Y-Box结合蛋白1通过miR-29b-3p-VEGFA通路调节血管生成在膀胱癌

文摘

血管生成起着至关重要的作用在膀胱癌(BC)的发展。Y-box-binding蛋白1 (YB-1)是一个著名的癌蛋白与血管生成密切相关的肿瘤,但公元前YB-1和血管生成的关系和机制尚不清楚。基于56公元前临床标本,研究发现高表达YB-1样品表现出更高的血管内皮生长因子的表达(VEGFA)比YB-1低表达。随后,YB-1的表达和miR-29b-3p监管在公元前细胞系,我们指出,YB-1提升VEGFA表达下调miR - 29 b-3p的表达。BC细胞诱导血管生成的能力下降后YB-1被撞倒了。此外,体内的研究进一步证实,在公元前YB-1促进血管生成。我们的发现提高的理解如何在公元前YB-1促进血管生成,并提供证据YB-1公元前的治疗目标。此外,这可能提供新的灵感microrna替代疗法。

1。介绍

膀胱癌恶性肿瘤(BC)是一种普遍的威胁人类健康(1]。目前,手术是主要的治疗方法,根据病理阶段,辅以化疗或免疫疗法。然而,这种治疗方式的缺点是高成本和高复发(2]。靶向治疗可能为肿瘤的治疗提供一个新颖的解决方案,在致癌基因是重要的目标。

Y-box-binding蛋白1 (YB-1)是一个著名的癌蛋白调节肿瘤细胞生长、侵袭、转移、耐药、血管生成(3,4]。高表达患者YB-1在公元前组织显示降低总体存活率(5]。此外,我们先前的研究显示,高表达的YB-1与高临床显著相关T阶段和病理T阶段在公元前6]。因此,YB-1是一个潜在的分子目标为公元前开发新颖的治疗策略。

YB-1,冷休克蛋白家族的一员,结合DNA和RNA施加许多功能,包括调节转录和翻译,pre-mRNA拼接,信使RNA包装,非编码RNA加工、DNA修复(7]。Shuai-Lai等人发现YB-1可以表达下调的表达miR-29b-3p通过抑制miR-29b-2生物起源的多形性胶质母细胞瘤(8]。此外,miR-29b被称为肿瘤抑制小分子核糖核酸(microrna),扮演重要的角色在阶段从起始到癌症转移(9]。调制的YB-1 mir-29b-3p可能YB-1肿瘤促进效应的一个重要的方面。在这里,我们分析了目标基因的miR-29b-3p miRDB (http://www.mirdb.org)和确定1034年预测的目标hsa-miR-29b-3p miRDB [10]。我们进一步分析了浓缩KEGG-PATHWAY使用前200个目标基因的功能注释图表大卫的生物信息学资源6.8 (https://david.ncifcrf.gov)[11]。因此,我们发现有10个基因通路的癌症。最重要的一个是血管内皮生长因子(VEGFA)。我们知道,高表达的VEGFA促进肿瘤的生长和转移通过促进血管生成(12]。此外,VEGFA是公元前的重要标志13]。因此,我们假设“YB-1上调VEGFA表达式通过抑制公元前miR-29b-3p促进血管生成的生物起源”。

本研究规范的表达YB-1公元前和miR-29b-3p细胞系和证明YB-1促进VEGFA表达下调miR-29b-3p在公元前的表达。这些发现提供了洞察YB-1的致癌作用在血管生成和提供证据YB-1公元前的治疗目标。可以说,这一研究中,首次报道的影响YB-1 VEGFA从的角度调节microrna。这可能会提供一个新的视角microrna替代疗法。

2。材料和方法

2.1。组织和临床数据

根治标本的病理信息,2017年1月至2018年1月调查选择BC标本病理部门的兰州大学第二医院。值得注意的是,膀胱腺癌和鳞状细胞癌被排除在外。分析YB-1和VEGFA的表达,免疫组织化学(包含IHC)上执行所有选定BC标本。公元前包含IHC研究人类样本由兰州大学第二医院伦理委员会批准。

2.2。细胞培养

公元前人类细胞株EJ、UMUC3 SW780 RT4,人类内皮细胞系EA.hy926。细胞系都从细胞库购买,中国科学院。所有细胞都进入RPMI 1640培养基培养(Gibco,宏伟的岛,纽约)含10%胎牛血清(锅、德国)在一个孵化器有限公司为5%₂大约在37°C。

