文摘
38溶质载体家庭成员1 (SLC38A1)是一个主要谷氨酰胺转运体,起着至关重要的作用在肿瘤细胞的变换。然而,SLC38A1表达之间的相关性、预后和免疫渗透在肝细胞癌(HCC)尚未阐明。我们使用两个独立的病人群体,即癌症TCGA基因组图谱()组和临床肿瘤蛋白质组学分析财团(CPTAC)队列,分析角色在HCC SLC38A1信使rna和蛋白质的水平,分别。在这两个军团,SLC38A1 mRNA和蛋白在肝癌组织中表达水平高于邻近nontumor组织。SLC38A1 mRNA和蛋白表达与临床病理特征呈正相关(临床阶段,T阶段,病理评分、肿瘤大小和肿瘤血栓)、消极与生存相关,肝细胞癌患者的独立预后因素。功能富集分析进一步表明,SLC38A1参与多个通路与氨基酸代谢有关,肿瘤和免疫。高表达水平SLC38A1是成反比的CD8 + T细胞和巨噬细胞M0成正比,中性粒细胞,程序性细胞死亡1 /细胞程序性死亡配体1 (PD-1 / PD-L1),和细胞毒性T lymphocyte-associated蛋白4 (CTLA-4)。此外,我们使用免疫组织化学分析的组织样本和其他在线数据库进一步验证表达水平和SLC38A1在肝细胞癌的预后意义。总的来说,我们的研究表明,调节SLC38A1不利预后有关的表达和肝细胞癌中有缺陷的免疫渗透。
1。介绍
肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肿瘤的肝和全球癌症相关死亡的第四大原因(1]。先前的研究是基于监测、流行病学、最终结果程序(SEER)注册表项目表明,肝癌的发病率在未来将继续上升,预计在2030年达到峰值(2]。而肝癌治疗策略和新疗法的出现,扩大了病人在晚期肝细胞癌的预后仍相对不满意(3]。因此,确定一个有效的生物标志物具有重要意义,可以预测预后,可以作为治疗目标为肝癌患者(4]。
溶质载体家庭38 (SLC38)是主体对谷氨酰胺转运体和在体内维持体内平衡中起着重要作用[5]。谷氨酰胺在哺乳动物细胞有大量的重要功能;因此,SLC38运输车的失调可能导致肿瘤发生和癌症的恶化6]。SLC38运输车已被描述为有系统的功能性质和监管模式和系统N运输活动7]。作为系统的第一个成员,SLC38A1主要是表现在胎盘和大脑8]。和其他家庭成员一样,SLC38A1的主要功能是调节运输短链中性氨基酸,包括谷氨酰胺。虽然upregulation SLC38A1表达式已经证明在各种肿瘤(9- - - - - -12)的预后意义尚未在HCC SLC38A1表达式。此外,免疫疗法已被认为是一种很有前途的治疗癌症,包括肝细胞癌。也有可能,肿瘤浸润淋巴细胞可能影响免疫治疗的疗效。然而,SLC38A1表达之间的相关性和免疫渗透在HCC尚未确定。
在目前的研究中,我们使用各种公共数据库,全面分析SLC38A1并评估其预后意义的表达在mRNA和蛋白水平。我们进一步验证了微分表达水平之间的SLC38A1 HCC和相邻nontumor组织进行免疫组织化学(包含IHC)在我们的组织样本。我们还执行多重富集分析探索潜在的分子机制可能由SLC38A1肝癌。此外,我们调查了SLC38A1表达与肿瘤浸润免疫细胞之间的相关性(TIICs)或免疫检查点。这些分析表明,SLC38A1上级表达肝细胞癌和与不利预后和免疫缺陷的渗透。
2。材料和方法
2.1。TCGA mRNA表达和临床数据的数据库
我们使用了癌症基因组图谱(TCGA)数据库调查SLC38A1在HCC的mRNA表达模式。我们下载的转录组和相应的临床数据对肝癌病人的基因组数据共享数据门户(https://portal.gdc.cancer.gov/)。TCGA RNAseq数据包括424个样本,374个样本的肝癌组织和50相邻肝组织的样本。我们选择肝癌样本和一套完整的临床信息的后续分析的临床意义。临床病理的特点包括年龄、性别、病理,临床分期,肿瘤阶段(T),淋巴转移(N),远处转移(M),存活时间,和生存状态。
2.2。蛋白表达和临床数据从CPTAC数据库
