文摘
背景。我们分析了n6-methyladenosine (m6A)修改模式的免疫细胞浸润乳腺癌的肿瘤微环境(BC)提供一个新的视角公元前的早期诊断和治疗。方法。基于23个m6A监管因素,我们发现m6A-related基因特点和m6A修改模式通过无监督聚类分析在公元前。检查不同的生物过程在各种m6A修改模式,我们基因组变异进行分析。然后我们量化的相对渗透水平不同的肿瘤微环境中免疫细胞的细胞亚群BC使用CIBERSORT算法和single-sample基因集富集分析。单变量Cox分析被用来屏幕m6A基因特征与预后有关。最后,我们评估患者的m6A修改模式公元前一个通过构造m6Ascore基于主成分分析。结果。我们确定了三种不同m6A公元前2128年样本修改模式。丰度更高的免疫渗透m6Acluster CIBERSORT的结果表明了C和single-sample基因集富集分析。基于m6A特征基因通过筛查,m6Ascore决心。BC患者被隔离到m6Ascore组低和高的类别,它揭示了重要的生存利益m6Ascores患者低。此外,high-m6Ascore组突变频率较高和较低有关PD-L1表达式,和m6Ascore肿瘤突变负担显示正相关。此外,在high-m6Ascore组患者治疗效果更好。结论。公元前的一个病人,肿瘤微环境中的免疫细胞渗透特性和m6A甲基化修饰模式可以使用m6Ascore评估。我们的研究结果为提高公元前的个性化的免疫治疗提供了一个基础。
1。介绍
在女性常见的恶性肿瘤,乳腺癌(BC)是全世界第五大原因癌症相关的死亡率。所有癌症病例,11.7%或大约公元前230万新病例记录2020年,公元前,女性的发病率正在增加每年(1,2]。诊断和治疗进展最近导致显著减少在公元前的死亡率(3]。然而,许多公元前患者预后不良。肿瘤微环境的研究(时差)澄清角色的关键免疫细胞亚群在癌症的发生和发展4- - - - - -6]。Harao等人发现了一个重大的CD8 + T细胞的密度之间的联系和免疫逃逸的公元前的渗透以及CD4 + T细胞和CD8 + T细胞与BC预后[7]。此外,特定的免疫抑制剂如CTLA-4检查站,PD-1, PD-L1显著改变了癌症治疗的现状和对总生存期(OS)有益的各种癌症患者(8,9]。CTLA-4、PD-1, PD-L1-specific拮抗剂在公元前的临床试验也取得了进展(10,11]。为开发新的免疫治疗策略和预测应对现有的免疫抑制剂,检查站至关重要评估免疫渗透基于的特征时间(12- - - - - -14]。因此,通过全面分析的复杂性和异质性的时间,可以发现潜在的生物标记物来帮助指导和预测响应免疫疗法(13,15]。
在超过100个RNA修改,最常见的是n6-methyladenosine (m6A) [16]。在全球细胞RNA, m6A发生在0.2 - -0.4%的腺苷和大约50%的甲基化核苷酸(17]。修改m6a调节添加、移除和认可通过甲基转移酶”作家,“demethylase“橡皮擦”,和结合蛋白”的读者,“分别18- - - - - -21]。先前的研究表明,m6甲基化可调节rna剪接,表情,核出口,翻译和在肿瘤的发展中扮演了重要的角色22- - - - - -25]。许多先前的研究表明,m6A甲基化可调节rna剪接,表情,衰变,翻译和扮演重要的角色在不同的细胞通路和生物过程(26,27]。癌症的早期诊断和治疗,m6A甲基化提供了一个新的视角。
m6A修改之间的作用机理和TME-infiltrating免疫细胞不能被解释为透露也从早期的研究RNA降解机制。YTHDF1树突细胞可以识别和结合m6A-modified信使rna编码溶酶体组织蛋白酶,促进组织蛋白酶的翻译,抑制树突状细胞(cross-initiation28]。李等人发现没有m6A demethylase ALKBH5增强肿瘤癌症免疫治疗的敏感性和改进的免疫疗法的疗效[29日]。ALKBH5可以影响肿瘤微环境的乳酸含量,肿瘤浸润亚群,myeloid-derived抑制细胞通过调节靶基因的表达和拼接。杨等人建议增加FTO表达能促进黑色素瘤的生长通过减少m6A PD-1甲基化,趋化因子受体CXCR4和SOX10阻止他们的RNA YTHDF2-mediated衰变(30.]。FTO基因敲除的黑色素瘤细胞的敏感性增加肿瘤细胞干扰素γ和增强小鼠anti-PD-1抗体的反应。然而,以往的研究侧重于只有少数m6A监管因素和这些监管因素的抗肿瘤作用在一个高度协调的方式实现,许多肿瘤的抑制。此外,m6A监管因素综合评估如果转录组和基因组数据积累,如通过高通量测序分析。因此,识别和分析时间细胞渗透的特点由多个m6A监管因素有利于促进免疫疗法发展(31日,32]。
