缺氧分子表征在肝细胞癌识别风险之一签名和临床管理的两个列线图

文摘

缺氧是一个普遍的特性在肿瘤微环境(时差)。尽管如此,异构缺氧时间仍未阐明的模式在肝细胞癌(HCC)。使用聚类算法和公共数据集的共识,我们确定了异构缺氧亚型。我们也揭示了特定的生物和临床特点通过生物信息学方法。主成分分析算法来开发一个hypoxia-associated风险评分(神秘圣地)。我们确定了两个缺氧亚型:低缺氧模式(C1)和高缺氧模式(C2)。C1是不太敏感的免疫疗法相比,C2,符合缺乏免疫细胞和免疫检查点(icp) C1,而C2是相反的。C2显示预后差和高灵敏度obatoclax相对于C1,虽然C1是索拉非尼更敏感。这两个亚型还演示了subtype-specific基因组变异包括突变,拷贝数改变,甲基化。此外,我们开发和验证一个风险签名:神秘圣地,出色的性能预测预后和免疫疗法。 We revealed two hypoxia subtypes with distinct biological and clinical characteristics in HCC, which enhanced the understanding of hypoxia pattern. The risk signature was a promising biomarker for predicting prognosis and immunotherapy.

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是一种最常见的肝脏恶性肿瘤,约占原发性肝癌的-80%,75%,是全球癌症相关死亡的第四大原因(1]。肝细胞癌主要来自慢性乙型肝炎和丙型肝炎,酒精成瘾,代谢肝病,并与黄曲霉毒素暴露和马兜铃酸2]。虽然肝细胞癌的临床诊断和治疗已大大提高,该疗法疗效仍然是令人失望和5年复发率超过70%3]。最近,免疫治疗取得了巨大的进步作为小说在肝癌治疗方法,但迄今为止,它只有一个子集的病人受益4,5]。这可能是由于缺乏意识的异质性肿瘤微环境(时间)在肝细胞癌。

缺氧起着至关重要的作用在时间和强烈的相关性与肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞,以及大量的细胞因子和趋化因子(6,7]。时间是肿瘤的生存土壤,对肝癌的肿瘤发生和发展产生深远的影响(8]。缺氧是一种常见的状态的时间;它触发细胞外基质的沉积和降解,导致异常血管生成,粘连形成,和炎症,进而促进肿瘤的侵犯和转移(6,9]。例如,缺氧提升了活性氧(ROS)水平和移植VEGF的表达,促进肿瘤血管生成(10]。这两个转录因子蜗牛与缺氧和捻激活时间,诱导epithelial-mesenchymal过渡(EMT) [6]。缺氧是受到肿瘤细胞的代谢重编程,而代谢的变化反过来对肿瘤的缺氧状态有很大的影响(11]。此外,肝细胞的缺氧状态与索拉非尼阻力有关,不良预后,高复发风险的(12]。因此,碰头的缺氧状况紧密相关的肝细胞癌的生物学特性及临床结果。

此外,缺氧时间是至关重要的免疫渗透和免疫治疗肿瘤的13]。免疫细胞重要组成部分时间,有强烈的信息与肿瘤细胞相互作用[14]。免疫治疗逐渐成为革命和有前途的治疗癌症,它可以激活T细胞进行细胞毒性通过阻断特异性免疫检查点,如CTLA-4和PD-L1 [15]。先前的研究表明缺氧抑制淋巴细胞的效应和活动16]。此外,缺氧时间吸引了巨大的肿瘤相关巨噬细胞(tam) myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)和调节性T细胞,这直接限制了免疫功能和增加免疫疗法的阻力17]。越来越多的研究表明,缺氧诱发大量腺苷分配时间,这也进一步削弱免疫疗法的影响(13]。因此,应对免疫疗法的低利率可能被解释复杂的缺氧状态的时间。异构缺氧的系统性探索肝癌亚型,我们可以识别人群现在可怜的对免疫治疗的敏感性,为临床治疗做出适当的决策。

这种情况下,我们执行共识集群的多个队列基于hypoxia-associated基因的表达(女巫)。两个子类型被确定,然后与低缺氧模式分为C1和C2与高缺氧模式。进一步的研究揭示了两种亚型在生物功能有显著的异质性,免疫细胞浸润、分子特征、和临床结果。此外,基于异质性的缺氧时间,我们开发和验证签名称为风险hypoxia-associated风险评分(HARS)免疫治疗及预测预后。原来神秘圣地免疫治疗及预后具有良好的性能。结合神秘圣地和至关重要的临床特征,我们进一步构建两列线图总生存期(OS)和复发存活率(RFS)预测病人生存的概率。总的来说,这项研究增加了理解的缺氧时间和促进肝细胞癌的确切治疗和临床管理。

