Exosomal mir - 1290通过针对SMEK1促进肝细胞癌的血管生成

文摘

肝细胞癌(HCC),最常见的原发性肝癌,依靠新血管的形成对经济增长和频繁的肝内和肝外转移。因此,重要的是要探讨肝癌的潜在肿瘤血管生成的分子机制。最近,小分子核糖核酸可以调节血管生成过程的调节重要的血管生成因子的表达。然而,潜在的角色tumor-derived exosomal microrna在调节肿瘤血管生成仍有待阐明。在这项研究中,我们miRNome测序表明,mir - 1290是在肝癌病人serum-derived液囊,我们发现mir - 1290交付到人类内皮细胞增强血管生成能力。我们的结果进一步表明,SMEK1 mir - 1290在内皮细胞的直接目标。mir - 1290对其proangiogenic功能,至少在某种程度上,通过减轻VEGFR2磷酸化的抑制由SMEK1完成。总的来说,我们的研究结果提供的证据表明,在肝细胞癌中mir - 1290是过表达的通过exosomal分泌和促进肿瘤血管生成,暗示其潜在的角色作为肝癌的治疗目标。

1。介绍

肝细胞癌是第五位全球最常见的癌症和癌症相关死亡的第三大原因(1]。肝细胞癌是一种高度血管化肿瘤肝内和肝外转移频繁,负责快速复发和穷人生存(2]。因此,迫切需要探索肿瘤血管生成和转移的分子机制,这将提供潜在的有效的治疗方法来改善肝癌患者的生存。

小分子核糖核酸(microrna)是一个非编码rna的家庭,长度约22元,抑制基因表达的配对3′未翻译的区域目标信使rna (mrna) [3]。microrna是参与和发挥至关重要的作用在各种各样的生物过程,如肿瘤恶化[4]。放松管制的microrna有助于血管生成和转移的各种人类癌症包括肝细胞癌(5- - - - - -7]。例如,microRNA-26a报道抑制肝癌血管生成的靶向HGF-cMet途径(8]。最近,新兴的证据显示,microrna可以分泌到肿瘤微环境通过液调解癌细胞和肿瘤微环境之间的串扰9- - - - - -12]。

液很小(40 - 100 nm)膜囊泡释放到细胞外环境(13]。据报道,液含有microrna选择性地从母细胞丰富14]。循环exosomal microrna可能有额外的优势超过“免费”microrna标志物。许多等离子体exosomal microrna报告作为诊断,预后,甚至治疗癌症患者体内的生物标记物(15- - - - - -17]。例如,exosomal mir - 1290和mir - 375在castration-resistant前列腺癌预后标记(18]。Exosomal mir - 210可以直接交付到内皮细胞和抑制SMAD4的表达和STAT6,导致增强肝癌血管生成(19]。然而,exosomal microrna在肝癌发展的基本机制,尤其是在肝细胞癌的肿瘤血管生成,在很大程度上仍是个未知数。

在这项研究中,通过RNA序列和中存在验证,我们发现,mir - 1290肝癌病人中高度表达serum-derived液。使用增益功能丧失的分析,我们进一步证明了proangiogenic mir - 1290的功能调节肝细胞和肿瘤内皮细胞之间的串扰。此外,我们发现SMEK1善意的在内皮细胞mir - 1290的目标。mir - 1290对其proangiogenic功能,至少在某种程度上,通过减轻VEGFR2磷酸化的抑制由SMEK1完成。总的来说,我们的研究表明,exosomal microrna - 1290可能发挥重要作用在细胞间通讯在肝癌肿瘤血管生成。

2。材料和方法

2.1。临床标本

主要HCC肿瘤样本,配对肿瘤邻近的组织,和49肝癌患者的血清样本血清样本28健康个体获得从天津第一中心医院。其中,六名肝癌患者血清样本和两个健康个体受到miRNome测序。血清样本和手术切除组织在液态氮冷冻和运输。所有的样本获得的书面知情同意病人和天津第一中心医院的伦理委员会的批准和南开大学医学院。

