高表达的白介素2受体亚基伽马揭示人类胃癌预后不良

文摘

精密医学对胃癌(GC)仍然是一个尚未解决的问题,因为大多数可用目标药物并不是专门为GC。探索新颖的信号分子与目标值GC急需。本研究旨在揭示白介素2受体亚基γ(IL2RG)是一种重要的分子在人类GC进展。GC组织和paracancerous胃组织收集的7例(5 2男性和女性)在肿瘤根治性切除手术。这些组织被用来识别差异表达基因与RNA-seq(度)和序列的生物信息学分析包括京都基因和基因组的百科全书(KEGG)路径分析、基因表达分析交互式分析(GEPIA),和生存分析。RT-qPCR和西方墨点法进行比较的mRNA和蛋白表达水平IL2RG GC之间的组织和邻近正常胃组织之间以及GC细胞系sgc基地- 7901和正常胃上皮细胞系GES-1。结果显示显著的海拔IL2RG信使rna和蛋白质含量在GC组织和人类胃癌sgc基地- 7901细胞系相比,分别与相邻正常胃组织和正常GES-1细胞,和更高的生存IL2RG表达降低。分析GSE29272和GSE15459从基因表达数据集综合验证IL2RG GC中高度表达的病人以及总体存活率较差有关。此外,分子对接显示一个小分子,resatorvid(德242),可能是IL2RG的抑制剂。我们得出结论,IL2RG是在先进的GC和存活率较低有关。 IL2RG may serve as a biomarker of GC progression and poor prognosis.

1。介绍

胃癌(GC)死亡率的第三位,5年生存率不到30% (1]。世界上高发病率的GC主要是东亚的报道。虽然目前的临床诊断和治疗的发展,GC病人往往诊断阶段后期,在彻底切除后可能发生转移和复发的早期阶段。GC的发病机制尚不完全清楚(2,3),而这种情况会导致早期诊断困难,治疗和预后。因此,患者的长期存活率GC不容乐观。GC的公认的危险因素包括饮食、吸烟、家庭历史,幽门螺杆菌感染。

目前,精密医学为GC仍然是初步的,因为大多数可用的靶向药物并不是专门为GC。人类表皮生长因子受体2 (HER2),首次发现与乳腺癌相关的蛋白,被发现在GC [4]。曲妥珠单抗人源化单克隆抗体用于HER2,已经用于治疗转移性GC,但其安全性评价仍然缺乏。与乳腺癌的治疗,曲妥珠单抗用于GC似乎没有有效的一线治疗失败后。此外,曲妥珠单抗引起不良反应,如腹泻、口腔炎症、贫血、血小板减少,和疲劳5]。贝伐单抗作用于血管内皮生长因子(VEGF)和可以提高GC的平均无进展生存患者在晚期,但它不是有效的改善中位总生存期(6]。贝伐单抗的治疗效果不如单独化疗(7]。这些研究表明,HER2和VEGF GC不满意的药物靶点。因此,有必要进一步理解GC的病理信号,寻找小说GC特定分子靶点。

高通量测序技术已被广泛用于检测肿瘤和正常的组织转录组之间的差异。在这里,我们进行了转录组研究比较GC之间的度组织和paracancerous正常胃组织。KEGG通路的浓缩和GEPIA度进行筛选途径和潜在的靶基因。我们发现IL2RG在人类进步的GC,转录组资料验证,RT-qPCR和免疫印迹。这项研究提供了一个新颖的见解GC的发病机理,表明IL2RG可能作为标志或药物GC精密医学的目标。

2。材料和方法

2.1。病人和胃组织抽样

这项研究包括七个住院病人男性和2女性(5)诊断为胃癌在山西省人民医院(GC),太原,中国。患者信息表所示S1。所有的患者在晚期和激进的肿瘤切除手术。GC组织和配对相邻正常胃组织中收获手术。这些组织被分为6组:男性肿瘤(TM),女性肿瘤(TF),混合(男+女)肿瘤(T),女性正常(NF),男性正常(NM)和混合法(N)组。收获组织在液态氮冷冻和储存在一个ultra-low-temperature冰箱下面的实验。此外,我们获得GSE29272 [8]和GSE15459 [9]从基因表达数据集综合(地理,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。GSE29272的mRNA表达谱,它由134个胃癌样本和paracancerous配对样本,发现了Affymetrix人类基因组U133A数组。GSE15459的mRNA表达谱,由200胃癌样本完整生存的信息,发现了Affymetrix人类基因组U133 + 2.0数组。

2.2。RNA隔离

冻结与precold磷酸盐缓冲溶液洗胃组织(PBS)去除残留的血液。总RNA提取使用RNAiso +试剂(豆类,大阪,日本)。使用NanoDrop RNA浓度量化(专用设备、热费希尔科学,沃尔瑟姆,美国)。质量的总RNA进行了测试使用1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳。