2。材料和方法

2.1。数据收集和处理

共有831名患者从三个独立组包括TCGA-LIHC ICGC-LIRI-JP, NCI(国家癌症研究所)数据集(GSE14520)登记。的TCGA-LIHC RNA-seq数据从癌症基因组图谱(TCGA,下载https://portal.gdc.cancer.gov/)。的ICGC-LIRI-JP RNA-seq获得国际癌症基因组协会门户(ICGC,https://dcc.icgc.org/)。TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP数据集,RNA-seq数据被转换为log2 (TPM + 1)值,提高样本之间的相似性。NCI队列的原始表达数据从基因表达综合下载(地理,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),我们进一步应用健壮multiarray affy包的平均算法(RMA)实现数据规范化。相应的临床数据也被下载。体细胞突变,拷贝数改变(CNA)和甲基化450珠芯片阵列TCGA-LIHC得到TCGA的门户。此外,我们还收集了四个合格的免疫疗法的数据集,包括GSE100797 GSE91061, VanAllen队列,IMvigor210 [18- - - - - -21]。对检索到的数据集的详细信息,请参阅表S1。表达数据都是由z分数归一化处理为后续分析。批量调整战斗算法删除批处理执行效果。根据先前的研究22,23),我们总结了24 hypoxia-associated基因(女巫)包括ALDOA ANGPTL4, BNC1, CA9, CDKN3, COL4A6,三,FOSL1, GNAI1, LDHA, P4HA1, PGAM1, PGK1, SDC1, SLC16A1, SLC2A1, TPI1, VEGFA, ACOT7, ADM, MIF, MRPS17, NDRG1和TUBB6(表S2)。

2.2。缺氧在肝细胞癌亚型识别

metacohort包括共有831名肝癌患者利用识别缺氧亚型表达谱的基础上24女巫。无监督聚类被ConsensusClusterPlus方案执行。在ConsensusClusterPlus函数中,聚类迭代的数量设置为1000,80%的情况下提取每个迭代;k - means算法和采用欧氏距离;所有病例分类k子组(k= 2∼9)。累积分布函数(CDF)和模糊聚类(PAC)的比例来确定最优簇数(24]。此外,Nbclust包被用来进一步核实最好的集群数量。

2.3。探索特定的生物功能在两个亚型

调查两个缺氧亚型之间不同的生物功能,我们进行基因变异分析(GSVA),使用分子特征数据库(MSigDB) v7.1标志和KEGG基因集。我们确定了limma包显著不同的生物功能,设置标准log2FC > 0.2和调整值< 0.05。的调整值从Benjamin-Hochberg获得多个校正。此外,我们还检索一些已知的基因集,进一步揭示生物缺氧亚型的函数(21)(表S3)。

2.4。评价免疫渗透和免疫治疗的反应

ssGSEA算法进一步利用评估23免疫细胞的渗透丰富,包括先天免疫细胞(激活树突状细胞、CD56^明亮的自然杀伤细胞,CD56^昏暗的自然杀伤细胞,嗜酸性粒细胞,未成熟的树突状细胞,巨噬细胞,肥大细胞,MDSC,单核细胞、自然杀伤细胞,中性粒细胞,血浆树突状细胞)和适应性免疫细胞(CD4 + T细胞激活B细胞,激活,激活的CD8 + T细胞,γδT细胞,成熟B细胞,自然杀伤T细胞,调节性T细胞,T辅助滤泡细胞,1型辅助T细胞类型17辅助T细胞,和2型辅助T细胞)(25]。成纤维细胞的渗透丰富是评估通过微环境细胞Population-counter (MCP-counter)算法(26]。细胞标记的细节,请参考表S4。肿瘤免疫功能紊乱和排斥(潮,http://tide.dfci.harvard.edu)web工具是用来预测不同缺氧亚型的免疫反应(27]。无监督子类映射(子映射)方法应用于评估肝细胞癌的表达相似性缺氧亚型患者和患者不同的免疫疗法的结果;如果一对的表达谱共享更多的相似之处,他们的临床结果更有可能是相似的28]。

2.5。药物敏感性的预测不同的缺氧亚型

pRRophetic算法在线性拟合岭回归基于基因表达和药物敏感数据(29日]。我们使用pRRophetic包展示索拉非尼和obatoclax的响应。药物敏感性量化了half-maximal抑制浓度(IC50);IC50越低,越敏感。

2.6。Mutation-Driven缺氧亚型的基因和突变特征

根据沉默突变基因和非编码突变,我们评估了背景突变速率随之MutSigCV(每个gene-patient-subtype组合的30.]。筛选阈值被设置为问< 0.05,然后,我们可以获得一系列显著的突变基因(smg)。NMF extractSignatures实现R包(31日)是利用提取突变的突变特征数的矩阵。潜在的等级设置为2∼6,我们发现两种亚型的优化等级是3。随后,我们计算两两之间的余弦相似性3突变宇宙签名,签名和相互匹配(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/signatures)。

2.7。拷贝数改变

GISTIC 2.0是用来识别显著放大和删除基因组区域(32]。进一步量化整个基因组的变化,部分基因组改变(FGA)基因组(FGG)获得分数,分数的基因组(备受)计算。FGA被定义为片段基因组变异的基数的百分比和FGG /备受只集中在基因组变异的收益或损失。