2.2。实验动物

成年雄性BALB /c和NOD-SCID老鼠命令形式HuaFuKang生物科技有限公司(中国,北京),坐落在特定病原体自由的环境条件。所有老鼠实验按照标准操作程序研究所研究伦理委员会批准的南开大学。

2.3。外来体净化

外来体从血清和细胞上清液中提取样本使用外来体隔离试剂(Ribobio有限公司,中国)进行根据制造商的协议。电子显微镜,血清被离心300×事先批准5分钟,2000×10分钟,然后在10000×60分钟。液是由超速离心法分离100000×130分钟,其次是PBS超速离心法相同条件下清洗。液在100年resuspendedμl PBS, 2%多聚甲醛固定,装上200 -网格Formvar-coated网格,对比,和嵌入式成像。

2.4。细胞系和试剂

人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人类肝癌细胞系Hep3 B和HepG2是从写明ATCC获得的。肝癌细胞株smmc - 7721 PLC /脉冲重复频率/ 5,正常的人类肝细胞细胞系L-02购买来自中国科学院(中国上海)。HepG2 Hep3 B, PLC /脉冲重复频率/ 5细胞培养在MEM含10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100μg / ml不必要的氨基酸。smmc - 7721细胞生长在DMEM含有10%的边后卫和100 U /毫升青霉素和链霉素。L-02和HUVECs rpmi - 1640年培养含有10%的边后卫和100 U /毫升青霉素和链霉素。mir - 1290模拟、抑制剂、agomir antagomir, mir - 1290由Ribobio有限公司设计并合成mimic-FAM mir - 1290模拟序列和agomir UGGAUUUUUGGAUCAGGGA和mir - 1290缓蚀剂的序列和antagomir UCCCUGAUCCAAAAAUCCA。mir - 1290 agomir和antagomir都用2′核苷酸-O-methyl修改。mir - 1290模拟和抑制剂瞬变转染lipofectamine 2000(英杰公司)根据生产的协议。

2.5。细胞生存能力分析

对细胞生存能力分析,HUVECs被播种在96 - 100年孔板μl中等,其次是转染与50 nM mir - 1290模拟。每组五个平行井被分配。36(0)24日,48岁和60 h转染后,CCK-8解决方案(10μl)被添加到每个好,吸光度值测定在450 nm孵化后1.5 h 37°C。

2.6。RNA提取和定量实时PCR(存在)

组织在试剂盒使用均质器磨试剂(美国表达载体)。收集细胞,水洗,在试剂盒试剂和细胞溶解,总RNA分离后,制造商的指示。使用标准执行中存在SYBR-Green PCR设备协议。引物在表列出S1。

2.7。西方墨点法

西方墨点法进行按照先前的协议(20.]。短暂,蛋白质被加载在5 - 12% tris-acrylamide凝胶和膜涂抹与特定的抗体。本研究中使用的主要抗体SMEK1 (ab70635 Abcam) pVEGFR2(# 4991,细胞信号技术)和VEGFR2(# 9698,细胞信号技术)的稀释1:1000。乐队被发现使用凝胶成像系统(SYNGENE)。

2.8。质粒建设和转染

人类SMEK1 cDNA克隆和结扎HUVECs pLV-EF1α-MCS-IRES-Bsd向量(Biosettia Inc .)。Hep3 smmc - 7721 B和HUVECs (3×10⁵细胞/)被播种在6-well盘子,孵化一夜之间,然后转染mir - 1290模拟使用lipofectamine 2000(表达载体)和Opti-MEM(康宁)根据制造商的指示。引物在表列出S2。

