文摘
背景。大量的证据表明,肿瘤浸润淋巴细胞(尖)与患者预后有关。TIL-based免疫评分(是)在各种癌症预后的影响,但是它对胃癌预后的影响(GC)患者辅助化疗仍不清楚。方法。101 GC胃切除术后接受化疗的患者进行回顾性分析。免疫组织化学染色对CD3 +和CD8 + t细胞计数肿瘤中心(CT)和入侵保证金(IM)地区是内置的。患者被分成三个小组基于微分水平。和临床参数之间的相关性进行了分析。参数和临床预后的影响评估使用kaplan meier和Cox比例风险回归分析分析。接受者操作特征(ROC)曲线绘制比较曲线下的面积(AUC)是与其他临床参数。列线图的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)预测建立了基于所确定的参数。结果。最后,20例(19.8%),57 (56.4%)、GC和24例(23.8%)患者认同低,中间,分别和高水平。GC是程度更高的患者表现出更好的DFS (< 0.001)和操作系统(< 0.001)。是DFS(是一个独立的预后因素< 0.001)和操作系统(在多变量分析< 0.001)。提出了一个更好的预测能力比传统的病理tumor-node-metastasis pTNM分期系统(AUC: 0.801和0.677和0.800和0.660,分别)对DFS和操作系统。DFS的诺模图和操作系统预测的c指数是0.737和0.774,分别。结论。是一个强有力的预测因素DFS和OS GC辅助放化疗患者,可以补充传统pTNM分期系统。
1。介绍
胃癌(GC)是第五个最常见的恶性肿瘤与第三世界死亡率最高(1]。尽管现代筛选方法的创新,新兴新药和多学科管理,GC患者的预后仍然贫困(2- - - - - -4]。美国癌症联合委员会/ tumor-node-metastasis与/ TNM分期系统现在广泛实现GC治疗在临床实践中5]。然而,由于肿瘤的异质性,病人在同一TNM阶段仍可能有不同的临床结果。自从预后TNM分期系统提供的信息不足,许多研究已经转向其他标记,如肿瘤生物标记、分子特性,或基因签名(6,7]。然而,只有肿瘤的内在特性被认为是在这些措施,无论肿瘤微环境(时差)。时间是宿主免疫反应发生。它的分量是相当复杂,包括各种免疫细胞、成纤维细胞和肿瘤脉管系统(8,9]。肿瘤浸润淋巴细胞(尖),关键部件的时间,现在已经被证明是强烈与在各种癌症患者的预后相关(10- - - - - -13]。量化直到渗透,建设免疫得分(是)。Galon等人提出了“Immunoscore®”系统在结肠癌,并结合CD3 +和CD8 + t细胞密度和侵入性肿瘤中心保证金(14- - - - - -16]。持有的国际共识验证Immunoscore®页面等人强调其强大的舞台》结肠癌患者的预后的影响(17]。两个大群组研究还暗示III期结肠癌患者高Immunoscore®获得更多受益于化疗(18,19]。免疫评分(是)也一直在研究肺癌、胆管癌、宫颈癌、胃癌等肿瘤(20.- - - - - -25]。
研究的是胃癌是试图在几个方面。江等人选择了5 (CD3invasivemargin (IM),CD3centeroftumor (CT),CD8即时通讯,CD45 roct,CD66 b即时通讯27岁)免疫功能使用套索模型构建系统(26]。张等人联合瘤内和间质尖评分系统(27]。最近,云等人采用相同的协议页面等人建立系统阶段II / III GC病人5-FU-based后辅助化疗(28]。尽管准确的评分方法在不同的研究都是不一样的,是基于不同的免疫细胞密度在不同的位置被发现有潜力在胃癌预后价值。然而,大多数的研究一直局限于GC只接受辅助化疗的患者,同时接受辅助化疗的患者被排除在外。是系统是否这些患者预后的预测仍然是未知的。
在这项研究中,我们开发了一个系统在GC病人使用免疫组织化学辅助放化疗治疗胃切除术后,旨在探索的预后意义。
2。材料和方法