2.8。全球缺氧亚型的甲基化水平的估计

全球甲基化水平(GML) TCGA的每个病人数据库计算平均β值的特定探测器(33]。我们进一步构建了一个管道来识别methylation-driven每个缺氧亚型的基因(mdg),如下:(1)中央人民政府网站平均删除β值大于0.2在正常样本;(2)设置截止0.3,β值矩阵进一步分为二进制矩阵只含有甲基化和unmethylation;(3)删除中央人民政府网站,甲基化组的样本的数量少于10%的肿瘤样本;(4)探针的标记甲基化沉默中相应的基因表达的差距unmethylated组超过1.64标准差相应基因表达的甲基化组;(5)多个探测器匹配一个基因如果超过50%调查发现表观遗传沉默,和基因标签为目标。

2.9。建设Hypoxia-Associated风险签名

limma包是用来识别差异表达基因(度)之间的两个亚型。标准设置为调整值< 0.05和| logFC | > 1定义度。然后我们使用clusterProfiler包来显示和KEGG富集分析。提取显著生物功能的调整值< 0.05。的调整值从Benjamin-Hochberg获得多个校正。字符串数据库(https://string-db.org/)获得蛋白质的相互作用(PPI)网络的度。基于最大小团体中心(MCC)算法,我们应用分子复杂的检测(MCODE)提取关键模块通过Cytoscape软件。十大被定义为关键基因的基因。单变量Cox回归分析揭示了度的预后意义。我们进一步评估预后预测的准确性基于ROC曲线下的面积(AUC)值每度。主成分分析(PCA)算法来构造一个hypoxia-associated风险评分(HARS)根据关键基因。基于最近的重心法和皮尔逊相关性,我们开发了一个R包称为肝细胞癌(https://github.com/Zaoqu-Liu/HCCS)。管道可以将每个样本划分为相应的缺氧亚型和计算每个样本的神秘圣地。

2.10。免疫治疗反应预测

评价免疫治疗敏感性基于神秘圣地,四个独立的免疫治疗组包含预后和免疫治疗信息检索:(1)GSE100797:收养T细胞治疗(ACT)对黑色素瘤患者(18];(2)GSE91061: anti-CTLA4和anti-PD-1治疗黑色素瘤患者(19];(3)VanAllen队列:anti-CTLA4治疗转移性黑色素瘤患者(20.];(4)IMvigor210队列:anti-PD-L1治疗转移性移行细胞癌患者(21]。基于响应评估标准在实体肿瘤(RECIST)标准,我们分类患者完全缓解(CR)以及部分响应(PR)反应和疾病稳定(SD)和渐进性疾病患者nonresponders (PD)。此外,没有可评价的患者(NE)是专属我们的研究。最终,我们招募了21例(8反应者和13 nonresponders) GSE100797, 49例(10反应者和39 nonresponders) GSE91061, 39例(7反应者和32 nonresponders) VanAllen队列,和298名患者(68急救员和230 nonresponders) IMvigor210队列。

2.11。统计分析

两个变量之间的相关分析是通过枪兵和皮尔逊相关分析。我们应用Wilcoxon rank-sum或T测试评估当比较两个连续变量之间的区别。以上两组对比,克鲁斯卡尔-沃利斯或方差分析测试。我们采用卡方或雪的测试比较的差异分类变量。CNA染色体上的分布显示RCircos包。原始Affymetrix Affy微阵列数据处理方案。上海广电的战斗功能包被用来删除批处理效果不同的数据集。GSVA和ssGSEA分析是由GSVA包。成纤维细胞的渗透丰富是评估通过MCP-counter包。免疫疗法的疗效评估了潮流和子映射算法。pRRopheticPredict函数在pRRophetic包是用来预测的敏感性两个亚型索拉非尼和obatoclax。 GO and KEGG enrichment analysis was performed via clusterProfiler package. PPI networks were obtained from STRING databases and using the MCODE plug-in of Cytoscape software to extract key module from PPI. The nomogram was developed to assess individual outcome of HCC patients by using rms package. The median was used to divide samples into two groups. Survival curves were generated by the Kaplan–Meier method, and the statistically significant difference was identified by the log-rank test. The Cox regression analysis was estimated using survival package. The pROC package was used to assess the accuracy of HARS for predicting immunotherapy response. The timeROC package was performed to evaluate the accuracy of HARS for predicting prognosis. Calibration curves were calculated by calibrate function implemented in rms package. All statistical价值观是双面的,< 0.05被视为具有统计学意义。调整值通过Benjamini-Hochberg (BH)多个测试修正。所有数据处理完成R3.6.3软件。