2.3。互补脱氧核糖核酸库准备和RNA序列

一个μ每个样本g RNA是用于卷的25μl反向转录系统。的互补脱氧核糖核酸库建于PrimeScript™RT试剂盒(豆类,大阪,日本)使用PCR扩增。RT-qPCR反应试剂准备使用结核病绿色™预混料交货Taq™II(豆类,大阪,日本)。图书馆质量测试与安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技公司,CA)。集群生成后,图书馆被Illumina公司HiSeq 4000测序平台(美国圣地亚哥Illumina公司)。测序数据的质量控制表所示S2。基地的数量在所有样本之间的6.7 G和7.3 G。没有guanosine-cytidine (g c)偏见被发现。数据集质量要求分析会见了映射的所有样本率> 96%。

2.4。RNA-Seq数据的分析

顺序读取与质量低劣或适配器被过滤。修剪读取映射使用HISAT2软件(10)参考人类基因组(hg38),然后是处理StringTie软件(11转录剪接分析)。差异表达基因(度)分析DESeq2 [12)与 (FC,褶皱变化)和FDR-adjusted值< 0.01作为阈值。

2.5。功能富集分析

ClusterProfiler R包(13,14)是用于执行KEGG通路富集分析,并使用GEPIA kaplan meier进行生存分析数据库。 表示的意义丰富度的途径。

2.6。细胞系和文化

国网公司- 7901 GC细胞系和GES-1人类胃上皮细胞系是购自上海生物科学研究所,中国科学院(中国上海)。国网公司- 7901细胞培养在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640培养基和GES-1在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)(美国Hyclone南洛根,UT)含10%胎牛血清(的边后卫)(美国纽约Gibco) 37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。细胞培养confluency被用于在体外实验中约80%。

2.7。RT-qPCR

RT-qPCR进行检查的水平IL2RG mRNA在胃癌细胞株和胃组织。组织和细胞总rna提取使用RNAiso +试剂(豆类,大阪,日本)。的浓度和质量RNA被Nanodrop检查。PrimeScript™RT试剂盒(豆类,大阪,日本)被用来反对地转录RNA的互补。RT-qPCR根据豆类结核病的指令执行绿色™预混料交货Taq™II, GAPDH作为内部参考。的mRNA水平IL2RG计算使用2−∆∆Ct方法。IL2RG的引物序列如下:向前,GTTCTCCTTGCCTAGTGTGGATGG;相反,CCAACAGAGATAACCACGGCTTCC。GAPDH的引物序列如下:向前,CAAGGTCATCCATGACAACTTTG;相反,GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG。

2.8。西方墨点法

对GC组织提取蛋白质用于免疫印迹,每个子群的相邻正常胃组织,国网公司- 7901细胞,GES-1细胞。蛋白质是量化bicinchoninic酸(BCA)测定。总量的40岁μ每个样本的g蛋白10% sds - page分离,然后转移到PVDF膜。与PBS阻塞后含有5%脱脂奶粉一小时,细胞膜与鼠标anti-IL2RG孵化(稀释1:400)(Abcam,剑桥,英国)和兔anti-GAPDH(1: 1500)(中国ZSGB-Bio)一夜之间在4°C。然后,膜与辣根peroxidase-labeled二次孵化anti-mouse (1: 10000) (ZSGB-Bio,北京)或anti-rabbit(1: 10000)(中国ZSGB-Bio)抗体一小时在室温下与PBST洗后。目标免疫反应性的乐队是可视化增强化学发光底物(武汉博士德生物技术,中国)。光密度分析与ImageJ软件评估目标蛋白质的水平。GAPDH是用于规范化。

2.9。分子对接

IL2RG的初始结构提取白介素2的结构变体在复杂与白介素2受体(PDB ID: 5 m5e)。由AutoDock-1.5.6对接构成。结果表明,resatorvid可以用IL2RG码头。排名前十的姿势拿起基于计算AutoDock绑定使用得分函数相似。最好的绑定姿势IL2RG和resatorvid用于确定IL2RG和resatorvid之间的交互。IL2RG resatorvid的绑定机制是使用LigPlot特征,并使用PyMOL生成模型的图像软件。

2.10。统计分析

方差分析和学生的t以及用于基因表达水平组间比较。GEPIA [15基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库和KMplotter (http://kmplot.com/analysis)被用来评估的整体和复发存活率GC,和两组之间的差异被log-rank测试。所有统计分析计算R软件(版本3.4.1),和 表示的统计学意义。

