人的预后(17,33]。家族,作为治疗目标,吸引了大量的研究关注。例如,一些研究人员针对同类设计小分子化合物抑制肿瘤的生长,尽管这些研究既没有清晰地描述这些化合物是否直接绑定到的同类也展示了他们的特异性,这需要进一步探索临床应用前(24,34- - - - - -36]。
在目前的研究中,我们筛选两个已知的药物化合物相同的亲和力强,nilotinib替尼泊苷,从ZINC15药品数据库,包含1615年fda批准的药物,使用VS方法基于相同的蛋白质结构。此外,我们验证纯化家族蛋白质利用分子生物学技术,测量了这些化合物的抑制效果的同类,验证计算机虚拟筛选结果的可靠性。我们的研究结果表明,nilotinib和替尼泊苷有较强的亲和力比积极的参考复合ILK-IN-3家族,这一现象最初证明蛋白质药物小虚拟筛选方法的可行性。随后,我们评估了两种抑制剂抗肿瘤活性ESCC关冲和KYSE150细胞,发现两种抑制剂显著促进细胞死亡和抑制增殖,符合药物虚拟筛选结果。
这些结果表明,nilotinib的观察抗肿瘤效应、替尼泊苷ESCC部分相关的同类的绑定能力加上抑制的影响。Nilotinib,属于第二代酪氨酸激酶抑制剂(TKI),已被作为一种有效的疗法在临床治疗慢性粒细胞白血病(CML)不能容忍或耐伊马替尼(格列卫)37]。另一方面,替尼泊苷、一个目标DNA拓扑异构酶ⅱ的化学治疗剂,主要用于治疗急性淋巴细胞白血病,淋巴瘤,和儿童脑癌38]。然而,药物的功效也研究其他不同类型的实体肿瘤(39- - - - - -41),合成数据表明它可以抑制肿瘤的生长通过其他目标。这也表明,这种药物可能有多个分子的目标,和发现新的治疗靶点的药物扩大新适应症至关重要。本研究的结果,尽管是初步的,表明这两种药物有抗肿瘤活性。在未来,我们打算验证观察抗肿瘤筛选药物使用的效果和潜在机制在体外和在活的有机体内实验。
5。结论
需要不断地筛选同类抑制剂来识别广泛的抗肿瘤活性和高选择性的问题在当前同类研究选择性和特异性抑制剂。在这项研究中,我们使用VS,基于相同的蛋白质结构,找出两个潜在antiesophageal鳞状细胞癌药物,nilotinib、替尼泊苷、家族蛋白的结合能力验证两种化合物的表面等离子体共振(SPR)。此外,我们验证了两种药物抗肿瘤活性在食管鳞状细胞癌的细胞系。上述结果证实nilotinib和替尼泊苷都是有效和选择性的同类抑制剂,和这个角色值得进一步调查。
数据可用性
我们研究的数据集用于支持这些发现可以从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
李张负责概念和设计的研究。胡安刘马和小李负责数据采集。胡安刘、曹Leiyu俞伟,严高负责数据分析和解释。胡安·刘,成成曲,Nuersimanguli Maimaitiming负责统计分析。李张负责融资收购。胡安刘马和小李负责撰写的手稿。李张负责关键知识内容的修订手稿。所有作者阅读和批准了最终稿。胡安刘马和小李的贡献同样这项工作。
确认
作者要感谢的努力和专门工作人员研究的干预和评估组件实现。这项工作是由中国国家自然科学基金会的基金(格兰特没有:81860421)。
补充材料
补充材料包含的蛋白质序列的同类。(补充材料)