3所示。结果

3.1。景观Hypoxia-Associated基因在肝癌的基因变异

我们的研究显示在图的工作流程1。总共24 hypoxia-associated基因(女巫)招募了在我们的研究中(表S2)[22,23]。基于24个女巫的表达式,我们可以区分肝癌与正常组织,TCGA队列(图2(a))。女巫的肝细胞癌和正常组织之间具有显著差异(图2(b))。进一步探索基因组之间的关系变化和表情24女巫在肝癌,综述了这些基因的基因组改变TCGA-LIHC项目。我们观察到女巫显示稀缺的突变,和超过一半的分子没有变异(图2(c))。染色体位置CNA女巫如图经验2(d)。这没什么,CNA的这些基因涉及范围很广,尤其是拷贝数删除(图2(e))。相比正常样本,女巫与删除显示表达式肝癌低(例如,ANGPTL4和TPI1),而女巫放大可能促进mRNA表达式(例如,MRPS17和NDRG1)。此外,DNA甲基化消极监管许多女巫,例如,SLC16A1, SDC1和MIF,暗示表观遗传沉默(图2(f))。上述建议CNA和甲基化可能产生主要影响女巫表达与HCC的罕见的体细胞突变。我们还发现有女巫之间强烈的相互作用和联系,和大多数的女巫是风险预测因素(图2(g))。

3.2。缺氧亚型识别肝癌

根据24女巫的表达谱,我们共识进行聚类分析。结果显示k= 2是最佳的数字(数字S1 (a)和S1 (b))。与此同时,累积分布函数(CDF)和NbClust也显示2是最好的分类(数字3(一)和S1 (c)),验证我们的结果的鲁棒性。因此,我们将831名肝癌患者分成两个集群根据上述结果:608例在C1和C2的223例。C1相比,我们发现大多数的女巫在C2明显调节(数字S2 (a)和S2 (b))。因此,C1被分类为低缺氧模式和C2是缺氧模式。与此一致的是,C2不利的总生存期(OS)和复发存活率(RFS)相对于C1(数字3(b)和3(c))。为进一步揭示潜在的生物学特性,我们执行GSVA使用标志和KEGG基因集富集分析。C1显然是富含metabolism-relevant途径如脂肪酸代谢、胆汁酸代谢,和色氨酸代谢,而C2主要是与血管生成相关的通路,如血管生成有关,epithelial-mesenchymal过渡(EMT)和VEGF信号通路(数据3(d)和3(e))。以前的报告展示了高缺氧模式激活诱导基质和血管生成,这可能会进一步促进肿瘤的进展和转移34]。为了更好地识别C2的生物学意义,我们检查一些已知的签名21]。结果表明,C2与基质相关签名,如EMT1 EMT2, EMT3(图S2 (c))。我们进一步探讨成纤维细胞的渗透丰富MCP-counter算法在两个亚型,也是高C2(图S2 (d))。总的来说,C1特征是低缺氧模式和metabolism-relevant功能;C2为特征的高缺氧模式和基质激活。

3.3。免疫渗滤和免疫反应的分子亚型

我们进一步评估免疫检查点(icp)两个缺氧亚型表达谱,发现icp C2表现出较高的表达水平,如CTLA-4和PD-L1(数字4(一)和S3 (a))。与此一致的是,C2也显示优越的大量的免疫细胞浸润,CD4 +和CD8 + T细胞(等数据4(b)和S3 (b))。这些结果暗示C2可能更敏感的免疫抑制剂检查站(艾多酷)。此外,女巫与icp和免疫细胞表现出显著的相关性(例如,B7-H4, CD4 + T细胞和CD8 + T细胞)(数据4(c)和S3 (c))。随后,我们应用潮流算法评估免疫治疗的反应。结果表明C2几乎是三倍的反应C1(图4(d))。我们进一步利用相似的子映射算法评估两个缺氧亚型的表达谱和47预处理患者完全免疫疗法的信息(28,35]。正如所料,C2是类似于患者治疗PD-L1抑制剂(Bonferroni纠正值= 0.031),符合高PD-L1表达式在C2(图4(e))。

3.4。两个缺氧亚型的临床特点

随后,我们专注于TCGA-LIHC群体进一步探索两个缺氧的临床特点亚型由于它包含全面的组学数据和临床信息。C2女巫较高表达相比,C1(例如,CA9 VEGFA, SLC2A1),表现出高缺氧模式(图5(a))。除了分子水平上,也有分布的临床病理特征和预后的差异之间的两个亚型。C1与低缺氧模式主要呈现在年龄的增长,男性,和较高的BMI患者(数字5(d) -5(f))。C2与高缺氧模式主要呈现在患者先进与阶段,优越的组织学分级和血管侵犯(数字5(g) -5(我))。这些结果表明C2主要与恶性表型有关。kaplan meier分析RFS建议C1有良好的预后(操作系统和数据5(b)和5(c))。此外,基于线性岭回归pRRophetic算法进一步应用于估计每个病人的敏感性索拉非尼和obatoclax29日]。half-maximal抑制浓度(IC50)是用来量化药物敏感性,和一个更小的IC50表示更高的药物敏感性。结果显示索拉非尼C1更敏感比C2(图5(j))。之前的研究表明高缺氧可能会限制索拉非尼的疗效并导致大量表达肿瘤耐药性的女巫(36]。相反,高缺氧模式可以提高肿瘤细胞反应在肝细胞癌(obatoclax37]。符合这个C2表现较强的应对obatoclax(图5(k))。总的来说,两种缺氧模式展示了不同的分子和临床特点,和这些结果可以指导个性化治疗和临床管理。