3所示。结果

3.1。的识别度

所有测序样品比较转录表达水平的每百万(TPM)和表达水平在所有样本的分布(图是相一致的S1),它满足了要求度分析。数据1(一)- - - - - -1 (c)显示前100名的火山情节带注释的度,分别在女性,男性,GC和混合组织。与各自的正常胃组织相比,女性GC显示1057度(图1(一)),男GC显示270度(图1 (b)),混合GC展出710度(图1 (c))。数据1 (d)- - - - - -1 (f)显示的热图展示度的表达水平,分别为女性(图1 (d)),男(图1 (e))和混合(图1 (f)GC和non-GC胃组织。每一列代表一个组织亚型。

3.2。度和KEGG比较充实

展示共同和独特的基因在组织子组,cross-comparison度表现为女性,男性,而复杂的子组。图2(一个)表明,女性组的度的数量高于其他两组(男和混合),而男性组显示了混合组更多的一致性。有49三组之间的重叠度。

为了提高结果的准确性,TF-target和miRNA-target的监管信息,已被实验验证,收集(图S3)。TF-target和miRNA-target人类基因组中的数据来自TRRUST(版本2)和miRTarBase(版本8.0),分别。只有miRNA-target和强大的数据支持的关系从miRTarBase提取(8.0版)和用于进一步分析。人类的TF-target监管信息,共有8427对,提取从TRRUST(版本2)数据库,涉及TFs 795和2492的目标基因。miRNA-target信息提取和强大的数据支持,总共8157双,涉及735个microrna和2767个目标基因。

与NF组相比,总共有1057度TF组,其中250是调节和807是表达下调。与纳米组相比,总共有270度TM组,其中142是调节和128是表达下调。与N组相比,T组中有710度,其中403是调节和307表达下调(图S3)。三组的交集是提取,总共有49度,其中35例调节和14个表达下调。基于8427双TF-target TRRUST监管信息(版本2)数据库,搜索DEG-regulating TF, 44条TF-DEG规定建立了关系,涉及14度和38 TFs。基于8157双microrna的监管信息miRTarBase(版本8.0)数据库,搜索DEG-regulating microrna, 46双miRNA-DEG规定建立了关系,涉及14度和40个microrna(图S3)。

与度相关的生物过程是由KEGG通路富集分析。图2 (b)显示了女性的度浓缩GC,男GC, GC和混合组织。女性GC与充实cytokine-cytokine受体的相互作用主要表现(CCRI)和系统性红斑狼疮,等。男性GC主要展出浓缩酒精中毒的途径。混合GC显示丰富功能的多种途径包括CCRI,系统性红斑狼疮,酗酒。

3.3。协会IL2RG Upregulation GC进展和预后

自从CCRI丰富的女性肿瘤组和混合瘤组(图2 (b)),它可能在GC发展发挥了重要作用。基于度确定的GC和non-GC组织,KEGG通路富集分析表明,IL2RG CCRI丰富的通路,调节在GC(图S2)。

为了进一步验证在CCRI IL2RG通路的重要性,我们使用GEPIA探索IL2RG的表达水平在GC的大量数据。在GC IL2RG过表达( )与相邻的胃组织(图3(一个))。IL2RG水平高出逐渐延长的GC病理阶段(图3 (b))。同样,IL2RG发现高表达在胃癌样本与正常样本GSE29272数据集(图3 (c))。随后,IL2RG和复发存活率之间的关系以及总体存活率是调查使用GEPIA KMplotter,分别。虽然没有差别( )两组之间有高和低的表达IL2RG复发存活率,群体的复发存活率高表达IL2RG低于IL2RG表达较低的(图3 (d)),而高表达IL2RG在GC(可怜的整体存活率密切相关 )(图3 (e))。也发现病人IL2RG表达水平较高的可怜的总体生存GSE15459数据集(图3 (f))。

3.4。验证GC IL2RG丰富的组织和GC细胞系

IL2RG的mRNA水平高得多在国网公司(图- 7901细胞4在GC())和组织(图4(b))相比,分别与GES-1细胞和paracancerous胃组织与实时qPCR分析验证。符合mRNA水平,免疫印迹结果表明IL2RG表达水平也显著升高在国网公司- 7901细胞(数字4(c)和4(e)和GC组织与GES-1细胞和paracancerous组织(数字4(d)和4(f))。

4所示。讨论

GC是一个世界上最流行的和致命的癌症尤其是亚洲,和治疗仍然是令人失望的。为了探索新的靶基因GC和病理机制,我们进行了高通量测序的信使rna提取GC的病人。我们报道的度男GC和GC女性组织相对邻近的正常胃组织和分析这些使用KEGG浓缩度的功能分析和识别潜在的关键基因参与丰富的途径。