2.3。转化细胞系转染的建设和稳定

敲下来的表达YB-1 YB-1 EJ细胞高表达,pGPU6 / GFP Neo-YB-1-shRNA(目标序列、5′- GAAGTACCTTCGCAGTGTAGG-3′)和pGPU6 / GFP / Neo-NC-shRNA(目标序列,5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′;NC -控制)从上海GenePharma购买。24-well板EJ细胞转染了含有不同比例的混合物Lipofectamine 2000(上海GenePharma中国)和成分根据制造商的协议。基于绿色荧光细胞的比例,转染效率测定转染后在荧光显微镜下24 - 48小时。在所有的情况下,转染效率低于10%。因此,我们构建稳定的转化细胞用G418(400行μg / ml)和当地的胰蛋白酶消化。多次选择,稳定转化细胞系G418抗性和GFP最终被建立。敲下来的表达YB-1 UMUC3细胞系和miR-29b-3p YB-1击倒EJ细胞,核和microrna的抑制剂5-carboxyfluorescein GenePharma (5-FAM)是购自上海。列出的序列如下:YB-1-siRNA向前,5′-GAAGUACCUUCGCAGUGUAGG-3′和反向,5′- CCUACACUGCGAAGGUACUUC-3′;NC-siRNA向前,5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和反向,5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′;miR-29b-3p-Inhibitor 5′- AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3′;NC-Inhibitor 5′- CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。在细胞培养中65 - 75%的细胞融合菜肴直径6厘米被转染200 pmol siRNA /抑制剂和10μl Lipofectamine 2000根据制造商的协议。此外,我们建立了模拟小组由10只转染μl Lipofectamine 2000。可拆卸的效率是评价RT-qPCR转染后48小时,通过免疫印迹转染后72小时。

2.4。RNA提取和RT-qPCR

试剂盒试剂(豆类、大连、中国)被用来从所有细胞中提取总RNA。信使rna和microrna转化成cDNA PrimeScript RT试剂盒(豆类)和米尔X microrna的第一链合成装备(豆类),分别。RT-qPCR(生物检测Rad CFX96)是由结核绿色预混料Taq交货(豆类)。数据归一化、GAPDH和U6 (RNU6B)核内小rna作为内生控制mRNA和microrna。相对基因表达被ΔΔCq评估方法(14]。引物的序列补充材料(表中列出1)。

2.5。免疫印迹

细胞在一个25厘米²细胞培养瓶或细胞培养皿直径6厘米是使胰蛋白酶化和用PBS。随后,离心沉淀的细胞被70 - 200细胞溶解μl冰冷的里帕细胞裂解缓冲根据沉淀体积。细胞溶解产物(10 - 15μl)分离12% sds - page凝胶和electroblotted到硝化纤维膜。抗体YB-1(美国Abcam ab76149) VEGFA (19003 - 1 - ap, Proteintech Group Inc .)、美国),GAPDH (60004 - 1 - lg、Proteintech Group Inc .)、美国),和荧光二次抗体对老鼠或兔子(美国Licor)稀释500,500,15000,和15000次孵化硝化纤维膜,分别。GAPDH作为内生控制。最后,分析是由《奥德赛》CLX近红外既荧光成像系统。

2.6。细胞增殖实验

细胞增殖是由细胞计数评估装备量8 (CCK8;Dojindo实验室、熊本、日本)分析根据制造商的协议。大约5×103个细胞被播种在96年的好板/好和养殖有限公司₂孵化器。在每个时间点2、24和48小时后细胞被播种,细胞增殖试剂添加到96孔板,细胞被孵化前2小时测试。2小时的时间点是基点。

2.7。集落形成实验

细胞使胰蛋白酶化、计算和播种在6-well板密度200细胞/。培养基是每4天更换一次。文化并不是终止,直到播种后的第14天,当大多数细胞形成可见的殖民地。细胞被固定为4%多聚甲醛固定剂和染色GIMSA污渍。然后,殖民地数和集落形成率计算方程:集落形成率=(殖民地的数量/ 200)×100%。

2.8。管网络形成分析

大约5×10⁵YB-1击倒EJ细胞细胞系(YB-1 KD-EJ)或控制EJ细胞系(CTRL-EJ)被播种,在细胞培养中培养菜直径6厘米,分别。附加3小时后,细胞与PBS洗两次,然后采用无血清培养RPMI 1640中24小时。此后,RPMI 1640应承担的介质在细胞培养中菜分别收集即时使用或存储在−20°C。

