长非编码RNA WDFY3-AS2压制食道癌的发展通过miR-18a / PTEN轴

文摘

背景。理解lncRNAs的作用在人类恶性肿瘤的发展是必要的恶性肿瘤的靶向治疗,包括食道癌(EC)。然而,特定的角色和监管机制lncRNA WDFY3-AS2在欧共体仍然不清楚。在这里,我们审查的功能作用和调控机制WDFY3-AS2 EC。材料和方法。RT-qPCR分析应用于测量WDFY3-AS2和miR-18a EC的表达和细胞样本。荧光素酶报告和RIP化验检查WDFY3-AS2之间的关系,miR-18a, PTEN。计数时钟Kit-8 (CCK-8)进行了试验检测细胞生存能力,和transwell化验是用于测量细胞迁移和入侵。结果。Underexpression EC WDFY3-AS2被发现的标本和细胞,它预测EC患者的不良预后。Reexpression WDFY3-AS2压抑的电子商务的发展通过抑制细胞增殖,迁移和入侵。此外,WDFY3-AS2与PTEN与miR-18a负相关,积极。此外,我们发现PTEN的表达减少miR-18a模仿被WDFY3-AS2救起超表达。结论。WDFY3-AS2调节了PTEN的表达水平作为竞争内源性RNA通过骗取miR-18a EC,这表明WDFY3-AS2 / miR-18a / PTEN途径可能参与电子商务的发展。

1。介绍

食道癌(EC)是一种恶性肿瘤迅速发展和预后不良,是世界范围内最致命的疾病之一1]。EC-related风险因素包括食用含有亚硝酸胺的食物和真菌感染,以及刺激从热的食物和饮料2]。虽然已经取得了显著的进展在欧共体的治疗,如化疗和手术切除、EC患者的预后仍然贫穷,和5年生存率很低,只有10% (3,4]。因此,有必要了解电子商务的发病机理为EC和发现可能的治疗靶点。

长非编码RNA (lncRNA)是一个非编码RNA,不能编码蛋白质,和它的长度超过200个碱基对5]。先前的报道发现LncRNAs EC的发生和发展中发挥重要作用[6]。此外,有足够的证据,失调的lncRNAs调节癌症相关通路可能影响肿瘤的发展,包括电子商务(7]。例如,ZNF750参与ESCC进展和强调它的重要性作为转移和预后的生物标志物(8]。梁等人发现lnc01980充当一个致癌lncRNA调制ESCC增殖,迁移和入侵9]。此外,沈等人证实击倒AGAP2-AS1显示抑制对EC的迁移和入侵的影响通过mir - 195 - 5 - p / FOSL1通路(10]。LncRNA WDFY3-AS2第一次被发现是在肝细胞癌(增加11]。此外,WDFY3-AS2减少三阴性乳腺癌肿瘤和作为一个潜在的预后因子TNBC发展(12]。李等人表明,过度的WDFY3-AS2抑制肿瘤生长,细胞迁移和入侵(13]。据我们所知,没有报告在ESCC WDFY3-AS2进展的作用。

以前的文献表明,miR-18a显著增加在肝细胞癌(14和神经胶质瘤15]。同时,miR-18a被报道参与鼻咽癌通过抑制SMG1和激活mTOR通路16]。Nair等人显示miR-18a促进雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的增殖和迁移能力通过激活Wnt信号(17]。在EC, miR-18a EC患者的血浆中高度表达(18]。然而,很少有报道miR-18a在电子商务的作用。

在目前的研究中,我们假设WDFY3-AS2起着至关重要的作用在调节电子商务发展miR-18a和PTEN的含义。因此,我们调查的监管机制WDFY3-AS2 EC细胞增殖,调节的入侵,移民,和WDFY3-AS2之间的关系,miR-18a, PTEN。我们的研究结果可能会提供新的见解lncRNA-miRNA-mRNA在电子商务的作用。