2.9。细胞迁移实验

细胞迁移是评估通过执行愈合和transwell化验。愈合试验,细胞被播种在6-well板块2×10⁵每口井的细胞,转染48 h后,细胞单层使用10刮μl小费。初始间隙长度和受伤后的残余缺口长度计算基于显微照片使用ImageJ软件。transwell化验,转染24 h后,细胞被镀在24-well板块5×10⁴上8μm钱伯斯(BD生物科学)。中含有10%的边后卫在低和2%的边后卫在参议院担任化学引诱物。另一个16 h孵化后,细胞在膜的上表面被刮掉,那些在底部与结晶紫染色。这些细胞使用光学显微镜拍摄。

2.10。管形成和基底膜基质填补化验

管的形成分析,prechilled 48-well板涂上150年μl(基底膜基质(BD生物科学)和孵化37°C 30分钟。HUVECs (3×10⁴细胞/)转染mir - 1290然后播种板。5 h后,拍摄照片,和管数。

为在活的有机体内人工基底膜试验,雄性BALB /c小鼠皮下注射750管理μ包含500 l的混合物μl人工基底膜和250μl EBM2介质有或没有10 nmol mir - 1290 agomir(3两组老鼠)。10天后,基底膜基质插头成像和快速冷冻的最佳切削温度(10月)切片前介质。冰冻的基底膜基质部分(8μ米)被固定在冷甲醇和应用CD31抗体(美国Abcam ab28364)。

2.11。免疫荧光染色

幻灯片被封锁2% BSA,然后用一个孵化anti-CD31抗体(ab28364 Abcam) 1 h。fluorophore-conjugated二级抗体孵化和PBS洗涤后,幻灯片与DAPI孵化(表达载体)2分钟。获得的图像使用显微镜(奥林巴斯IX73)。

2.12。双荧光素酶报告实验

HUVECs在24-well培养板的密度2×10⁵细胞/好一夜之间,其次是cotransfection mir - 1290模拟,pmirGLO, pRL-TK质粒。36 h转染后,抑制mir - 1290被量化为萤火虫荧光素酶活性的比值Renilla荧光素酶活性在每个。

2.13。肿瘤异种移植

男性NOD-SCID老鼠(6周)分离随机分为两组(n= 6),2×10⁶smmc - 7721细胞皮下接种到每个鼠标,和肿瘤被允许种植了10天。肿瘤瘤旁处理10 nmol mir - 1290 antagomir microrna antagomir负控制(数控)每三天,和肿瘤体积每3天用游标卡尺测量一次。

2.14。免疫组织化学(包含IHC)

包含IHC染色进行使用石蜡包埋人类肝细胞癌组织和鼠标异种移植肿瘤。分别探讨了这些组织的抗体SMEK1 (ab70635 Abcam) pVEGFR2(# 4991,细胞信号技术),Ki67 (ab16667 Abcam) cleaved-caspase 3(# 9664,细胞信号技术)和CD31 (ab28364 Abcam) 1: 100稀释。

2.15。统计分析

使用SPSS 23.0软件进行统计分析;提出了从所有实验数据意味着±SD和代表三个独立的实验。一个配对t以及被用来比较基因表达在肿瘤和邻nontumor组织样本。在适当的地方,一个学生的t对未配对的观察以及应用。的值 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。mir - 1290是高度表达的肝癌病人Serum-Derived液囊,肿瘤组织和肝癌细胞株

