击倒RhoC抑制口腔鳞状细胞癌的细胞通过调节HMGA2入侵和转移

文摘

Ras同族体家人C (RhoC)是细胞内信号转导的重要组成部分,其过度报道参与调节肿瘤扩散,入侵,在各种恶性肿瘤和转移。然而,它的作用和潜在机制在口腔鳞状细胞癌(OSCC)仍不清楚。在我们的研究中,RhoC表达式,其与临床阶段,在OSCC存活率进行了分析使用数据集从癌症基因组图谱(TCGA)。接下来,RhoC击倒成立于体外细胞模型,以及RhoC击倒的影响在OSCC细胞MTT测定发现,集落形成试验,transwell入侵检测,分析,和f -肌动蛋白phalloidin染色。建立了一个体内tongue-xenografted裸鼠模型来衡量RhoC击倒对肿瘤细胞生长的影响和淋巴结转移。一种机制研究是由实时PCR和免疫细胞化学。TCGA的结果分析表明,RhoC在OSCC肿瘤组织中。在体外实验表明,击倒RhoC没有OSCC细胞生长作用但显著抑制细胞集落形成、入侵和迁移能力,f -肌动蛋白聚合也减少了。tongue-xenografted体内模型证明击倒RhoC抑制OSCC细胞生长和抑制颈浅淋巴结转移。进一步机制研究表明,击倒RhoC下调HMGA2表达式,并与RhoC HMGA2表达高度相关表达式在OSCC TCGA肿瘤组织通过分析数据集。 Overall, our study showed that knockdown of RhoC inhibited OSCC cells invasion and migration in vitro and OSCC cell growth and lymph node metastasis in vivo. Moreover, the potential mechanisms involved in these activities may be related to the regulation of HMGA2 expression. The RhoC gene could serve as a promising therapeutic target for OSCCs in the future.

1。介绍

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是全球第十癌症相关死亡的主要原因,在2012年达到145400人死亡(1]。尽管治疗策略的发展,五年存活率OSCC不到50%已经过去三十年(2]。OSCC导致颈部淋巴结转移由于口腔地区丰富的淋巴管(3]。OSCC高死亡率与当地的入侵被认为是密切相关的肿瘤细胞和淋巴结转移的性质。因此,识别机制的入侵和转移特性OSCC迫切需要改善病人的结果。

研究表明,异常的激活ρgtpase家族,Ras同源蛋白质家族的组件,起着至关重要的作用在一个广泛的细胞活动包括细胞增殖、分化、凋亡、细胞粘附、侵袭性和转移性肿瘤细胞的潜力(4,5]。作为一个重要的成员ρGTPase家庭成员,RhoC发挥了重要作用,恶性肿瘤的浸润和转移影响epithelial-mesenchymal过渡(EMT),细胞外基质降解,细胞迁移和肿瘤血管生成(6]。RhoC日益参与报道的恶性潜能肿瘤,如乳腺癌[7),肺癌8),胃癌9],结肠癌[10),前列腺癌(11],头颈部鳞状细胞癌(HNSCC) [12]。特别是RhoC超表达与HNSCC的转移性行为有关,而减少RhoC表达显著减弱肿瘤迁移和入侵13]。具体来说,RhoC表达式与tumor-node-metastasis经常观察到的有关在OSCC [14]。相反,在前列腺癌的一项研究中,RhoC表达式并没有导致细胞运动性只有提升细胞入侵(15]。此外,据报道,之间没有相关性RhoC的表达水平和原位OSCC的组织病理学分级。尽管如此进步的理解RhoC参与肿瘤的侵袭及转移,迫切需要进一步调查体内和体外探讨RhoC在OSCC的作用及其对下游信号分子的影响提供科学验证临床癌症治疗的目标。

在这项研究中,我们分析了数据集从TCGA探索检索OSCC RhoC表达和临床病理特征之间的相关性。此外,我们建立了一个RhoC击倒OSCC细胞系模型探讨生物性能和定义的潜在功能和机制在OSCC RhoC-mediated活动不仅在体外,而且体内。我们的结果表明,过度RhoC OSCC肿瘤转移密切相关,而击倒RhoC克制OSCC细胞的浸润和转移能力体内和体外,这些影响可能与调节HMGA2表达式。此外,RhoC基因可能作为一种潜在的治疗目标OSCC的未来。