2.1。病人
我们回顾了可切除的胃癌患者接受治疗手术后放化疗在我们研究所从2006年到2015年。入选标准如下:(1)组织学证实胃腺癌,(2)接受治疗胃切除术与D2淋巴结清扫后,(3)没有收到术前治疗,(4)接受辅助化疗,(5)足够的formalin-fixed和石蜡包埋组织块(FFPE)可以收集,和(6)完整的临床资料。病人诊断为转移病灶被排除在外。患者没有足够的FFPE组织块也被排除在外。所有这些GC患者接受治疗D2胃切除术与R0切除辅助放化疗紧随其后。总剂量45 Gy交付25分数,每周5天。患者接受氟尿嘧啶持续输注(225毫克/米2)或口服卡培他滨(625毫克/米2)每天两次与放疗同时从每周1到5天。氟尿嘧啶化疗进行放疗后在1 - 2周期和4 - 6周期。患者临床病理的信息检索,如年龄、性别、肿瘤东部合作组(ECOG)表现分,肿瘤位置、病变大小、胃切除术,术后血清乳酸脱氢酶(LDH)水平,癌胚抗原(CEA)水平,组织学分级,淋巴管和血管侵犯(LVI),神经周的入侵(句),Borrmann分类、pT和pN登台。Borrmann分类包括I型(息肉状类型)、II型(溃烂类型划分保证金),类型III(与外围渗透溃烂类型),和IV型(弥漫性浸润类型)29日]。病理阶段分类是基于8日版的美国癌症联合委员会(与)。所有患者随访至少3年,复发和死亡的信息记录。无病生存期(DFS)被定义为时间的长度没有手术后复发的生存。总生存期(OS)之日起计算手术死亡的日期。本研究通过上海复旦大学癌症中心的伦理委员会。书面通知同意了从所有患者纳入本研究。
2.2。免疫组织化学
对于每一个病人,一个肿瘤组织块选择肿瘤和侵入性利润和制成4μ米厚的石蜡包埋组织部分。两个组织部分与二甲苯脱蜡和患者减少酒精浓度梯度。内源性过氧化物酶活性被3%的过氧化氢,持续15分钟。抗原检索进行了20分钟的船与柠檬酸抗原检索解决方案(pH值6.0)。非特异性抗原被封锁10%正常山羊血清1小时37°C。然后,组织部分与anti-CD3孵化抗体(ab5960山羊multiclonal 1: 200年,Abcam,剑桥,英国)和anti-CD8抗体(# 70306,鼠标单克隆,1:500年,细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)在一夜之间湿盒4°C。随后,二级抗体(GK5005 GTVision™检测系统/ Mo&Rb,基因技术,上海,中国)是孵化为30分钟37°C,和diaminobenzidine (DAB)是用于色原反应。上述所有步骤之后,所有的部分都复染色hematoxylin-eosin解决方案和增加二甲苯和酒精梯度脱水的解决方案。
2.3。免疫分建设
最后,染色组织切片在光学显微镜下检查。彩色的部分都是独立的被两个观察者对临床信息也不清楚。我们发现肿瘤中心(CT)和入侵保证金(定义为瘤旁区宽度为0.6毫米,IM)低于200×放大和选择3代表从每个字段。CD3 +、CD8 + T细胞的数量在每个3字段被手动计数量化使用ImageJ软件v1.8.0 (Rawak软件公司,斯图加特,德国)。每个区域的细胞密度表示的意思是细胞计数3字段200×放大。然后,我们建立了基于提出的建议页面等。对于每个案例,CD3 +和CD8 + t细胞密度相比,整个集团和转换成百分位数。四个百分位数的均值(两个从CT和两个IM)被翻译成免疫得分。基于three-category免疫分分类,0∼25%属于低,25%∼70%被归类为中间,70∼100%是归类为高。
2.4。统计分析