3.5。缺氧亚型的基因改变

C2提出更高的肿瘤突变负担(三甲)趋势与C1虽然在缺氧亚型(图无明显差异S4 (a))。使用MutSigCV算法,我们确定了12个显著突变基因(smg)两个亚型,和所有基因变异率大于5%(图6(a)和表S5)。的突变状态(图12 smg显著影响表达S4 (b))。例如,群TP53突变AXIN1, BAP1, TSC2,和BRD7相比野生组表达水平更高,而CTNNB1和铝青铜是相反的(图S4 (b))。有四种常见smg在缺氧亚型,包括CTNNB1, TP53铝青铜,AXIN1,暗示这些突变在HCC普遍。值得注意的是,C1曾主导CTNNB1突变与C1和特定smg与染色体重塑包括ARID1A和ARID2。在细胞周期的关键作用,TP53,其突变在C2相对于更频繁的C1。具体smg包括RB1和TSC2 C2也参与细胞周期的调控。此外,我们进一步研究了肝细胞的突变特征。不同的突变特征反映了不同的致癌过程。根据NMF算法,提取三个签名在这两个子类型和命名基于宇宙MutationalPatterns签名R包(数据6(b),S4 (c),S4 (d))。符合更高的三甲,C2有优越的签名6的比例,表示DNA错配修复缺陷。签名24与黄曲霉毒素也主要表现在C2,表示一个特定的外在的致癌过程C2。然而,有关签名5年龄最比例占据C1,符合C1的主要临床特征(数字S4 (e)和S4 (f))。

我们进一步应用GISTIC 2.0软件解码CNA的放大和删除染色体(图6(c)和表S6)。C1相比,我们发现C2负担更高的放大显示在手臂和焦级别(数据和删除6(d) -6(g))。符合这个C2也有优越的FGA、FGG,备受(图6(h))。这表明C2优越的基因组不稳定性相对于C1。与之前的研究一致,CNA负荷越高,更高的免疫原性和免疫渗透(38]。C2的复发性必须包括6的放大问题(CD109), 3 q26.31 (TNFSF10), 7 q31.2(遇到),和8 q24.21 (MYC)以及删除10 q23.31 (PTEN)和8 p23.2 (CSMD1)。的具体CNA C1主要是与细胞增殖有关,如放大6 p21.1 (VEGFA)和7 q21.3 (TAC1)以及删除9 p24.1 (JAK2)。这些结果表明这两种亚型不同CNA的事件,这不仅可能会导致不同的免疫渗透但也促进了目标治疗肝细胞癌。

3.6。甲基化修饰的缺氧亚型

DNA甲基化的基因表达调控中发挥了重要作用。全球甲基化水平(gml)通常指大甲基化基因区域显示DNA甲基化的系统损失(39]。在这个研究中,C2表现出更高的gml相对于C1(图7(一))。先前的研究表明,gml与细胞增殖负相关和正相关与CD8 +细胞浸润,以及甲基化损失与免疫有关的规定,进一步影响免疫反应(33]。与这些相一致,gml与增殖分数(图显著负相关7 (b))。gml与免疫细胞浸润也表现出正相关,如树突状细胞、B细胞、CD8 + T细胞(图7 (c))。gml的差异可能会影响肿瘤的发展和免疫状态。随后,我们确定了13和28 methylation-driven基因C1和C2 (mdg),分别为(数字7 (d)和7 (e))。肝脏特异性蛋白亚型CPS1是一个共同的目标。它是第一个病原在尿素循环酶,涉及肿瘤代谢,而DNA甲基化导致肝癌表达沉默CPS1 [40]。值得注意的是,在C1 WIPF3是最常见的目标。WIPF3编码肌动蛋白细胞骨架蛋白,影响肌动蛋白重塑和细胞入侵(41),这样的沉默WIPF3促进了肿瘤的生长。的抑制FOXD4和CDO1特定目标在C2。FOXD4参与免疫系统调节,肿瘤进展和转移甲基化改性(42]。此外,据报道,CDO1的启动子甲基化可能是一个公共事件在人类致癌作用[43]。FOXD4的沉默和CDO1可能加速肝细胞癌的致癌作用和发展。总的来说,两个亚型有特定的目标,这可能代表潜在的分子目标和促进肝癌异质性的进展。