发现microrna在肝癌病人serum-derived液囊,特异表达我们收集从健康的个人和肝细胞癌患者血清液执行RNA-seq(图1(a))。我们完全确定microrna表达(表599不同S3)。过滤后(| log2褶皱变化|≥1,值< 0.05),我们获得5调节和72个表达下调microrna(图1(b))。由于调节microrna是方便的生物标志物和肝癌的潜在治疗靶点,我们继续验证调节microrna,包括mir - 1290, mir - 1246, mir - 4497, mir - 1261和mir - 7641。在这些调节microrna,我们我们关注mir - 1290因为mir - 1290是最高的调节microrna(图1(c))。确认的upregulation mir - 1290在肝细胞癌患者中,我们进一步测量其表达serum-derived液从28健康个体和49肝癌患者。结果显示,mir - 1290的表达明显增加血清液来自49个HCC患者比那些来自28个健康人(图1(d))。我们还发现mir - 1290的表达水平,这49个冻肝癌组织和配对癌症邻近组织。我们的存在结果表明,mir - 1290肝癌组织中的表达显著升高(图1(e))。此外,我们评估了mir - 1290 4肝癌细胞系的表达,包括HepG2 Hep3 B, smmc - 7721和PLC /脉冲重复频率/ 5和液来自媒介。一个永生化肝细胞系L-02被用作控制。我们的研究结果表明,mir - 1290的表达水平相对较高HepG2 smmc - 7721细胞以及液(图1(f))。综上所述,上述观察结果表明,mir - 1290在肝细胞癌中,cancer-cell-secreted液。

3.2。HCC-Derived Exosomal mir - 1290目标内皮细胞促进肿瘤血管生成

接下来,我们搬到验证是否HCC-derived exosomal mir - 1290可以改变肿瘤微环境通过针对内皮细胞和肿瘤血管生成。为此,我们首先在HepG2发现mir - 1290的表达,smmc - 7721和HUVECs。如图2(一),mir - 1290的表达在HepG2显著增加,smmc - 7721细胞相比,在HUVECs(图2(a))。进一步测试是否癌症细胞衍生液可以与HUVECs交互,我们收集了HepG2的液,smmc - 7721细胞标记和DiI的孵化他们HUVECs贴上戴奥。我们观察到colocalization DiI和戴奥信号HUVECs cocultured HCC-derived液囊,表明cancer-cell-secreted液可以与内皮细胞相互作用(图2(b))。我们也分析了mir - 1290是否可以从癌细胞HUVECs运输作为一个外来体货物。为此,我们转染smmc - 7721细胞与FAM-labeled mir - 1290模拟。液被来自媒介和HUVECs孵化。结果证实,FAM-labeled mir - 1290模拟在HUVECs被发现(图2(c)),证明HCC-secreted mir - 1290可以从癌细胞HUVECs运输通过液。

此外,我们检查了mir - 1290是否改变HUVECs的功能。首先,我们执行CCK-8试验检测细胞活力的HUVECs mir - 1290模拟和抑制剂,分别。如图2(d), mir - 1290模拟的超表达显著增强细胞活力48-60转染后h;然而,mir - 1290缓蚀剂进行相反的效果,降低细胞生存能力。此外,我们测量的管形成能力HUVECs回应mir - 1290模拟或抑制剂转染。我们发现的能力HUVECs人工基底膜上形成管状结构增加了mir - 1290模拟但减少了mir - 1290抑制剂(图2(e))。愈合和Transwell分析进一步表明,mir - 1290模拟显著加速HUVECs迁移,而mir - 1290抑制剂降低这种影响(数据2(f)和2(g))。这些结果共同表明,mir - 1290可能促进内皮功能和肿瘤血管生成在体外。

3.3。mir - 1290促进肿瘤血管生成在活的有机体内

确定mir - 1290是否参与肿瘤血管生成在活的有机体内,基底膜基质插头化验在BALB /执行c老鼠。如图3(a),新生成的血管基底膜基质插头增加小鼠接受mir - 1290 agomir,相比数控agomir组。Immunofluorescent CD31染色进一步透露,mir - 1290治疗agomir导致显著增加微血管密度在插头部分。