在这项研究中,我们使用了基因表达综合(GEO)和癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载公元前2128年的临床信息和转录组数据样本。之间的关联时间细胞浸润和m6A全面修改模式进行了分析。m6A修改发现三种不同的模式,因此,衡量公元前m6A修改的模式,一个得分方案开发。我们的研究结果表明,m6A修改公元前改善当前的治疗是很重要的。
2。材料和方法
2.1。公元前的数据收集
使用地理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/TCGA)和(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)数据库,我们收集临床资料和公元前转录组数据样本。我们包括七个数据集,特别是GSE48390。txt, GSE58812。txt, GSE88770。txt、GSE131769 GSE42568、GSE20685 TCGA-BC。下载公元前患者的基因组突变数据是TCGA的从数据库中完成的。为TCGA-BC数据集,我们使用了R包TCGAbiolinks转换的每千碱基片段记录每百万映射值读入记录与基值(一千分之一百万33]。的R包“SVR”是用来管理批处理效果在不同数据集(34]。拷贝数变异(CNV)的地图23 m6A监管者在人类染色体上是使用生成的R包“RCircos。”
2.2。聚类分析23 m6A调节器
我们收集了23 m6A监管基因,包括八个作家(METTL3、METL14 METL16, WTAP, VIRMA, ZC3H13, RBM15,和RBM15B), 13个读者(YTHDC1、YTHDC2 YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, HNRNPC, FMR1, LRPPRC, HNRNPA2B1、IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3,和RBMX),和两个橡皮(FTO和ALKBH5)。
确定的各种模式m6A修改,一个无监督聚类分析,根据23 m6A监管基因。选择最优数量的集群根据等高线的系数,色散和共生。的R包ConsensusClusterPlus是用来执行聚类分析。
2.3。基因功能注释和差异分析
使用R包“GSVA”,基因变异分析(GSVA)富集分析检查生物过程的差异不同m6A修改模式。对于GSVA,我们下载“h.all.v7.4.symbols基因集。“从MSigDB数据库(格林尼治时间35]。使用R包“clusterProfiler”功能注释。一套错误发现率< 0.05的截断值。
2.4。分析不同m6A修改模式之间的免疫细胞浸润
每个免疫细胞类型的相对丰度渗透公元前的时差是由进行single-sample基因集富集分析。我们评估CD8 T细胞激活,激活树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤T细胞,和调节性T细胞。使用浓缩的分数从single-sample获得基因集富集分析,每个免疫细胞类型指定的相对丰度。
2.5。分析不同类型的m6A之间的差异表达基因
公元前是集群分成三组患者根据不同m6A修改模式。识别模式之间的差异表达基因(度)的三个m6A修改,R包使用“limma”(36]。一个 被认为是表明一个度。
2.6。建设m6A基因签名
首先,我们使用单变量Cox基因预后分析基于不同m6Aclusters之间的重叠度和选定的基因,为后续分析,对预后有重大影响 截断值。隔离病人分为三组进行后续分析,分析prognostic-related基因,应用一个无监督聚类方法。最后,主成分分析的基因表达谱合并,并提取主成分1和2功能分数。这种方法主要集中于一组的得分最显著相关或负相关的基因块集。同时,它的重量开始回升的基因组其他成员的贡献。我们建造了m6A基因签名使用先前描述的公式(37,38],m6Ascore =∑(PC1i + PC2i)我是m6A表型相关的基因的表达。