8-strip PCR管被削减的帽条特殊的基底膜基质容器。灭菌后,这些特殊的容器被困96孔板的底部。然后,10μl基底膜基质被添加到每个容器。人工基底膜允许聚合在37°C 1小时。之后,EA.hy926细胞使胰蛋白酶化,洗和计算。最后,细胞无血清培养基的细胞被resuspended收集之前和播种与特殊井基底膜基质容器1×10的密度⁴细胞/ 100μl /。管形成最佳12人力资源文化后,图像被抓获。EA.hy926细胞形成的网格和节点的数量在每个计算。

2.9。在裸小鼠肿瘤形成

前不久雄性BALB /c裸体小鼠的无菌(SPF)年级从北京购买重要河流实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)。所有动物程序符合国家卫生研究院指导实验室动物保健和使用的。动物实验动物保健福利委员会批准甘肃中医药大学。

老鼠老鼠,分为两组(6 /组),是皮下注射YB-1 KD-EJ细胞或CTRL-EJ细胞(2×10⁶细胞/ 0.15毫升)。我们测量了肿瘤长度和宽度与外部卡尺每3天计算肿瘤体积。肿瘤体积的计算公式:V=(长×宽²)/ 2。老鼠牺牲,肿瘤被切割时,肿瘤体积达到2.0厘米³接种后,或40天。

2.10。免疫组织化学

通过执行包含IHC streptavidin-peroxidase (SP)方法。严格按照试剂指令执行的过程,用已知的积极部分作为积极的控制和PBS负控制而不是一种抗体。

高压蒸汽水浴抗原修复了。抗体YB-1(美国Abcam ab76149) VEGFA (19003 - 1 - ap, Proteintech Group Inc .)、美国),和CD31(美国CST # 77699)标记微血管都孵化病理部分稀释300倍。

2.11。免疫组织化学分析

评估的表达YB-1 VEGFA,正面彩色癌症细胞的比例和强度进行了评估。积极的比例估计彩色癌细胞与积极率得分(1 = 0 - 25%,2 = 26% - -50%,3 = 51% - -75%,4 = 76% - -100%)。分数代表平均强度估计的染色强度阳性癌细胞(0 =没有,1 =弱,2 =温和,和3 =强烈)。然后,积极率得分时间强度得到总分得分。我们添加了三个不同领域的得分在一个样本获取IHC得分。基于IHC得分,样本平均分为YB-1高表达组和YB-1低表达组。相同的实例数和样品包含IHC分数在中间,病理学家将重新判断YB-1为了集团的表达水平。最终,VEGFA表达两组之间的差异进行了分析。

2.12。统计分析

我们使用GraphPad棱镜8软件分析统计学意义。包含IHC分数的意义被Mann-Whitney U检验测试。对另一些人来说,意义是检查学生的t以及。 被认为是具有统计学意义。IHC分数所描述的中位数±四分位数。其他数据都表示为平均数±标准差(一式三份的决心)。

3所示。结果

3.1。YB-1高表达样本有较高VEGFA表达式比YB-1低表达

总的来说,58标本根治。两个样本排除由于膀胱腺癌和鳞状细胞癌的病理诊断。因此,56个手术标本包括包含IHC。结果表明,YB-1高表达组(YB-1 H) VEGFA表达高于YB-1低表达(YB-1 L)。的中值VEGFA包含IHC分数在H和L YB-1 YB-1 18岁和15日分别(图1)。

3.2。miR-29b-3p VEGFA表达的减少而增加,YB-1撞倒后在BC细胞系

首先,在EJ YB-1决心的表达,UMUC3, SW780,公元前RT4细胞线。因此,四个细胞系的表达YB-1 EJ > UMUC3 > SW780 > RT4(图2(一个))。接下来,稳定的转化细胞行CTRL-EJ和YB-1 KD-EJ有效建立。结果显示,VEGFA表达降低了一半以上,而miR-29b-3p表达式YB-1撞倒后翻了一番EJ细胞系(数字2 (b)- - - - - -2 (d))。确认这种情况的普遍性在公元前细胞系,YB-1进一步撞倒在UMUC3使用核。这是一个类似的情况(数据2 (e)- - - - - -2 (g))。结果表明,YB-1积极监管VEGFA但负面miR-29b-3p监管。