2。材料和方法

2.1。病人

36 EC组织样本和相应的正常组织样本收集的EC患者在日照人民医院,日照,山东,中国。没有EC患者术前放疗或化疗手术前。组织样本存储在−80°C为进一步使用。所有的病人提供书面知情同意和批准的这项研究是日照人民医院的伦理委员会,日照,山东、中国(批准号2018020078)。

2.2。细胞培养

永生的食管上皮细胞细胞系和人食管癌细胞系(ECA109 YES2)从希伯来文名字购买文化集合(中国,北京)。细胞培养的RPMI 1640 (Gibco、表达载体、德国)中含有10%的边后卫在37°C公司的5%₂。完全培养基是定期更新每2 - 3天。融合的程度达到80%时,细胞分离和通道。

2.3。细胞转染

WDFY3-AS2核(si-WDFY3-AS2)或PTEN (si-PTEN)被用来推倒WDFY3-AS2或PTEN。WDFY3-AS2 WDFY3-AS2过表达质粒被subcloned到pcDNA3.1向量(pcDNA3.1-WDFY3-AS2)。MiR-18a模仿、MiR-18a抑制剂和相应的消极的控制(NC-mimic和NC-inhibitor)从GenePharma购买公司(上海,中国)。转染是使用2000年Lipofectamine执行试剂(表达载体)制造商的指示。

2.4。RNA分离和定量实时rt - pcr检测

总RNA提取使用试剂盒工具包(表达载体)制造商的指示。互补脱氧核糖核酸是由Transcriptor第一链cDNA合成装备。GoTap®qPCRMaster混合(Promega)是用来执行rt - pcr。GAPDH和U6被雇佣为内生控制通过使用2^−ΔΔCt方法。

2.5。免疫印迹分析

里帕裂解缓冲进行提取总蛋白后,制造商的指示。BCA法应用于确定蛋白质的浓度。10% sds - page凝胶电泳后,然后转移到PVDF膜,以5%的脱脂牛奶的蛋白质被封锁,紧随其后的是一夜之间主要的抗体在4°C和二级抗体1 h在37°C。最后,一种ECL检测试剂用于可视化乐队。

2.6。CCK-8化验

ECA109细胞悬浮在培养基含有10%的边后卫,培养24小时。然后,他们被播种在96孔板1×10³每口井。孵化后24、48、72和96 h, CCK-8试剂添加然后孵化有限公司₂孵化器2 h。最后,在490纳米测量光密度。

2.7。Transwell化验

3×10⁴细胞/好添加到参议院无血清检测培养基。下议院是固定的新鲜培养基补充10%的边后卫。移民化验,ECA109细胞在37°C和5%孵化有限公司₂24 h。入侵测试程序是一样的,除了参议院被涂上了一个矩阵。孵化后48 h,迁移和入侵细胞染色结晶紫为0.1%。最后,相差显微镜观察应用EC细胞。

2.8。RNA免疫沉淀反应(RIP)测定

GFP抗体和麦格纳RIP™RNA结合蛋白进行免疫沉淀反应设备进行RNA免疫沉淀反应(RIP)实验后,制造商的指示。的表现水平WDFY3-AS2和miR-18a被存在试验测量。免疫球蛋白作为消极的控制。

2.9。荧光素酶报告实验

pmirGLO-WDFY3-AS2-Mut,构造pmirGLO-WDFY3-AS2-WT pmirGLO-PTEN-WT或pmirGLO-PTEN-MuT miR-18a模仿,miR-18a抑制剂,或消极控制cotransfected进ECA109细胞使用lipofectamine 2000。转染48 h后,萤火虫荧光素酶活性测定和Dual-Luciferase记者分析系统。

2.10。统计分析

数据显示为均值±SD和分析使用SPSS 19.0或8.0 GraphPad棱镜。统计学生的差异进行评估t以及或单向方差分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。低WDFY3-AS2在EC的表达及其临床意义