标记之间的关系进行了分析使用枪兵的相关测试。r≤0.5 > 0.8,r< 0.8,r< 0.5分为高、中等和低的相关性,分别。水平和临床病理因素之间的相关性进行了研究使用皮尔逊卡方检验或确切概率法。比较组间的生存,发展kaplan - meier曲线。操作系统和DFS的预后因素被确定使用单变量和多变量Cox回归分析。变量与值< 0.1在单变量分析中进一步的多变量分析。预后列线图是构建基于这些因素,以及他们的预测性能评估了bootstrap-corrected哈勒尔的一致性指数(c指数)和校准曲线。比较之间的预测能力参数,生成一个接受者操作特征(ROC)曲线,和曲线下的面积(AUC)值的计算。上述分析使用IBM SPSS 25.0(美国纽约阿蒙克的IBM Inc .), GraphPad棱镜9 (GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国),和R软件v4.0.5 (R项目统计计算,维也纳,奥地利)。生存包、rms包和时间民国包被用于R软件。所有值都是双面的。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。临床病理特征
总的来说,101 GC接受辅助化疗的患者包括在我们的研究中。他们有良好的性能状态(ECOG 0 - 1)有61.4%呈现ECOG 0。都是二期(21.8%)或三期(78.2%)7日与/ TNM分期系统,平均年龄为55岁(范围27 - 77)。少数病人显示术后LDH水平(8.9%)或CEA水平升高(6.9%)。大多数病变(57.4%)位于胃的下部,和肿瘤大小中值为4厘米(范围1 - 15厘米)。大多数病人(65.3%)接受了全胃切除术。Borrmann III型(65.3%)、差分化等级(66.3%)、LVI积极性(62.4%),和句积极性(61.4%)是最常观察到的特征(补充表1)。中位随访时间为73.7个月(范围3.6 - -144.4个月),58复发和58例死亡发生在这一时期。
3.2。尖和免疫分
CD3 +和CD8 + t细胞数量在每一个地区从彩色量化组织部分(代表图片所示的数据1(一)-1(e)))。中位数计数/ 20×CD3-CT放大,CD3-IM, CD8-CT,和CD8-IM 123(范围30 - 420),130(25 - 406),110(10 - 323)和103年(10 - 282),分别为(补充表1)。CD3 +和CD8 +细胞数略高于CT地区在IM地区。CT地区CD3 +细胞的密度是适度与IM地区(r= 0.680,< 0.001)。相同的结果中观察到的CD8 +细胞(r= 0.681,< 0.001,补充图1(模拟))。免疫分数被构造成之前定义的基于平均百分位数。病人的数量分为低、是int和高20(19.8%),57例(56.4%),分别为24例(23.8%)。探索和临床参数之间的关系,和较低的患者有更高的pT阶段(= 0.006),更高的pN阶段(= 0.023),高pTNM阶段(= 0.009),较大的病变(= 0.029),更有可能是LVI积极(= 0.020)。虽然没有统计学意义,患者往往有较低的低分化等级(= 0.092)(表1)。
3.3。是和预后
接下来,生存曲线是drawnfor歧视。一个更高的水平表示更好DFS (p < 0.001)和操作系统(p < 0.001)。DFS中位数和中位数OS高组患者没有达到。DFS中值较低,是中级(是int)组是17.0个月(标准差,SD±3.1)和40.7个月(SD±12.6),分别。操作系统中值较低,是int组是20.4个月(标准差,SD±0.5)和49.4个月(SD±9.1),分别(数据2(一个)和2 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