3.3。YB-1撞倒后,EJ细胞诱导血管生成的能力减弱,集落形成和扩散能力保持不变

探索YB-1在公元前的影响,这项工作评估的能力CTRL-EJ和YB-1 KD-EJ细胞系建立殖民地,增殖,诱导血管生成。CCK8化验结果显示这一趋势的扩散能力YB-1 KD-EJ细胞低于CTRL-EJ细胞,但没有统计学意义(图3(一个))。集落形成试验结果表明,CTRL-EJ和YB-1 KD-EJ细胞有类似的集落形成能力意味着CTRL-EJ集落形成率和YB-1 KD-EJ细胞是38.5和34.3,分别为(数字3 (b)和3 (c))。调查的角色的能力YB-1 EJ细胞诱导血管生成,管网络形成试验使用EA.hy926执行细胞在方法部分描述的特殊容器。所有的网格和容器的管网络的节点数。此外,地铁网络CTRL-EJ组明显密度比在YB-1 KD-EJ组(图3 (d))。统计数据表明,网格和管网络的节点YB-1 KD-EJ组分别为25%和50%不到CTRL-EJ组,分别为(图3 (e))。结果表明,EJ细胞诱导血管生成的能力,而不是集落形成和扩散,后被削弱YB-1被撞倒了。

3.4。VEGFA miR-29b-3p时增加的表达抑制YB-1 KD - EJ细胞

如前所述,VEGFA的表达下调,而miR-29b-3p调节YB-1撞倒后在公元前两个细胞系。更重要的是,VEGFA预测的目标基因的miR-29b-3p TargetScanHuman 7.1 (http://www.targetscan.org)。此外,miR-29b-3p可能绑定序列(UGGUGCU) 3′UTR VEGFA函数(图4(一))。因此,miR-29b-3p抑制检查如果VEGFA可以逆转的表达在YB-1 KD-EJ细胞。因此,VEGFA的表达调节miR-29b-3p抑制后(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。

3.5。YB-1击倒后,BC模式增长放缓和肿瘤的微血管密度降低体内

共有12个雄性BALB / c裸小鼠皮下注射CTRL-EJ细胞或YB-1 KD-EJ细胞随机。八天之后,所有的小鼠在注射部位可见肿瘤。然而,肿瘤YB-1 KD-EJ细胞比CTRL-EJ增长较慢的细胞。的平均肿瘤重量CTRL集团和YB-1 KD-EJ组是327.3毫克和75.5毫克,分别(数据5(一个)- - - - - -5 (c))。此外,CTRL-EJ组的肿瘤微血管密度明显比YB-1 KD-EJ组。的平均微脉管密度CTRL集团和YB-1 KD-EJ组42.1和14场,分别(数据5 (d)和5 (e))。结果表明,YB-1促进BC体内的生长和血管生成。

4所示。讨论

癌蛋白,YB-1报道转移到核促进肿瘤发展和广泛调节各机制VEGFA在转录水平的表达(15,16]。然而,YB-1可以说是胞质蛋白,主要在细胞质中扮演的角色。大胆的,可能会有一个机制YB-1调节VEGFA表达式在细胞质中。阿等人证实,YB-1提高低氧诱导因子1α的翻译(HIF1A)通过直接绑定信使rna编码HIF1A,强烈促进转录的VEGFA [17]。除了这,很少有报道YB-1调节VEGFA表达式在细胞质中。在这项工作中,我们发现YB-1促进VEGFA的表达通过阻断的生源论miR-29b-3p在公元前8]。这也许可以解释的广泛监管VEGFA YB-1。可以说,第一次,我们报道的影响YB-1 VEGFA从的角度调节microrna。

血管生成在公元前的发展起着重要的作用。例如,公元前窄带成像膀胱镜检查的理论基础是公元前组织微血管密度高于正常场(18]。此外,VEGFA,促进血管生成的一个重要因素,是公元前肿瘤标志物的筛选和预测肿瘤淋巴转移(13,19]。目前,抗血管新生药物具VEGF单克隆抗体或VEGFR和仍在公元前的临床试验阶段。试验表明,疗效不满意。目前的研究结合这些抗血管新生药物与化疗药物产生更好的结果(20.]。多项证据表明,YB-1与许多肿瘤的血管生成,但它一直在公元前[很少报道15]。我们执行包含IHC在公元前56个标本,发现样本的高表达YB-1表示VEGFA比YB-1的低表达。这表明YB-1可能涉及公元前的血管生成。此外,YB-1参与公元前的耐药性机制(4,21]。YB-1可能参与公元前耐药性和血管生成,并研究YB-1可能在公元前的治疗有明显的潜在价值。