我们使用的临床肿瘤蛋白质组学分析财团(CPTAC)数据库,探索SLC38A1在肝细胞癌的蛋白质表达谱。CPTAC数据库是一个集中的数据存储库的蛋白质组学数据集和多种癌症的临床数据(https://proteomics.cancer.gov/data-portal)。我们下载并提取相关的蛋白表达数据SLC38A1 CPTAC-HCC蛋白质组和相应的临床资料,其中包括159肿瘤组织和邻近的肝组织的样本。非共享log-ratio值被定义为蛋白表达的价值。临床病理的特点包括年龄、性别、肿瘤分化、肝硬化病史,肿瘤大小、肿瘤血栓,肿瘤封装,和生存时间。
2.3。其他在线数据库的分析
Oncomine数据库715数据集和86733样本组合到一个全面的数据库,旨在帮助研究人员设计出更好的实验和获得更健壮的结果(https://www.oncomine.org/)[13]。我们进行了多元分析使用Oncomine SLC38A1 RNA表达数据库的阈值p≤0.01和褶皱的变化(FC)≥1.5。肝细胞癌的表达图谱数据库(HCCDB)是一个在线资源全面注释肝癌基因表达,包括公共HCC表达式从4000个样本数据集(15http://lifeome.net/database/hccdb/home.html)[14]。我们使用这个数据库进一步确认是否mRNA SLC38A1在肝癌组织的表达高于nontumor组织。kaplan meier绘图仪数据库提供了一个方便的方式来评估多种基因对患者生存的影响21不同癌症类型(http://kmplot.com/analysis/)[15]。在目前的研究中,我们使用这个数据库来验证的相关性SLC38A1表达与肝细胞癌患者的预后。
2.4。免疫组织化学
我们回顾性收集30对石蜡包埋肝癌组织和邻近nontumor组织样本从手术发生2019年5月至2020年12月在河北医科大学第三医院。本研究经伦理委员会批准的河北医科大学第三医院和实施符合赫尔辛基宣言的原则。需要知情同意放弃了河北医科大学第三医院伦理委员会给出的回顾性研究。
石蜡包埋组织标本切片,deparaffinized,补充水分,煮在高压锅抗原检索。部分被孵化与3%过氧化氢活性内源性过氧化物酶活性。接下来,样品被封锁在一夜之间10%山羊血清和孵化兔子反主SLC38A1抗体在4°C (Proteintech,中国)。接下来,部分与山羊孵化anti-rabbit辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(ZSGB-Bio,中国)37°C。最后,部分是孵化3 3′-diaminobenzidine (DAB)与苏木精染色。两名有经验的病理学家独立评估了样本。每个组织样本得分根据染色强度和比例(%)的肿瘤细胞染色。分数范围从0到3;得分为0 - 1被认为是消极的污点,而分2 - 3被认为是积极的污点。
2.5。基因集富集分析(GSEA)
我们使用GSEA软件(版本4.1.0)探索SLC38A1的潜在信号通路可能参与肝细胞癌。在这项研究中,我们分类样品为高或low-SLC38A1表型依照TCGA SLC38A1表达式的中值从数据库。带注释的基因集(c2.cp.kegg.v7.3.symbols.gmt)被用作内部基因集。表型浓缩通路是基于名义排序价值和归一化富集得分(NES) [16]。名义上的价值和错误发现率(罗斯福)核反应能量小于0.05被认为是具有统计学意义。
2.6。基因Coexpression / KEGG富集分析
我们筛选的基因与SLC38A1 coexpressed CPTAC数据库。那些绝对值的皮尔森相关系数R | |≥0.4,p值< 0.001被选为筛选阈值。然后,我们执行基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)浓缩coexpression基因的分析R包“clusterProfiler”(版本3.18.1)使用多个数据库,包括疾病本体数据库、网络癌症基因数据库,数据库本体,KEGG数据库,和Reactome通路数据库(17]。之前执行富集分析,基因符号编码转换为可以利用人类基因组注释包”org.Hs.eg.db ID。“调整p值< 0.05被认为是具有统计学意义。
2.7。分析免疫相关景观SLC38A1的表达水平