本研究关注的角色在GC IL2RG已很少报道。与正常胃组织的女性相比,富集度与CCRI女性GC组织。值得注意的是,IL2RG,参与CCRI通路富集在GC(图S2)。IL2RG是一个共享信号单元的几个白介素受体参与了免疫系统,包括2、il - 4, IL-7, IL-9, IL-15 IL-21,因此被称为公共γ链(γc) (16]。γc的形成和体内平衡是至关重要的T细胞和自然杀伤细胞。据报道,γc是参与肿瘤发生和影响恶性细胞分化,活化,增殖通过影响肿瘤环境。γc可以促进恶性转化细胞或相反导致肿瘤回归(17,18]。此外,γc-induced JAK-STAT相关信号通路调节免疫反应,某些癌症(19]。我们显示IL2RG在GC组织和调节IL2RG预测可怜的整体存活率高,表明IL2RG会致癌作用的发展人类的GC。我们也验证了我们的发现在从GEO数据库数据集和证实IL2RG在胃癌患者中,与贫穷的生存。

一个问题可能出现IL2RG是否GC的原癌基因。众所周知,原癌基因是一些正常的内源性基因调节细胞增殖、分化、和其他一些细胞活动的生理条件。原癌基因的异常激活可能成为致癌。原癌基因的激活方式包括细胞获得启动子和增强器从逆转录病毒,基因易位,放大,或点突变。本研究证明高GC在GC IL2RG组织和细胞系的表达在转录水平和翻译水平,表明IL2RG可能是原癌基因GC促进GC进展通过放大的方法。这种可能性权证等实验进一步验证IL2RG基因测序或沉默。

利用分子对接软件,我们发现一个名为resatorvid或达克242的小分子,是由武田制药和抑制炎症介质的生产开发20.]。TLR4受体的研究表明,封锁resatorvid可能是一种很有前途的方法来增强抗癌化疗的影响(21]。我们这里显示的Asn44 IL2RG是一个重要的网站与resatorvid(图S4),这表明resatorvid IL2RG的可能是一个障碍。分子对接方法找到IL2RG抑制剂可能是一个方法,这可能治疗潜力GC。

除了IL2RG之外,该研究还揭示了酗酒在GC发病机制中的作用和发展已经争论了很长时间,反映在调查结果不一致(22- - - - - -24]。在这里,我们提供科学的证据来源于人类GC组织,酗酒是一个重要的风险因素,促进GC的发展,特别是在男性。

总之,我们演示了度的男性,女性,和混合GC组织相对各自邻近正常胃组织。我们进一步确定IL2RG超表达在人类GC和GC细胞系及其积极的协会组织,预后不良。这些发现之前很少报道。我们建议IL2RG可以作为生物标志物或潜在的药物GC的目标。通路富集分析允许更好地理解GC病理学和可能有助于找到合理的目标基因GC疗法。

数据可用性

本研究的数据集上可用请求相应的作者。

附加分

本研究的主要局限是有限的研究人群由于困难GC样本期间COVID-19场合。然而,本研究的重点是不基于大规模人口实验但集中在确定IL2RG GC的潜在生物标志物。分析三个数据库(GEPIA GSE29272, GSE15459)和GC细胞株的实验可能支持这项研究的结论。扩大人口的研究是必要的在未来进一步确定IL2RG在GC的角色。

伦理批准

随后的过程都是按照道德标准的负责任的人体试验委员会(太原,山西省人民医院,中国)和1964年的赫尔辛基宣言》以及后来的版本。

同意

从所有患者知情同意了。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

De-Ping小王和荣赵了同样的工作。DW和JC的构思和设计研究。YQ和XB获得胃组织和执行组织的研究。DW, RZ, JS、SW MW, JH, XG进行生物信息学分析和RT-qPCR和WB化验。DW手稿草案写道。JC修订后的手稿提交和批准。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金委资助(81670313),山西省“1331工程”重点学科建设(1331 ksc),山西省应用基础研究项目(201801 d221269)和科技创新项目的高等教育机构在山西(STIP) (2019 l0437)。

补充材料

表S1:患者诊断为胃癌的特征。表S2:信息的原始测序读和映射。图S1:测序样本比较的基础上,记录每百万(TPM)的表达水平。N,正常胃组织。T,肿瘤。F,女性。米,男性。图S2: cytokine-cytokine受体相互作用(CCRI)路径映射基于GC之间的度和相邻non-GC胃组织。图S3: TF-DEG和miRNA-DEG.A的监管网络。图S4:分子对接结果resatorvid IL2RG。 A. The files named deg_N_T_tpm.txt, deg_NF_TF_tpm.txt, and deg_NM_TM_tpm.txt contain the DEGs and related statistical information.(补充材料)

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