3.7。开发和验证Hypoxia-Associated风险评分

299度C1和C2之间被确定,包括80年调节和219个表达下调基因(图8(a)和表S7)。去KEGG富集分析建议度主要是与分子运输和代谢,如离子运输、胆汁分泌和氮代谢(数字8(b)和8(c))。根据这些度,我们构造(PPI)网络和蛋白质间交互作用进一步提取关键模块。十大从MCC基因算法过滤掉关键基因(图8(d)),它可能在缺氧模式起着关键作用的肝细胞癌。值得注意的是,它包含四个驱动蛋白家族成员。根据以前的文献,由活性氧KIF15促进肝癌的发展不平衡,而KIF18B先进HCC进展通过激活WNT通路(44,45]。我们还发现,所有关键基因高表达在C2(图8(e))。单变量Cox回归分析进一步揭示了所有关键基因的高表达与不利预后显著相关(图8(e))。随后,我们评估的准确性由中华民国(表299度预测预后S8)。有趣的是,最高的AUC值9基因均通过MCC关键基因的筛选算法,和另一个关键基因,RAD54L,排名11(表S8)。这些结果不仅表明这些基因可能参与形成缺氧时间也不可以忽略不计的模式预测肝癌的预后。因此,我们应用了主成分分析(PCA)算法开发风险签名基于10个关键基因。提取主成分1作为基因签名得分。基因签名分数被任命为hypoxia-associated风险评分(神秘圣地)。TCGA我们计算每个病人的神秘圣地,NCI, ICGC军团和进一步HCC患者分为高危组和低风险组中值显示神秘圣地的价值。结果低风险组相比,显示良好的操作系统和RFS高危人群(数字8(g),8(h),8(j),8(k)S5 (a))。TCGA队列,auc的1 - 2 -,3 -,和5年预后预测神秘圣地是0.798,0.769,0.723,和0.702,分别(图8(我))。NCI队列,1 - 2 -,3 -,和5年auc是0.831,0.804,0.748,和0.733,分别(图8(左))。ICGC队列,1 - 2 -,3 -,和5年auc是0.771,0.731,0.725,和0.714,分别(图S5 (b))。上述结果表明神秘圣地表现良好,预后预测并显示潜在的临床应用价值。此外,根据最近的重心法和皮尔逊相关性,我们开发了一个R包称为肝细胞癌(https://github.com/Zaoqu-Liu/HCCS)。管道可以将每个样本划分为相应的缺氧亚型和计算每个样本的神秘圣地。

3.8。两列线图来评估操作系统和RFS

促进临床管理的神秘圣地,我们还招募了包括缺氧亚型的临床特征,年龄、性别、组织学分级,与阶段,和血管侵犯,计划开发一个可行的诺模图。我们发现神秘圣地是一个独立的预后因子对操作系统和RFS(表S9)。此外,单变量Cox分析表明性别和组织学分级没有预后意义的操作系统,与年龄、性别、组织学分级对RFS(表没有预后意义S9)。促进临床适用性,我们用单变量Cox包括神秘圣地和临床特征< 0.05开发两列线图预测1 -,3 -,5年的操作系统和RFS,分别为(数字9(一个)和9 (d))。校准曲线,哈勒尔的一致性指数(c指数),和民国两列线图的预测能力进行评估。校准曲线预测1 -,3 -,5年操作系统和RFS表现出伟大的期望值和实际观测之间的协议(数字9 (b)和9 (e))。c指数为0.714(95%可信区间[CI]: 0.65 - -0.78)和0.713(95%置信区间:0.67—-0.76)计算图表预测操作系统和RFS。此外,1 -,3 -和5年操作系统有关,RFS relevant-nomogram AUC值分别为0.762,0.719,0.709和0.743,0.715,和0.712,分别为(数字9 (c)和9 (f))。上面显示两列线图是可靠的和有前途的临床管理工具,可以帮助临床决策和建议。

3.9。免疫治疗反应预测基于神秘圣地

作为插图,神秘圣地不仅表现出与icp主导相关如CD80、CTLA4, PD-1, PD-L1,和FAS也与Th2相关显著,Th17, CD4 + T细胞、自然杀伤T细胞(数字S6 (a)和S6 (b))。这些结果表明,神秘圣地可能是一个潜在的免疫标记。因此,我们进一步发现神秘圣地的临床价值预测的响应在四个独立的人群免疫疗法。与前面的结果一致,高神秘圣地减少操作系统虽然三组没有统计学意义(GSE100797:= 0.129;GSE91061:= 0.058;VanAllen队列:= 0.088),这可能是由于小样本大小(数字10 (),10 (d),10 (g))。为IMvigor210队列包含298合格样品,你好高组表现出显著的不利预后= 0.0086(图10 (j))。此外,它是激动人心的神秘圣地组织显示优于免疫治疗的反应率低,这是3 - 6倍相比,高神秘圣地组(GSE100797: 64% vs 20%;GSE91061: 32% vs 8%;VanAllen队列:30% vs 5%;IMvigor210队列:30% vs 10%)(数据10 (b),10 (e),10 (h),10 (k))。中华民国是用来评估免疫治疗的准确性预测基于神秘圣地。我们观察到神秘圣地提供更准确的预测免疫治疗的好处,和GSE100797的AUC值,GSE91061, VanAllen队列,和IMvigor210群组分别为0.904,0.852,0.929,和0.712,分别为(数字10 (c),10 (f),10(我),10(左))。上面显示神秘圣地有优良的性能预测免疫疗法的反应,这是一个可靠和有前途的免疫标记。