2。材料和方法

2.1。癌症数据收集和预处理

口腔癌的数据包括基因数据,同种型RSEM数据和临床数据系统地搜索和下载的UCSC齐娜浏览器(环球数码创意中心:https://gdc.xenahubs.net)。使用下面的搜索参数:口腔,口腔舌、颊粘膜,嘴唇,牙槽嵴,硬腭,地板的嘴。然后,R软件版本3.6.1用于转换和分析RNA-sequencing数据(FPKM值)(16]。kaplan meier和生存率较分析是用来分析总体存活率。

2.2。体外OSCC细胞系的文化

OSCC细胞株CAL-27和SCC-15从北京口腔医院研究机构,获得首都医科大学。细胞在DMEM经常培养高葡萄糖或DMEM: F12培养基(英杰公司生命科学,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清的边后卫,100μg / mL链霉素,青霉素和100 U /毫升,孵化37°C湿润有限公司5%₂孵化器。

2.3。建设RhoC / shRNA质粒,转染

向量LVRU6MP编码RhoC /成分和控制向量编码模拟成分是由GeneCopoeia, Inc .(马里兰州罗克维尔市)。293年助教慢病毒包装细胞被用来包装慢病毒粒子和生成重组慢病毒粒子使用Lenti-Pac艾滋病毒表达包装设备和psi-LVRU6MP / RhoC /成分。慢病毒含有RhoC /成分基因转染到CAL-27 (6×10⁴)和SCC-15 (1.5×10⁵)细胞6-well菜肴与聚凝胺(GenePharma,中国)。慢病毒转移向量表示mCherry蛋白质被用来控制。转染细胞是由嘌呤霉素选择(密苏里州Sigma-Aldrich)治疗和进一步扩大实验。转染细胞的生存能力保持稳定。

2.4。实时聚合酶链反应(rt - pcr)

从转染细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(ComWin生物技术有限公司,中国)根据制造商的协议,使用超级逆转录和反向转录进行互补脱氧核糖核酸合成装备(ComWin生物技术)。PCR进行与ULtraSYBR混合物(低火箭)(ComWin生物技术)。人类RhoC底漆集(目录号:QRP20382)被GeneCopoeia Inc .提供的底漆集GAPDH(向前,5′-CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTAT-3′相反,5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′)和HMGA2(向前,5′-GCCAAGAGGCAGACCTAGGAAA-3 ';相反,5′-CATGGCAATACAGAATAAGTGGTCA-3′) Sangon生物技术有限公司提供的有限公司(中国)。申请的∆∆CT方法量化分析(17),GAPDH是作为内生控制。

2.5。免疫细胞化学

RhoC的表达和HMGA2被免疫细胞化学检测(包含IHC)蛋白水平。控制和shRNA转染CAL-27 (1×10⁵)和SCC-15 (2×10⁴)细胞,分别培养在一夜之间24-well板块。接下来,10%中性缓冲福尔马林固定剂被用来修复细胞为30分钟和孵化了特里同x - 100 10分钟。山羊血清(10%)被用来阻止细胞1 h,随后与PBS洗3次。接下来,细胞被孵化3%山羊血清含有抗体RhoC (ab180785 Abcam 1: 400)和HMGA2 (ab97276 Abcam 1: 500),在一夜之间,分别在4°C。细胞被洗PBS和孵化山羊血清含有3%的第二抗体1 h,然后沾diaminobenzidine (DAB)工具包(ComWin生物技术有限公司,中国)。一个倒置显微镜下的细胞被拍到。

2.6。MTT试验

评价细胞增殖,转染细胞在96孔板镀。培养后24、48和72 h在37°C, 5%的公司₂,20μ美国L的MTT(σ)解决方案(5毫克/毫升)被添加到每个好,培养一个额外的4 h。接下来,200年μ美国σL二甲亚砜(DMSO)被添加到每个产品溶解反应,和一个微型板块读者(分子器件、桑尼维尔CA)是用来测量获得的光学密度(OD)值在490 nm波长。