单变量和多变量Cox回归分析确定所有GC患者预后因素纳入本研究。单变量分析表明,CEA水平(= 0.008),手术类型(= 0.002),病灶大小(= 0.076),分化等级(= 0.014),pTNM阶段(= 0.001),Borrmann分类(= 0.071),(< 0.001)与DFS都相关。只有pTNM阶段(= 0.026)和(< 0.001)仍然是重要的在多变量Cox回归分析。在系统分析中,我们观察到类似的结果。年龄(= 0.094)、CEA水平(= 0.011),手术类型(= 0.002),病灶大小(= 0.035),分化等级(= 0.011),pTNM阶段(= 0.001),Borrmann分类(= 0.103),句(= 0.099),(< 0.001)都是在单变量分析与操作系统有关。然而,只有年龄(= 0.005),pTNM (= 0.029),(在多变量分析< 0.001)仍然重要。这些结果表明,是一个独立的预后因子对DFS和操作系统(表2和3)。
3.4。亚组分析基于阶段
当分层阶段,是一个强有力的预后因子在第三阶段GC患者(< 0.001 DFS和< 0.001操作系统),而不是在第二阶段GC患者(= 0.398 DFS和OS) = 0.397(数字2 (c)和2 (d))。在所有患者中,第三阶段GC患者低水平最差的生存。阶段III GC高水平也有类似的患者预后II期GC患者(DFS = 0.718;= 0.934操作系统)。
3.5。参数和预后的预测能力诺模图施工
曲线下的面积(AUC)计算评估预测能力的识别参数多变量Cox回归分析(数据3(一个)和3 (d))。使用3年截止,预测能力是(AUC分别为0.801和0.800 AUC)明显高于pTNM分期(AUC分别为0.677和0.660 AUC)对DFS和操作系统。年龄的AUC是0.601操作系统的预测。虽然AUC值改变随着时间的推移,预测能力的是总是高于pTNM分期系统。DFS的诺模图和操作系统使用识别参数(数据预测了4和5)。内部使用引导方法进行验证。DFS的bootstrap-corrected c指数的模型和操作系统预测为0.737 (95% CI, 0.729 - -0.745)和0.774 (95% CI, 0.763 - -0.783),分别。校准曲线计算图表显示的良好一致性预测实际上观察到1 -,3 -,5年DFS和操作系统(图6)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
4所示。讨论
胃癌是一种高度异构癌症预后不良。相同的与患者/ TNM分期可以表现出完全不同的临床结果。因此,预后与所提供的信息/ TNM分期是不够的。我们需要更多的信息来指导治疗策略在临床实践中。肿瘤微环境,宿主抗肿瘤免疫反应发生时,由不同的组件,如免疫细胞、成纤维细胞和上皮细胞。大量研究表明,浸润淋巴细胞与患者预后密切相关(30.,31日]。免疫得分,作为一个尖的定量评价方法,已经被广泛讨论。基于密度和位置的CD3 +和CD8 +细胞,Galon等人成功建立免疫评分系统在结肠直肠癌12]。最近,共识Immunoscore®结肠癌在一个大型国际验证,前瞻性多中心临床试验,表明是复发是一个独立的预后因素17]。在胃癌中,以前的研究也证明了免疫细胞的预后的影响,如CD3 +、CD8 + Foxp3, CD45RO细胞(32- - - - - -35]。然而,很少有研究报道免疫在GC得分,在那些发表论文和施工方法不同。更重要的是,没有研究报道之间的关联和GC接受辅助化疗的患者。
在我们的研究中,我们获得的CD3 +、CD8 +细胞密度从不同位置使用免疫组织化学。CD3是T细胞的特定标记,CD8细胞毒性T细胞特定的标记。他们最常用的标记在先前的研究中,和胃癌的研究已经证实了他们在预后预测中的作用。结合CD3 +和CD8 +细胞密度在一起,直到渗透水平反映。计数这两个标记在两个不同的位置是获得肿瘤染色部分。一个温和的标记之间的相关性被发现。达成共识关于免疫分建设尚未达到在胃癌。在一些研究中,一个截断值,通常(中位数22,36),给出每个标记区分低渗透水平(得分0)和高渗透水平(得分1)。通过结合2标记2地区一起,患者获得0 - 4的得分。然而,中值可能不是最好的切断值,以这种方式和信息可能会丢失。