2.7。统计分析
R-3.4.2用于统计分析。确定多个组之间的差异,单向方差分析和克鲁斯卡尔-沃利斯进行了测试(39]。隔离样品分为低收入和high-m6Ascore组,应用“surv-cutpoint”功能。kaplan meier方法被用来绘制生存曲线进行预后分析。MAFtools包中的瀑布函数被用来评估两组患者的突变状态,特别是那些低收入和high-m6Ascore亚型。结果与值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。公元前m6A监管机构及其遗传变异格局
我们研究公元前23 m6A监管基因的作用,包括八个作家(METTL3、METL14 METL16, WTAP, VIRMA,佐3H13、RBM15 RBM15B), 13个读者(YTHDC1、YTHDC2 YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, HNRNPC, FMR1, LRPPRC, HNRNPA2B1、IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3,和RBMX),和两个橡皮(FTO和ALKBH5)。首先,我们确定CNV和体细胞突变的发生率在公元前23 m6A监管因素。图1(一)显示,57岁的986个样本有突变m6A监管因素,频率为5.78%。1%的突变频率在YTHDF3观察,WTAP, HNRNPA2B1, FMR1, YTHDF1, RBM15 LRPPRC, ZC3H13。五个作家(METTL3、METL14、METL16 VIRMA,和RBM15B),八个读者(YTHDC1、YTHDC2 YTHDF2, HNRNPC、IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3,和RBMX),和两个橡皮擦(FTO和ALKBH5)没有突变。公元前23 m6A监管因素的进一步分析显示,CNV突变在23个m6A监管因素很常见。VIRMA、YTHDF1 YTHDF3、HNRNPC METL3, YTHDC1, FTO, FMR1, RBMX显示广泛的CNV放大。相比之下,WTAP RBM15、ZC3H13 YTHDF2, RBM15B CNV删除(图中常见1 (b))。图1 (c)显示位置的变化的基因拷贝数异变23 m6A监管因素在人类染色体。公元前23 m6A监管者完全区分肿瘤样本的正常样本进行主成分分析BC样品(图1 (d))。此外,在公元前患者,通过探索这些因素之间的信使rna表达水平肿瘤和正常的样本,我们可以确定m6A监管因素的表达上面的遗传变异的影响。结果表明,CNV的变化导致m6A监管因素的变化。METTL14的表达,METTL16、WTAP ZC3H13, YTHDC1、IGFBP1, IGFBP3, FTO高于正常组织,在肿瘤组织。相比之下,VIRMA的表达、RBM15 YTHDF1, YTHDF2, HNRNPC, FMR1, LRPPRC, HNRNPA2B1, IGFBP2在肿瘤组织中高于正常组织(图1 (e))。这些结果表明,m6A监管因素的遗传变异和表达明显不同肿瘤与正常样本和公元前可能是至关重要的发展和发生。
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3.2。m6A修改模式在公元前由23个监管因素
我们包括七个与临床信息数据集(TCGA-BC GSE48390。txt, GSE58812。txt, GSE88770。三、GSE20685 GSE42568和GSE131769)进行后续分析。图2(一个)显示了m6A调节因子网络,揭示20 m6A监管因素之间的相互作用和监管因素患者的预后意义。m6A监管者之间的显著相关性被发现在同一类别,以及在橡皮擦,读者和作家。在独特的m6A修改模式的形成,橡皮擦之间的联系,读者和作家可能是至关重要的,影响的发展和发生BC。我们接下来进行无监督聚类分析基于m6A监管因素分类样本的表达与不同m6A修改模式,最终确定三种不同的修改模式:m6Acluster(494例),m6Acluster B(940例)和m6Acluster C(694例)(数据2 (b)- - - - - -2 (d))。