2.7。集落形成实验

评价细胞集落形成能力,转染细胞(1000 /板)被播种在60毫米文化菜肴。细胞被固定为10%中性缓冲福尔马林固定剂和与结晶紫染色的解决方案(Beyotime,中国)经过12天的文化。殖民地拍摄和计算。

2.8。Transwell入侵检测

评价细胞入侵,转染细胞悬浮在培养基含有2%牛血清白蛋白(BSA, VWR,二,PA)被播种在transwell膜涂层与基底膜基质(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)在参议院(8μ米孔隙大小;康宁,康宁,NJ)。中含有10%的边后卫是添加到众议院。48小时孵化后37°C, 5%的公司₂剩余的细胞上膜被使用棉签,穿过细胞膜和细胞与10%中性缓冲福尔马林固定剂固定,然后用结晶紫染色方案。倒置显微镜,拍摄膜和细胞人数统计。

2.9。抓迁移分析

评价细胞迁移,转染细胞接种到6-well盘子。细胞培养24 h后,统一的伤口在一条直线上画使用吸管提示在每个;细胞与PBS清洗去除分离细胞。接下来,细胞培养介质中含2%的边后卫在37°C, 5%的公司₂。井拍摄和关闭或填补伤口评估在24日,48岁,显微镜下72和96 h(奥林巴斯IX71、东京、日本)和400×放大。

2.10。Phalloidin染色

评估f -肌动蛋白聚合,转染细胞被固定在40 g / L甲醛30分钟后接种到24-well盘子和培养24小时。与0.1% Triton x - 100透化作用后10分钟和阻止1% BSA为30分钟,5的细胞被孵化μ美国g / mL rhodamine-conjugated phalloidin(σ)1 h。然后用DAPI counter-stained细胞。f -肌动蛋白荧光下获得的图像和照片使用显微镜(日本奥林巴斯IX71) 200 x放大。平均光密度(MOD)发现f -肌动蛋白聚合的价值。

2.11。Tongue-Xenografted BALB / c裸小鼠模型

BALB / c裸小鼠(男,年龄在6周)从SPF购买生物技术有限公司(中国)。适应环境的一个星期后,35 BALB / c裸小鼠随机分成三组和标记:a组,空白对照组;B组,接种CAL-27 / RhoC / shRNA细胞;和C组,接种CAL-27 /控制细胞。裸体小鼠接种OSCC细胞(25μL在PBS, 5×10⁶)的横向部分鼠标的舌头。老鼠的身体重量测量每3天12天后,老鼠牺牲。

2.12。苏木精和伊红染色

老鼠牺牲后,每个鼠标的舌头和淋巴结标本和中立的福尔马林固定。组织样本嵌入在石蜡切片。组织部分(5μ米厚)与苏木精和伊红染色(圆))根据制造商的协议;图像拍摄和评估使用光学显微镜(奥林巴斯,BX61)。

2.13。统计分析

数据表示为平均值±标准偏差(SD)。SPSS统计v25.0 (、IBM、纽约Armonk)是用来评估使用学生的统计学意义t以及成对比较和卡方检验的样本率。统计学意义是 。

3所示。结果

3.1。口腔癌患者的评估RhoC TCGA分析数据集

的表达在口腔癌RhoC TCGA数据集的分析。RhoC表达明显高于肿瘤组织(n= 314)比正常上皮组织(n= 30,图1(一), )。RhoC表达高水平阶段II-IV病人比在I期患者(图1 (b), )。患者总生存期(OS)分析表明高RhoC表达式比癌症患者较低的贫穷OS RhoC表达式,但是差异没有统计学意义(图1 (c), )。上述结果表明,RhoC在肿瘤组织中,RhoC的表达与肿瘤进展相关。