4所示。讨论

缺氧是一个典型的微环境特征在肝癌和发展发挥了不可或缺的作用,转移,宽容,治疗和预后的肿瘤(6,23]。在这个研究中,我们观察到的大部分女巫显示异常表达与肝细胞癌的预后价值。CNA和甲基化可能会对女巫主导监管相对于突变。因此,根据女巫的表达,我们解码两个缺氧亚型metacohort和TCGA-LIHC队列,C1与低与高缺氧缺氧模式和C2模式。两缺氧亚型具有独特的生物学特性、免疫细胞的渗透,icp表达式,基因组司机,和临床结果。这些结果提高了缺氧模式的理解,促进了破译和精确治疗肝细胞癌的分子特征。此外,我们开发了一个签名和风险两个列线图来推进临床管理和免疫疗法。

缺氧,抗肿瘤的治疗是一个巨大的障碍和免疫治疗耐药性的主要因素13,23]。缺氧有深远的影响免疫细胞浸润,血管生成,甚至减少药物渗透,最终给治疗增加电阻(6]。在我们的研究中,我们观察到C2有更好的应对免疫治疗通过预测潮流和子映射算法。C1是低渗透特征的免疫细胞和成纤维细胞细胞低表达的icp,和高代谢活动。之前的研究表明高代谢活动无序时间和最终的免疫细胞功能受损46]。因此,高代谢活动以及缺乏免疫细胞和icp C1免疫治疗可能导致不利的反应。相反,由于高级水平的免疫细胞浸润和ICP表达,免疫疗法如anti-PD-L1 C2明显敏感。值得注意的是,低氧能提高免疫抑制细胞的抑制活动,减少淋巴细胞的细胞毒性效应在时间(16]。尽管如此,C2仍有更多的优点比C1缺乏免疫细胞免疫疗法。总的来说,我们推荐病人在C2亚型考虑免疫疗法。免疫渗透肿瘤恶化至关重要,间接影响肝癌预后的病人通过调节时间。例子,MDSCs、巨噬细胞和肥大细胞与短有关生存在肝细胞癌(1]。保持兴趣地,这些细胞被发现是C2中高度表达,这或许可以解释其不良操作系统和RFS。此外,如突变、基因变异还CNA,甲基化修饰与响应有重要的联系,靶向药物和肝细胞癌患者的临床结果2]。缺氧的两个子类型显示不同的基因改变,这可能是驱动因素的形成不同的亚型,预后预测指标和潜在药物靶点。C1是CTNNB1的主要特点是驱动突变,TP53 ARID1A, ARID2。先前的研究证明了CTNNB1的突变的一个特征,就是“肝癌免疫排斥亚型”,显示了与T细胞的排斥和无效的紧密相关性免疫治疗通过提高WNT信号通路的激活3]。染色质重塑因素ARID1A和ARID2具体smg C1。ARID2加强的突变的细胞毒性T细胞,改善临床患者的好处巨大的免疫细胞浸润(4]。此外,C1的放大VEGFA有利于免疫抑制微环境的形成,诱导T细胞疲劳,最终导致免疫逃避(5]。这些genomic-driven事件可能导致的免疫缺陷和免疫治疗抵抗C1。此外,C1和C2显示大量的甲基化修饰这可能导致肿瘤发生。尤其是在C2,甲基化水平较高的负担。随着表观遗传学的发展,癌症甲基化改性负责启动和甲基化的网站可能是潜在的治疗目标6]。例如,CDO1的甲基化修饰是常见的在多种人类癌症和甲基化沉默CDO1肿瘤细胞增长(7]。针对CDO1可能完成精确治疗,使令人印象深刻的效果。高CNA负担主要是C2的基因组特征,如放大7 q31.2(满足)和8 q24.21 (MYC)。先前的研究证明了满足的高层放大驱动肿瘤发生和授予不良预后[8]。MYC放大提高RUVBL2表达式,而过度的RUVBL2展出短RFS通过调节一种蛋白激酶ERK / MAPK通路在肝细胞癌(9]。RB1确定为第一个肿瘤抑制基因在人类历史上是具体SMG C2。RB1基因突变的HCC患者的特点高水平的果蝇修剪蛋白质(h-prune) [10]。高表达的h-prune促进了肿瘤转移和执行逆操作系统和RFS [10]。因此,这些分子改变进一步证明了C2穷人OS和RFS。总的来说,我们发现了不同的基因改变,甲基化改性,在临床表现和免疫之间C1和C2。不敏感的免疫疗法C1和C2的预后差深入解释道。此外,综合探索基因组变异还为精确治疗肝癌提供了重要的理论支持。