在这项研究中,我们建立了系统使用共识Immunoscore®等。具体的修改页面整体免疫渗透状态揭示了免疫细胞计数转换的百分位数。基于水平,我们分类患者分为3组,即低(20岁的19.8%),是中级(57岁的56.4%)和高(24岁,23.8%)。每组的患者数量相对平衡。通过分析,我们发现,降低高与TNM阶段,大的病变,LVI-positive状态和低分化等级。似乎一个较低的水平是与肿瘤负荷重,通常与先前的研究一致。在这项研究中,我们探索的预后影响。kaplan meier曲线分析表明,预测了DFS和操作系统< 0.001。仍然是一个独立的预后因素多变量Cox回归分析。高水平表明更好的DFS和操作系统,这也与以前的研究一致。此外,分数是一个更好的预测参数比TNM分期系统。是可以用来补充TNM分期系统,帮助确定病人可以受益于辅助放化疗。预后诺模图建立了使用Cox回归分析所确定的参数。他们两人有一个良好的预测性能与c指数> 0.7,和相应的校准曲线显示良好的结果。
亚组分析也执行。分层的阶段时,我们发现了一个在III期预后的影响但不是阶段II GC的病人。这个结果可能是由于小样本大小只有22 II期GC的病人。其中,中级水平,患者只有14 8高水平的患者,没有患者低水平。确定确切的预后的影响,我们需要更多的II期GC病人在未来。III期GC患者,那些高水平表现出最好的生存,没有比第二阶段的GC患者(DFS = 0.718,= 0.934操作系统)。尽管没有阶段II GC患者低级别包含在这里,这个结果还需要验证在较大的样本,它可能表明,GC III期患者高别人的表现出截然不同的生物学行为。这可能帮助引导分层治疗,以避免可能的治疗方案。
总之,是证明是一个强有力的预后指标GC病人在我们的研究中。高水平,这意味着更高的直到渗透,是与一个更好的预后。然而,如何使用免疫评分指导治疗仍不清楚。在结肠癌的研究发现,那些受益于更多的辅助化疗周期高水平与低水平而不(17,18]。这可能表明需要更积极的治疗患者GC高水平,应该探索在未来。此外,自从abscopal效果显示的巨大潜力辐射对免疫系统的激活,辐射和免疫疗法的结合已经成为现在的热点问题(37,38]。研究的数量直到渗透在immunotherapy-treated病人预后的影响进行(39,40]。我们应该期待的潜力TIL-based指导免疫疗法,甚至其结合放疗。
本研究仍有局限。首先,这是一个单中心回顾性分析临床应用有限的证据。第二,相对较小的样本量可能导致偏见。第三,手工染色细胞计数,这人为错误不能被忽视。第四,我们可能会包括更多的免疫标记如CD45RO、Foxp3, PD-L1改善。此外,像her - 2基因签名和海量存储系统(MSS)中状态也可能包括探索其与肿瘤微环境的相关性。设计的多中心前瞻性研究需要进一步确认这些发现的可行性和再现性。
5。结论
我们建立了一个免疫评分系统在GC病人术后放化疗在我们的研究中。高患者免疫分数更容易pT较低阶段,低pN阶段,小病变,LVI-negative状态。免疫分数被发现是一个强有力的预后因素对DFS和操作系统,这可能补充TNM系统更好地识别GC的患者可能受益于辅助放化疗。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关这项研究的出版物。
作者的贡献
魏邹、冯梦龙周和Ling-yi张同样贡献了这项工作。
确认
这项工作是支持的肿瘤精确放疗引发中国国际基金会的项目(批准号2019 - n - 11)和上海市抗癌协会雏鹰项目(SACA-CY20C14 SACA-CY20B07号,和SACA-CY20A03)。
补充材料
补充表1:基线患者的临床病理特点。补充图1:免疫细胞之间的相关性。的r比和用斯皮尔曼相关测试值计算。(一)CD3-CT CD3-IM。(B) CD8-CT CD8-IM。(C) CD3-CT CD8-CT。(D) CD3-IM CD8-IM。(补充材料)