我们首先研究了WDFY3-AS2 RT-qPCR EC组织样本和细胞中表达。的Downregulation WDFY3-AS2 EC组织样本中发现了比相应的正常组织样本(图1(一))。此外,WDFY3-AS2在EC细胞的表达水平也高于正常EC细胞细胞株(图1 (b))。36 EC患者分为高表达组和低表达组的平均WDFY3-AS2表达式。结果发现WDFY3-AS2的表达越高,更高的EC患者的生存时间(图1 (c))。此外,WDFY3-AS2与肿瘤分级和TNM阶段密切相关(表1)。所有结果表明WDFY3-AS2参与电子商务的进步。

3.2。Upregulation WDFY3-AS2压制的扩散、迁移和入侵EC细胞

接下来,我们调查WDFY3-AS2在EC细胞的功能作用。pcDNA3.1-WDFY3-AS2 sh-WDFY3-AS2向量采用过度表现和击倒WDFY3-AS2 ECA109细胞。如图2(一个),WDFY3-AS2表达式后ECA109细胞明显增加或减少过度或WDFY3-AS2击倒。然后,我们发现通过CCK-8 EC细胞的可行性分析。ECA109细胞转染pcDAN3.1-WDFY3-AS2显示显著减少细胞生存能力与pcDNA3.1-NC ECA109细胞转染相比,虽然能够增加ECA109细胞转染细胞生存能力sh-WDFY3-AS2(图2 (b))。Transwell迁移和入侵检测显示,过度WDFY3-AS2抑制ECA109细胞的迁移和入侵,而击倒WDFY3-AS2产生相反的影响(数据2 (c)和2 (d))。

3.3。WDFY3-AS2充当了海绵的miR-18a EC

在EC探索WDFY3-AS2的分子机制,首先进行了生物信息学分析预测可能的WDFY3-AS2结合位点。miR-18a得到候选microrna的,预测的结合位点miR-18a WDFY3-AS2如图3(一个)。然后,miR-18a被选为随后的调查。Upregulation WDFY3-AS2减少miR-18a WDFY3-AS2增加差别表达和对这些基因的表达miR-18a(图3 (b))。之后,荧光素酶报告实验和撕裂试验来验证直接绑定miR-18a和WDFY3-AS2的能力。荧光素酶分析结果显示荧光素酶活性被抑制或强化转染WDFY3-AS2-WT和miR-18a模仿或抑制剂(图3 (c))。然而,在没有响应的改变miR-18a WDFY3-AS2-Mut(图3 (d))。撕裂试验表明,WDFY3-AS2和miR-18a丰富的表情Ago2组与免疫球蛋白组(图3 (e))。结果表明,WDFY3-AS2可以直接绑定到miR-18a EC。

3.4。过度miR-18a增强扩散、迁移和入侵EC细胞

接下来,我们检测到的表现水平miR-18a EC标本,结果发现miR-18a显著增加在EC样品相比正常样本(图4(一))。考虑WDFY3-AS2之间的负相关关系和miR-18a EC组织(图4 (b)),我们调查的功能角色miR-18a EC细胞增殖,迁移和入侵。如图4 (c)ECA109细胞转染miR-18a模拟显示显著增加细胞生存能力与NC-mimic ECA109细胞转染相比,在降低ECA109细胞转染细胞生存能力miR-18a抑制剂。Transwell迁移和入侵检测显示,过度WDFY3-AS2抑制ECA109细胞的迁移和入侵,而击倒WDFY3-AS2产生相反的影响(数据4 (d)和4 (e))。