相反,我们建立了一个smmc - 7721在NOD-SCID裸鼠异种移植瘤模型使用mir - 1290和数控antagomirs,分别。结果表明,肿瘤体积和重量明显减少小鼠瘤旁注射mir - 1290 antagomir相比老鼠注射数控antagomir(数字3(一)-3(d))。免疫组织化学的差别分析还揭示了对这些Ki67的upregulation cleaved-caspase 3 mir - 1290 antagomir-treated肿瘤,表明减少细胞增殖和细胞凋亡增加(图3(e))。重要的是,减少血管生成在mir - 1290 antagomir-treated肿瘤,如评估CD31染色(图3(f))。此外,我们49 HCC患者分为两组根据他们mir - 1290表达的水平。临床关联分析表明,高水平的mir - 1290与更大的肿瘤大小和先进的临床阶段(表1)。CD31的值得注意的是,包含IHC染色显示肿瘤的微血管密度增加mir - 1290高表达与肿瘤mir - 1290表达较低(图3(g)),这是符合我们的研究结果显示,mir - 1290作为癌基因促进肿瘤血管生成在体外和在活的有机体内。

3.4。SMEK1直接在HUVECs mir - 1290的目标

调查的潜在目标基因mir - 1290在血管生成过程中,我们进行了一个microrna的目标基因预测与Targetscan数据库和找到10个候选基因,已报告在调节血管生成(图4(a))。然后执行中存在检测这10个候选基因的mRNA水平HUVECs转染mir - 1290模拟。结果表明,所有这些mir - 1290潜在目标被mir - 1290模拟转染表达下调(图4(b))。此外,我们克隆3′UTR这些基因片段为pmirGLO荧光素酶报告系统,分别。荧光素酶分析的结果显示显著的抑制野生型SMEK1 3′UTR记者回应mir - 1290模拟治疗在HUVECs(图4(c))。然而,这种效应明显被使用变异SMEK1 3′UTR(数据4(d) -4(e))。进一步证实mir - 1290和SMEK1之间的相关性,我们发现在HUVECs SMEK1的表达转染mir - 1290模拟。我们的结果表明转染mir - 1290模拟表达下调SMEK1 mRNA和蛋白表达水平在剂量依赖性的方式(图4(f)),这表明SMEK1直接mir - 1290的目标。免疫印迹(图S1 (a))和免疫组织化学的分析还显示upregulation SMEK1(图S1 (b)的差别),而对这些pVEGFR2(图S1 (c)在前面的mir - 1290) antagomir-treated异种移植。

3.5。SMEK1减少内皮细胞的血管生成能力

考虑到SMEK1已经报告给函数的抗血管新生因子通过抑制磷酸化VEGFR2 HUVECs [21),我们进一步研究了内皮细胞表型反应SMEK1干扰。存在和免疫印迹分析显示,HUVECs SMEK1信使rna和蛋白质水平降低转染与两个独立SMEK1 shrna(数字5(一)和5(b))。值得注意的是,我们发现HUVEC的能力,形成管状结构的基底膜基质增加了SMEK1击倒(图5(c))。愈合和SMEK1 Transwell化验还透露,损耗显著提升HUVECs(数据的迁移5(d)和5(e)),确认SMEK1可能作为肿瘤抑制抑制肝癌的血管内皮功能。

3.6。SMEK1介导mir - 1290诱导Proangiogenic表型

接下来,研究是否mir - 1290对其通过SMEK1 proangiogenic功能,我们过表达SMEK1缺乏3′UTR HUVECs通过慢病毒转染。如数据所示6(一)和6(b),超表达SMEK1 HUVECs可以恢复的信使rna和蛋白质含量SMEK1 mir - 1290模拟的存在。此外,拯救SMEK1表达显著减弱VEGFR2的磷酸化mir - 1290治疗模拟(图6(b))。重要的是,管形成、愈合和迁移分析进一步表明,恢复SMEK1废除mir - 1290在HUVECs mimic-induced内皮功能(数据6(c) -6(e))。这些结果暗示SMEK1集体是一个善意的mir - 1290的目标协调的作用促进肿瘤血管生成和发展。