3.2。建立击倒RhoC模型在OSCC细胞线

探索在OSCC RhoC进展的生物作用,构造了一个HIV-based慢病毒质粒含RhoC /成分和慢病毒转染到OSCC细胞株(CAL-27和SCC-15)击倒RhoC表达式(图2)。OSCC细胞转染质粒含有炒成分作为控制。稳定转染细胞是由嘌呤霉素治疗和选择的效率击倒在体外检测RhoC rt - pcr和刑事法庭。RNA的表达RhoC RhoC / shRNA组明显低于对照组(图2 (c))。同样,蛋白表达的RhoC RhoC / shRNA组也显著低于对照组(图2 (b))。

3.3。击倒的RhoC最小影响细胞增殖,但抑制体外集落形成

进一步探索RhoC在OSCC的角色,一个体外MTT试验研究细胞增殖。结果表明,击倒RhoC不施加任何影响要么OSCC细胞的生长线(CAL-27 SCC-15,图3(一个))。然而,集落形成试验表明RhoC击倒的数量明显减少殖民地形成在OSCC细胞系(数字3 (b)和3 (c))。

3.4。击倒RhoC抑制入侵、迁移和f -肌动蛋白聚合

入侵检测表明,击倒入侵CAL-27 RhoC明显减少和SCC-15 OSCC细胞系(图4)。抓迁移试验也表明,RhoC击倒减慢CAL-27细胞的相对迁移率在时间的方式,和类似的结果使用SCC-15细胞(图5)。此外,phalloidin标签的f -肌动蛋白也显著降低RhoC / shRNA组比对照组由国防部表示值(图6);细胞出现较小和较能够分散在RhoC / shRNA OSCC细胞系。这些数据的差别表明,对这些RhoC抑制入侵,迁移,OSCC细胞体外和细胞迁移。

3.5。击倒的RhoC抑制CAL-27在舌头异种移植和细胞生长抑制转移在裸小鼠颈浅淋巴结

OSCC大多发生在舌头,容易发生淋巴结转移。因此,裸鼠tongue-xenografted模型建立了调查的影响减少RhoC表达体内注射CAL-27 / RhoC shRNA细胞和控制细胞的舌头裸体小鼠。老鼠发现了12天。随后,他走时染色是用来确定肿瘤面积的比例在切除老鼠的舌头和淋巴结组织和淋巴结的转移率。舌头的)染色显示,相比,控制注入小鼠肿瘤细胞可能导致上皮增生:上皮细胞增殖的程度显著低于RhoC / shRNA组比对照组(图7(一))。我们确定肿瘤的比例的地区方言RhoC / shRNA组(64.7%)明显低于对照组(图7 (b))。此外,转移性肿瘤面积减少在颈浅淋巴结RhoC / shRNA组(图8(一个))。转移性肿瘤细胞的比例在颈浅淋巴结控制老鼠(图相比减少了32%8 (b)),转移率从98.5%(对照组)显著降低到68.0% (RhoC / shRNA集团)(图8 (c))。总的来说,RhoC表达式的击倒了显著减少肿瘤异种移植的舌头和淋巴结组织区域,同样的相对淋巴结转移率也低于对照组。最重要的是,我们的研究结果提供的证据表明,减少RhoC表达减少体内OSCC细胞的浸润和转移。

3.6。击倒RhoC监管HMGA2表达式

进一步探索RhoC在OSCC细胞的机制,HMGA2的表达在转染OSCC细胞检查。RNA和蛋白表达水平的HMGA2都显著降低RhoC / shRNA组(图9)。此外,我们发现有临床意义支持RhoC-HMGA2交互使用生物信息学分析。HMGA2在OSCC肿瘤组织(图中10 ())之间的相关性,进一步有RhoC和HMGA2(图的表达式10 (b), ,R= 0.39)。生存分析显示,高表达的HMGA2也与贫穷相关的操作系统,但是这种关联并不显著(图10 (c), ,虽然HNSC达到统计上的显著水平,数据未显示)。这些数据表明,HMGA2的表达被RhoC监管。

总体而言,我们的研究表明,击倒RhoC表达能抑制OSCC的恶性生物学行为,特别是恶性细胞入侵的性质,迁移,肿瘤的生长,和淋巴结转移,这些可能是通过调节HMGA2表达式。