3.5。PTEN作为miR-18a的目标

TargetScan数据库被用来发现miR-18a的目标基因,和PTEN是筛选候选基因(图5(一个))。PTEN是报道不同的癌症中高度表达作为一种致癌基因(19,20.]。然后我们测试电子商务组织标本中PTEN的表达。如图5 (b),PTEN在EC组织显著增加。此外,我们发现miR-18a消极与PTEN在EC相关组织(图5 (c))。过度的miR-18a ECA109细胞中PTEN的水平下降,而击倒miR-18a PTEN表达增加(数据5 (d)和5 (e))。荧光素酶的测定结果表明,荧光素酶活性显著地抑制或强化被转染miR-18a模仿或抑制剂PTEN-WT组(图5 (f))。这些数据表明,PTEN miR-18a的直接目标。

3.6。WDFY3-AS2减毒EC通过调制miR-18a / PTEN的发展轴

接下来,救援进行了分析验证的作用WDFY3-AS2 / miR-18a PTEN在电子商务的发展。CCK-8化验发现,降低细胞生存能力造成的过度WDFY3-AS2 PTEN的差别是由upregulation miR-18a或减毒对这些(图6 (b))。Transwell迁移和入侵检测表明,EC入侵和迁移被增加紧WDFY3-AS2 upregulation miR-18a或消耗和恢复的PTEN(数字6 (c)和6 (d))。结果表明WDFY3-AS2可能抑制电子商务发展通过调节通过miR-18a PTEN。

4所示。讨论

食道癌是恶性肿瘤发生在食管粘膜,在中国是一种常见的消化道肿瘤(21]。缺乏潜在生物标志物和忽视潜在的EC患者早期症状往往会导致延迟诊断(22]。LncRNA被报道参与多种人类肿瘤的进展及预后。近年来,尽管lncRNAs研究协助临床诊断的癌症作为一个潜在的分子生物标志物,EC的效果不明显。先前的研究已经发现WDFY3-AS2 underexpressed EC患者(23),这与我们的研究结果是一致的,WDFY3-AS2减少电子商务组织和细胞。此外,我们表明,过度的WDFY3-AS2抑制细胞增殖,入侵和迁移,而抑制WDFY3-AS2显示相反的效果,表明WDFY3-AS2在电子商务发展的抑制作用。

先前的文献强调lncRNAs的关键作用和microrna在各种癌症的生物过程,包括电子商务(24,25]。在目前的研究中,我们表明,miR-18a充当了WDFY3-AS2的目标。此外,WDFY3-AS2通过抑制miR-18a PTEN表达增加。这些发现与之前的研究一致,WDFY3必经AS2结合米尔还是18和WDFY3 AS2消极监管miR-18a卵巢癌细胞中表达。MiR-18a调节在各种癌症,包括电子商务(26]。然而,在EC尚未阐明其功能的作用。在这项研究中,我们发现miR-18a EC和EC细胞组织中高度表达。MiR-18a提升EC细胞增殖、入侵和迁移和WDFY3-AS2减毒EC通过MiR-18a / PTEN的发展轴。

结果表明,PTEN参与电子商务发展。据闻PTEN在多种肿瘤有致癌的作用。例如,香等人发现PTEN抑制细胞增殖和抑制细胞凋亡在肺癌27]。此外,PTEN作为启动子在gliomagenesis通过促进细胞增殖,肿瘤的生长,抑制细胞凋亡28]。我们的研究证实,reexpression WDFY3-AS2抑制EC细胞增殖,入侵和迁移通过增加通过miR-18a PTEN的表达。然而,我们的研究在临床前阶段;所涉及的的作用机制尚不清楚。因此,建议进一步评估的其他相关生物标志物。

总之,我们的研究表明,WDFY3-AS2 underexpressed在EC和细胞样本。低表达WDFY3-AS2与EC患者的不良预后相关。此外,WDFY3-AS2抑制电子商务发展的reexpression miR-18a / PTEN轴。WDFY3-AS2可能是一种新颖的治疗和预后EC的目标。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

宋庆龄香港保证整个研究的完整性和参与写作手稿。光彩,帮派阴、库恩李和张至冬青进行实验研究,数据分析和统计分析。徐Weihao设计,监督的研究,并参与稿件的编写和审核。所有作者阅读和批准最终的手稿。

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