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3.3。免疫景观特征在不同m6A修改模式
浓缩的GSVA生物行为进行调查的三个不同的m6A修改模式(数据3(一个)- - - - - -3 (c))。GSVA结果表明m6Acluster显示更高的与蛋白质分泌,有丝分裂纺锤体,G2M检查站。m6Acluster B显示更高的协会与肌细胞生成,喀斯特信号和雌激素响应迟了。m6Acluster C显示更高的协会与同种异体移植物排斥反应,补,il - 6木菠萝STAT3信号、炎症反应和干扰素-γ的反应。此外,我们使用了反褶积算法CIBERSORT进一步评估免疫渗透特征的三个m6A修改模式。结果表明,C m6Acluster最好基质分数,免疫分数,估计分数(图3 (d))。我们还执行single-sample基因集富集分析来确定时间公元前免疫细胞的渗透,结果显示,免疫细胞渗透m6Acluster C更丰富,包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、肥大细胞、血浆树突细胞(图3 (e))。
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3.4。在公元前m6A Phenotype-Related度
三种不同m6A修改模式显示明显的差异m6A转录概要(图4(一))。虽然无监督聚类分析基于m6A监管因素的表达公元前患者分为三个不同的m6A修改模式,潜在的基因变化和作用机理不清楚。因此,我们应用经验贝叶斯方法筛选度之间重叠的三个m6A修改模式,揭示2124度(图4 (b))。我们还执行这些度的基因功能富集分析。基因本体论浓缩纤毛组织等分析表明,生物过程,转录辅阻遏物活动,和泛素蛋白连接酶活性显著调节(图4 (c))。京都百科全书的基因和基因组富集分析表明,生物过程如ubiquitin-mediated蛋白质水解,沙门氏菌感染,内吞作用,AMPK信号通路显著调节(图4 (d))。此外,我们进行无监督聚类分析基于度来验证这种调整机制。屏幕与预后相关的度,进行了单变量Cox分析显示668度 。接下来,我们进行无监督聚类分析基于668个基因和将病人分成三个不同基因亚型(基因簇》)(数据5(一个)- - - - - -5 (c))。聚类结果支持,有三个不同的m6A甲基化修饰在BC模式。图5 (d)显示明显的集群之间的分离三个基因簇。图5 (e)显示了不同的临床病理的特点,这些子组。后续生存分析揭示了重要的预后差异基因的三个不同的集群和集群二世与更好的生存结果(图5 (f))。此外,在三个不同的基因簇,估计m6A甲基化修饰模式的结果被发现是一致的显著差异表达m6A监管因素(图5 (g))。我们也进行了single-sample基因集富集分析表明,免疫细胞基因簇三世更渗透,包括B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞,树突状细胞、自然杀伤细胞、MDSCna(图5 (h))。
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3.5。m6A基因签名、功能注释和临床意义
上述研究结果是基于患者群体,因此不可能准确预测m6A修改模式在一个特定的病人样本。因此,量化的m6A模式公元前一个病人,一个评分系统(m6Ascore)开发。冲积情节被用来显示患者的变化特点BC(图6(一))。图6 (b)显示了m6Ascore和免疫细胞之间的关系。结果表明,m6Ascore呈正相关,自然杀伤细胞,MDSCna macrophagena, monocytena。克鲁斯卡尔-沃利斯检验表明,m6Ascore和m6Acluster显著不同。m6Acluster B的m6Ascore显著高于m6Acluster(图6 (c))。此外,与其他m6A基因集群相比,基因簇三世显示m6Ascore最高,而基因簇II m6Ascore最低(图6 (d))。这些结果表明,m6Ascore可以用来评估公元前m6A修改的单一模式和时间免疫细胞浸润肿瘤的特征。我们也分析的价值m6Ascore预测病人生存的结果。患者生存结果表明低m6Ascore显示(图显著的生存利益6 (e))。