4所示。讨论

转移是恶性肿瘤的一个重要标志和普遍贫困癌症患者的预后因素18]。作为人类最常见的癌症之一,OSCC是容易发生淋巴结转移甚至在早期阶段。许多努力都试图识别可以帮助预测癌症预后的分子标记。TCGA的分析数据显示,RhoC在肿瘤组织中,在OSCC患者与转移相关,这些结果与临床一致包含IHC研究[19]。在先前的研究中,RhoC被报道参与细胞骨架重组的规定,并且它影响细胞粘附和迁移6]。在这项研究中,我们获得了类似的结果,击倒RhoC有效抑制OSCC细胞体外侵袭及转移和OSCC-xenografted裸体小鼠。这一证据支持在OSCC细胞RhoC致癌基因的作用,与先前的研究一致支持多种癌症类型和相关的临床研究[11,13,20.]。

尽管越来越多的证据表明,RhoC与细胞入侵和迁移起着重要的作用在先进的肿瘤,证据关于RhoC的作用在调节肿瘤细胞增殖一直存在争议。在以前的研究中,击倒RhoC表达式的肝癌细胞株可以显著提高间期细胞的比例,从而抑制细胞增殖(21]。然而,在这项研究中,我们提供了证据表明OSCC细胞的细胞生长RhoC击倒组相比没有明显抑制肝癌和对照组的细胞生长增殖的化验。的差别这表明对这些RhoC可能不会减少OSCC细胞增殖,这也符合使用肺癌的小鼠模型研究[22]。

迄今为止,RhoC促进肿瘤进展的分子机制尚未完全清楚。以前的研究已经表明RhoC促进癌症发展通过调节MMP的表达基因EMT (11,21,23]。然而,变化的EMT标记如钙粘蛋白和水平β连环蛋白没有观察到在我们的研究中(数据未显示),这表明RhoC入侵和转移的影响在OSCC细胞可能不是通过调节EMT。

在这项研究中,HMGA2表达式在OSCC细胞RhoC击倒后监管。与此同时,其他研究已经报道,HMGA2是在黑色素瘤(24],卵巢癌[25),而鼻咽癌(26]。HMGA2被认为发挥关键作用的规定在癌症细胞增殖、凋亡、迁移和入侵27]。此外,先前的调查也显示,HMGA2显著的表达与胶质瘤细胞的入侵和生存(28]。HMGA2还发现在入侵前口头表达癌(29日]。这些发现与我们的数据表明,RhoC可能影响OSCC细胞恶性行为通过调节HMGA2通路。

我们的研究为理解机制提供新的见解OSCC的恶性潜能,并提供一个理由小说在OSCC策略和治疗靶点。尽管如此,还需要进一步的研究来调查机制的影响RhoC / HMGA2通路在OSCC的进展。

总之,目前的研究显示,RhoC在OSCC组织中,击倒RhoC抑制细胞的浸润和转移的OSCC细胞在体外和体内,这些影响可能会连接到HMGA2表达式的规定。因此,临床诊断可能受益于RhoC评估,和RhoC / HMGA2信号通路可以作为一个潜在的治疗目标OSCC的治疗。

缩写

OSCC:	口腔鳞状细胞癌
RhoC:	Ras同族体家人C
TCGA:	癌症基因组图谱
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
轻拍:	Diaminobenzidine
):	苏木精和伊红
的边后卫:	胎牛血清
DMSO溶液:	二甲亚砜
国防部:	平均光密度
BSA:	牛血清白蛋白
PBS:	磷酸缓冲盐。

数据可用性

所有可用的数据包括在这项研究是根据接触要求相应的作者。临床数据的关系TCGA RhoC与OSCC患者可以获得网站(https://portal.gdc.cancer.gov/)。

伦理批准

作者声明,动物保健和实验性的协议都是动物伦理委员会批准北京口腔医院,首都医科大学(许可数量:kqyy - 20190402 - 003)。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

确认

本研究的研究经费支持中国国家自然科学基金(81772868)和北京自然科学基金(中国)(7202057)。

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版权

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