4所示。讨论

肿瘤血管生成是负责增长、入侵和转移的肝细胞癌(2]。越来越多的证据表明,microrna在HCC的障碍影响肿瘤血管生成(22- - - - - -25]。在目前的研究中,我们表明,mir - 1290通过SMEK1施加proangiogenic功能。我们表明,mir - 1290会使SMEK1 mRNA和蛋白表达水平。此外,mir - 1290抑制野生型的荧光素酶活性而不是突变3′UTR SMEK1。获得和功能丧失分析,我们进一步证明SMEK1可以减少内皮细胞的血管生成能力。此外,恢复SMEK1表达显著破坏mir - 1290诱导VEGFR2磷酸化和内皮细胞在肝细胞癌的血管生成表型。根据我们的在活的有机体内异种移植实验,mir - 1290管理antagomir有效减少肿瘤血管生成和发展,提供证据表明,针对mir - 1290可能是一个潜在的战略angiogenesis-based癌症治疗。

mir - 1290已报道的制造商几个人类癌症,包括胰腺癌、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌(26- - - - - -30.]。这些研究表明,mir - 1290功能作为癌基因促进肿瘤进展。例如,microrna的数组的检测分析表明,升高血清mir - 1290有潜力提高胰腺癌的早期检测(31日]。另一项研究显示,mir - 1290作为关键驱动肿瘤起始和发展人类非小细胞肺癌(32]。然而,mir - 1290的功能在HCC基本上仍模糊。在目前的研究中,我们扩展研究,mir - 1290肝癌病人中高度表达serum-derived液,肿瘤组织和肝癌细胞株。此外,异位mir - 1290从肿瘤细胞分泌到周边微环境和交付到内皮细胞通过液。反过来,mir - 1290表达下调SMEK1表达和增强VEGFR2磷酸化的内皮细胞,最终加剧肝细胞癌发展通过促进肿瘤血管生成。我们的结果与先前的报道是一致的,SMEK1控制内皮细胞功能和随后的血管生成抑制VEGFR2-mediated PI3 K / Akt /以挪士信号通路。(21]。

鉴于VEGF函数作为一个关键因素促进肝癌的血管异常,众多研究人员关注microrna能目标VEGF或其他特异表达基因改变VEGF的表达。例如,据报道,mir - 195直接抑制肝癌的血管生成抑制VEGF的表达(33]。此外,miR-29 c目标VEGFA肺腺癌的抑制肿瘤血管生成34]。在这项研究中,我们描述了一种新的途径,肿瘤细胞通过分泌促进血管再生液含有mir - 1290到周围的微环境。从力学上看,mir - 1290装在液被接受者内皮细胞实验,随后下调SMEK1,因此通过VEGFR2-mediated行动导致增强的肿瘤血管生成。符合这一点,tumor-derived液已被证明改造肿瘤及其转移环境(35- - - - - -38]。肿瘤细胞可以使用液作为货物转移血管生成因素,包括蛋白质和microrna [39]。最近,它已经表明,液释放人类肾癌干细胞引发肺血管生成,形成prometastatic利基(40]。符合这些,我们现在的研究发现分泌mir - 1290的作用作为一个重要的中介在肝细胞和内皮细胞之间的串扰。

5。结论

根据我们的数据,mir - 1290是在肝癌病人serum-derived液囊,和mir - 1290交付的人类增强内皮细胞血管生成能力,减轻VEGFR2磷酸化的抑制由SMEK1完成。我们的研究结果强调的重要性exosomal microrna - 1290肝癌血管生成,暗示mir - 1290作为肝癌的一个潜在的治疗目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

手稿已经作为预印本https://www.researchsquare.com/article/rs-3896/v2。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81972454和81972454号)。

补充材料

图S1。mir - 1290目标SMEK1 insmmc S1 - 7721异种移植表。列表中使用的引物中存在的反应。表S2。列表中使用的引物PCR克隆的反应。表S3。microrna的测序结果。(补充材料)

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