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有越来越多的证据表明肿瘤的相关性的体细胞突变基因和免疫治疗的反应。分布格局的分析肿瘤突变负担(三甲)不同m6Ascore组表明,突变频率high-m6Ascore组高于low-m6Ascore组(图6 (f))。图6 (g)表明m6Ascore和三甲呈正相关(R= 0.26, )。high-TMB组的患者相比,low-TMB组患者更好的生存结果(图表示6 (h))。此外,无论m6Ascore是高或低,病人low-TMB组始终显示出了极大的生存优势(图6(我))。体细胞突变的分布变化之间的高收入和low-m6Ascore团体使用MAFtools方案进行评估。前者说明了一个更广泛的三甲相比,后者的结果(数据6 (j)和6 (k))。这些结果改善的理解m6Ascore分类对基因变异的影响,揭示了潜在的个人体细胞突变和m6A交互修改。
3.6。预测价值的m6Ascore免疫疗法的效果
免疫抑制药物可以改善癌症治疗。肿瘤免疫功能紊乱和排斥(潮)和immunophenoscore,最近发现的预测指标,已广泛应用于评估免疫反应。我们分析了潮流的表达在低收入和high-m6Ascore组。high-m6Ascore组相比,潮流low-m6Ascore集团被发现低,根据结果( )(图7(一))。CTLA-4和PD-1组,患者high-m6Ascore组显示更好的治疗效果(CTLA-4:= 1.2 e−12;PD-1:e = 5.4−08年)(数据7 (b)和7 (c))。CTLA-4和PD-1联合治疗组,患者high-m6Ascore组仍然表现出更好的治疗效果(= 1.5 e−09年)(图7 (d))。此外,低PD-L1表达观察患者m6Ascores高,表明这些病人将如何应对anti-PD-1 / L1免疫疗法(图7 (e))。调节免疫反应,所发挥的重大作用m6A修改BC模式得到了这些结果。
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4所示。讨论
先前的研究显示,m6A修改和m6A监管因素之间的相互作用是非常重要的在各种癌症功能,包括癌症干细胞形成,epithelial-mesenchymal过渡,癌症代谢和信号转导40- - - - - -43]。因为大多数以前的研究集中于单个m6A监管因素,免疫渗透的特征时间由多个m6A监管因素尚不清楚。因此,识别的功能m6A修改模式时间免疫细胞浸润是根本改善的理解之间的交互m6A RNA和抗肿瘤免疫反应,促进患者个性化治疗的进步。
遗传变异在公元前m6A监管因素表明,八个监管因素(YTHDF3、WTAP HNRNPA2B1, FMR1, YTHDF1, RBM15, LRPPRC,和ZC3H13)突变。在RNA稳定、编辑、翻译、拼接,处理,和监管,五角星形肽重复(PPR)家庭发挥重要作用。LRPPRC PPR家族是一种多功能蛋白(44]。增加各种细胞系和肿瘤组织的LRPPRC表达式也说明了早期的研究[45- - - - - -49]。MAP1S microtubule-associated蛋白质家族的线粒体和微管可以联系运输和影响自噬小体的生物起源和退化,从而增加自噬和抑制肿瘤发生。高表达LRPPRC和低的组合表达MAP1S可以抑制自噬和促进肿瘤发展50]。ZC3H13是一个典型的CCCH锌指蛋白。先前的研究已经表明,ZC3H13可能是一个肿瘤抑制蛋白,体细胞突变在结肠癌51]。YTHDF1 m6A甲基化是一个重要的监管机构,可以促进翻译的关键Wnt受体frizzled7 m6A-dependent方式。此外,突变YTHDF1可以增强frizzled7的表达,导致过度激活的Wnt /β连环蛋白通路,促进胃癌(52]。然而,我们对角色的理解这些m6A调节因子突变在公元前是有限的,需要更多的实验。