足够的证据表明YB-1结合非编码rna在细胞,但有有限的证据表明,YB-1影响相关成熟的microrna的表达。Blenkiron等人报道,YB-1结合let-7和mir - 320的前兆,但推倒YB-1并未改变成熟microrna表达水平在乳腺癌细胞系(22]。相比之下,Shuai-Lai等人发现YB-1不仅可以绑定microrna前体,而且miR-29b-3p的表达变化,let-7-3p和其他microrna在胶质母细胞瘤细胞系。他们进一步证实YB-1广泛结合终端循环地区的革命制度党/ pre-miR-29b-2和调节miR-29b-2生源论,可以加工成miR-29b-3p [8]。不同的结论可能归因于不同的细胞系和平台用于实验。例如,不同的细胞系可能有不同的YB-1转译后的修改,如磷酸化的水平。然后,YB-1与不同的转译后的修改功能不同,导致不同的功能在绑定microrna前体(23- - - - - -25]。然而,microrna组学变化在公元前细胞系YB-1敲除或击倒后仍然可以理解。我们的研究表明,推倒YB-1导致约两个upregulation miR-29b-3p在EJ和UMUC3细胞株的表达。这表明YB-1可能绑定到革命制度党/ pre-miR-29b-2和块miR-29b-2生物起源的BC。不可否认的是,YB-1是否普遍涉及的microrna在公元前的形成需要进一步研究RNA免疫沉淀反应和microrna的芯片。

miR-29b miR-29家庭数量,着重报道作为一个肿瘤抑制在许多研究中,并已被证明调解多个致癌过程,包括代谢、扩散、转移和血管生成26,27]。本研究发现,YB-1会使miR-29b-3p的表达。此外,我们注意到增加VEGFA miR-29b-3p抑制。除了VEGFA,抑制miR-29b可以移植其他癌基因蛋白的表达,种能阻碍DNMT3b如LOXL2, MMP2在某些癌症28- - - - - -30.]。因此,减少miR-29b-3p可能调节公元前的发展和在公元前的治疗是一个重要的目标。各种各样的microrna替代疗法在治疗公元前表现出巨大的潜力。然而,一些障碍有待克服(31日,32]。本研究表明,在公元前miR-29b-3p细胞的表达是调节通过抑制pri / pre-miR-29b-2和YB-1之间的互动。这提供了一个新颖的视角microrna替代疗法(33]。例如,通过引用YB-1,我们可以作些药物增加肿瘤细胞的肿瘤抑制microrna的内容。

报告显示,YB-1促进或抑制肿瘤细胞的增殖;然而,这种双重效应的机理仍不清楚。它对扩散的影响可能取决于细胞类型(34]。后推倒YB-1 TCCsup KK47 BC细胞系,Lyabin等人发现了细胞增殖能力明显下降(35]。这里,推倒YB-1 EJ细胞之后,我们没有发现显著改变扩散能力。此外,基于EJ细胞的集落形成能力,发现无显著减少后的克隆形成率YB-1击倒。在体外和体内实验表明,EJ细胞诱导血管生成的能力明显减弱后YB-1击倒。此外,肿瘤的生长模型YB-1击倒后慢了下来。基于上述情况,我们建议肿瘤诱导血管生成的能力受损YB-1击倒后,导致营养不良,进一步抑制肿瘤的生长。

5。结论

在这项研究中,我们证实了假设YB-1促进VEGFA的表达下调miR-29b-3p BC细胞系。此外,YB-1促进血管生成BC在体外和体内。最后,我们推断YB-1通过miR-29b-3p-VEGFA通路调节血管生成在公元前。这可能帮助我们理解公元前YB-1促进发展的机制,并提供证据YB-1公元前的治疗目标。公元前microrna替代疗法港很大潜力的疗法。灵感来自YB-1调节miR-29b-3p的机制和效果,可以服用一些药物来增加肿瘤细胞的肿瘤抑制microrna的内容指YB-1。因此,进一步的调查的细节YB-1绑定pri / pre-miRNA是至关重要的。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

东阳市高和钱妞妞了同样的工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81672519)和Cuiying兰州大学第二医院的科技创新项目(CY2018 QN13应承担和2020 qn-09)。

补充材料

表1:引物序列。(补充材料)

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