缺氧的亚型还演示了异构的临床结果。相比C1, C2显示对索拉非尼的敏感性差。然而,索拉非尼的抗血管新生作用导致瘤内缺氧,增加适应缺氧细胞的数量(53]。因此,高缺氧模式可能会限制索拉非尼的疗效,进一步导致穷人的敏感性C2 (36]。此外,C2 obatoclax表现出更多的敏感,这可能是由于obatoclax得罪WNT /促进肿瘤细胞凋亡β连环蛋白信号,明显是富含C2 (54]。此外,我们开发了一个风险特征称为神秘圣地。神秘圣地表现优秀的预测预后和是一个独立的预后相关风险的操作系统和RFS肝癌。与此同时,神秘圣地也是一个健壮的指标免疫疗法,疗效是在四个独立的群组研究中进行验证。此外,结合神秘圣地和至关重要的临床特征,两列线图和良好的性能也构建了评估系统的可能性和RFS促进临床管理。列线图可以应用提供更精确的和个性化的评价肝癌病人的操作系统和RFS。最后,基于最近的重心法和皮尔逊相关性,我们开发了一个R包称为肝细胞癌(https://github.com/Zaoqu-Liu/HCCS)。管道可以将每个样本划分为相应的缺氧亚型和计算每个样本的神秘圣地。

这项研究仍有一些局限性。首先,我们间接地评估每个病人的相对缺氧状态基于女巫的表达。其次,神秘圣地应对免疫治疗的预测是基于四个回顾性验证认可,但前瞻性群组研究仍然是必要的。

5。结论

我们发现两个缺氧亚型与不同的生物功能,免疫细胞的渗透,icp表达,基因驱动的事件,并在肝细胞癌的临床结果。神秘圣地是一个健壮的和有前途的免疫治疗及预后指标,和两个诺模图提出了促进肝细胞癌患者的预后评估。这些结果增强了承认缺氧异质性在肝癌和促进个体治疗和临床管理。

数据可用性

公开的数据集进行分析。这些数据可以发现在癌症基因组图谱(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/),国际癌症基因组协会门户(ICGChttps://dcc.icgc.org/)和基因表达综合(地理,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Zaoqu刘,刘长,桃园路同样贡献了这个工作。

补充材料

图S1: metacohort分子亚型的识别。(一)患者使用无监督聚类算法分类到不同的分子亚型metacohort。831份肝癌样本的共识得分矩阵(K= 2∼9)。两个样本之间的分数更高的共识表明他们更可能被分成相同的集群在不同的迭代中。图展示了k= 2是最好的选择。(b)模糊聚类(PAC)的比例分数,低价值的PAC隐含一个平面中间段累积分布函数(CDFs),允许最佳的猜想k(k= 2)最低的PAC。(c)推荐数量的集群使用26 metacohort Nbclust包的标准。列的最高代表最优k(k= 2)。图S2:女巫的差异表达,签名,与纤维母细胞浸润在metacohort C1和C2。(一)表达之间的24个女巫的热图C1和C2。高表达,红色;低表达,蓝色。(b)的表达盒须图24女巫之间C1和C2。(c)之间的签名分数比较C1和C2。(d)之间的大量的成纤维细胞相比C1和C2。ns,> 0.05; < 0.05; < 0.01; < 0.001。图S3:免疫检查点的差异(icp)和免疫细胞之间的C1和C2。箱线图(a)表达之间的icp C1和C2。ns,> 0.05; < 0.05; < 0.01; < 0.001。(b)的热图23免疫细胞之间的C1和C2。高表达,红色;低表达,蓝色。(c)免疫细胞之间的相关性和女巫用斯皮尔曼的分析。标有蓝色的负相关,而且正相关关系上有红色的。没有星号代表没有统计学意义; < 0.05; < 0.01。图S4:签名和显著突变基因突变(smg) TCGA-LIHC队列。(a)的比较肿瘤突变负担(三甲)之间的C1和C2。(b)的表达差异12 smg之间突变组和野生组。突变群体,蓝色;野生群体,黄色。使用NMF的包(c, d),突变的突变签名提取数矩阵。最优等级是3 (c, d)。(e, f)的比例饼图显示突变签名在C1 (e)和C2 (f),分别。图S5: kaplan meier和ROC分析ICGC队列的神秘圣地。(a) kaplan meier曲线之间的操作系统低神秘圣地和高神秘圣地组织ICGC队列。 (b) Estimation of the prognosis prediction by receiver operating characteristic curve (ROC) in ICGC cohort. Figure S6: correlations of HARS with immune checkpoints and immune cells. (a) Spearman correlation analysis between HARS and immune checkpoints. (b) Spearman correlation analysis between HARS and immune cells. The circle size represents the strength of correlation. Table S1: the details of seven datasets enrolled in this study. Table S2: a total of 24 hypoxia-associated genes (HAGs) were recruited in our research. Table S3: the known gene signatures enrolled in this study. Table S4: the gene sets for marking 23 immune cell types and fibroblasts. Table S5: the mutation-driven genes from MutSigCV algorithm in C1 and C2.smg标记为红色;常见的smg标有大胆。表S6:重大焦点拷贝数改变每个亚型的(包括放大和删除)。表S7:共有299个差异表达基因subtype-related(度)。度是用红色标注的。表S8:每度的单变量Cox回归和ROC分析。关键基因是用红色标注的。表S9: Cox回归分析的总生存期(OS)和复发存活率(RFS)。单变量Cox的因素值< 0.05在绿色标记,并与多变量Cox的因素值< 0.05是用红色标注的。(补充材料)

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