基于23个m6A监管因素,确定了三个不同的m6A修改模式。中设置的标志基因的分子特征数据库(MSigDB)总结和代表一个特定的定义良好的生理状态或过程。我们基于h.all.v7.4.symbols GSVA进行分析。格林尼治时间,结果表明m6Acluster更相关的细胞通路和扩散。m6Acluster B细胞发育和信号相关。在m6Acluster C,几种途径更加活跃。il - 6的木菠萝STAT3通路已被证明有重要影响的发展各种人类肿瘤(53]。il - 6,炎症的主要媒介,是肿瘤微环境中高度表达。STAT3 STAT蛋白家族中的一员,能显著促进肿瘤发展和免疫抑制54,55]。JAK / STAT3信号通路发挥重要作用介导的il - 6抑制肿瘤细胞增殖,入侵,转移和抗肿瘤免疫力。之前累积的研究发现,il - 6表达的增加刺激overactivation JAK / STAT3信号和导致癌症患者的不良预后56- - - - - -58]。先前的研究表明,肿瘤浸润CD4 + T细胞的表达水平,CD8 + T细胞,巨噬细胞M1,自然杀伤细胞可能与免疫反应(12,59,60]。我们的研究结果证实,m6Acluster C模式与肿瘤浸润免疫细胞水平上升有关。一个高度显著相关表示支持免疫疗法的潜在价值。先前的研究表明,统计抑制剂可以抑制STAT3蛋白表达在淋巴瘤和早期临床活动。此外,淋巴瘤患者显示肿瘤细胞和myeloid-derived抑制细胞减少和增加的CD8 + T细胞(61年]。因此,患者公元前m6Acluster C模式可能从统计阻滞剂治疗中获益。
基因功能富集分析表明,潜在的生物通路之间的度三个不同m6A集群有显著相关。这表明这些度是m6A表型相关的基因特征。Prognostic-related m6A签名基因筛选和用于识别三个基因亚型,也与不同时间公元前免疫风景。此外,对于量化公元前m6A修改的单一模式旨在提高个性化治疗,一个评分系统(m6Ascore)开发。低m6Ascore患者表现出明显的生存优势。此外,我们的研究结果还表明,m6Ascore显著相关预测因子的免疫反应,如PD-L1 immunophenoscore,和潮流,表明修改m6A影响免疫疗法的治疗效果,有助于提高个性化治疗BC。CTLA-4、PD-1, PD-L1-specific免疫检查点拮抗剂已经完全改善癌症治疗的现状。FDA已经批准了一些药物治疗各种癌症,但没有免疫检查点拮抗剂药物已被批准用于治疗乳腺癌。尽管如此,有一些CTLA-4拮抗剂和PD-1 / PD-L1拮抗剂药物,如ipilimumab,公元前avelumab, pembrolizumab,目前进入临床试验。公元前在某些患者转移,PD-1 / PD-L1拮抗剂药物被发现产生持久的临床反应,因为研究显示[10]。因此,我们的结果需要被验证在未来更多的免疫疗法治疗组。
探索司机在肿瘤基因突变将使癌症诊断和治疗方法的发展。我们也分析了相关性m6Ascore和肿瘤突变的负担。high-m6Ascore组TP53突变频率,PIK3CA, TTN最高。low-m6Ascore组PIK3CA基因突变频率,TP53, TTN最高。先前的研究显示,基因突变在公元前PIK3CA通常62年),这种突变高度异构BC。此外,在公元前人力资源+ / HER2-subtypes的比例最高,其次是HER2 +和公元前三阴性亚型(63年]。Mosele等人表明,PIK3CA基因突变人力资源+ / HER2-subtype患者预后不良,对化疗。相比之下,公元前PIK3CA基因突变三阴性亚型患者有明确的生存优势(64年]。TP53 (P53)是一种肿瘤抑制基因,经常在各种癌症突变(65年]。P53的突变在癌症会影响活动和招聘的骨髓和T细胞,导致免疫逃避,从而促进肿瘤的发生和发展。P53也能影响肿瘤的发生和发展作用于免疫细胞(66年]。作用机制的底层m6A修改这些肿瘤突变基因需要进一步分析。
我们的研究有一些局限性。首先,我们没有评估大量的临床病理特征。第二,大群BC接受治疗患者免疫治疗应该检查来验证我们的结果。
5。结论
总之,可以用来评估m6Ascore m6A修改模式和时间公元前一个患者的免疫细胞渗透特征,用于预测患者的生存结果BC。此外,免疫治疗的临床反应可以使用m6Ascore预测。我们的研究结果提供改善个性化的癌症免疫疗法。
数据可用性
BC TCGA数据集是下载的数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)和地理数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
范刘和Guijin他设计的研究。范刘和发源地于收集数据和分析并且研究。结果和讨论的所有作者同意最后的手稿。
确认
这项工作是支持的项目“FSIP1调节CD44 - / CD24 -三阴性乳腺癌细胞去分化为肿瘤干细胞”(批准号81872159)。