CIBERSORT是一个工具deconvolving免疫细胞亚型的表达矩阵基于线性支持向量回归的原则(http://cibersort.stanford.edu/)[18]。使用CIBERSORT分析,可以估计肿瘤浸润免疫细胞的比例(TIICs)。在这项研究中,我们计算的比例22 TIICs TCGA肝癌样本数据集。肿瘤样本的p值< 0.05被选为后续分析。然后我们进行微分,相关分析评估SLC38A1表达之间的相关性和TIICs或免疫检查点。微分分析,我们将样品分成高和low-SLC38A1表达组与中位数水平SLC38A1表达式。的相关分析,我们的筛选标准是一个R | |≥0p值< 0.05。
2.8。统计分析
统计分析进行IHC数据使用SPSS软件(版本23.0)和McNemar检验法测试。所有TCGA的统计分析和CPTAC数据集进行R软件(版本4.0.3)。SLC38A1表达式的中值水平被认为是作为截断值。协会的临床病理的特点与SLC38A1表达式分析了Wilcoxon的排名和测试或克鲁斯卡尔-沃利斯等级和测试和逻辑回归。SLC38A1表情生存的影响被kaplan meier评估方法,其次是生存率较。SLC38A1表达与其他临床病理特征的影响生存比较采用单变量和多变量Cox回归。接受者操作特征(ROC)曲线和曲线下的面积(AUC)被用来比较SLC38A1表达式的预测精度与其他临床病理的特点。相关分析基因的表达被斯皮尔曼相关系数和评估统计学意义。一个p值或罗斯福< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。SLC38A1调节在肝细胞癌的表达水平
本研究中使用的分析流程如图1。我们首先进行了荟萃分析SLC38A1 mRNA水平从Oncomine数据库包括四个肝癌研究,使用相同的阈值如上所述19- - - - - -21]。我们的分析表明,SLC38A1 mRNA表达的肿瘤组明显高于nontumor组(图2(一个))。然后,我们分析了TCGA的SLC38A1 mRNA和蛋白表达和CPTAC数据库,分别。我们的研究结果表明,SLC38A1 mRNA和蛋白表达的调节在肿瘤样本相比邻nontumor样本(数据2 (b)和2 (c))。此外,在线HCCDB数据库显示一致的结果基于基因表达数据综合(GEO)和国际癌症基因组联盟(ICGC)数据集。进一步的细节补充表中给出1。此外,IHC染色结果从30配对HCC组织在我们医院进一步确诊的蛋白质含量明显高于SLC38A1在肿瘤组织(76.7%比46.7%,p< 0.05)。代表的免疫组织化学图像SLC38A1蛋白表达在图所示2 (d)。总的来说,这些数据表明SLC38A1表达调节肝细胞癌。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。SLC38A1表达式的Upregulation预测肝癌患者预后差
首先,我们评估的影响SLC38A1表情生存TCGA使用数据集。我们发现高表达水平的SLC38A1明显与可怜的总生存期(OS),无进展生存(PFS)和特定疾病生存(DSS) (p= 0.002p= 0.003,p= 0.009,分别;数据3(一个)和3 (c))。然后,我们使用在线kaplan meier绘图仪数据库来验证SLC38A1在肝细胞癌的预后价值和结果符合TCGA数据库(数据3 (d)和3 (e))。我们还利用CPTAC数据库进一步验证SLC38A1蛋白质的表达水平和预后之间的关系;SLC38A1表达水平越高,更糟糕的是肝细胞癌患者的预后(p= 0.004,图3 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。SLC38A1的表达水平与肝细胞癌患者的临床病理的特点有关
如数据所示4(一)和4 (c),调节SLC38A1的mRNA表达与肿瘤的病理评分显著相关(p= 8.124 e-04)、临床分期(p= 0.001)T阶段(pTCGA = 6.295 e-04),基于数据库。数据4 (d)和4 (f)表明高蛋白SLC38A1水平与肿瘤分化显著相关(p= 0.028),肿瘤大小(p= 0.026)和肿瘤血栓(p= 0.003),基于CPTAC数据库。单变量逻辑回归分析进一步表明,upregulation SLC38A1表达肝细胞癌明显与病理级别高,临床阶段,T阶段,肿瘤分化和肿瘤血栓(表1和2)。这些结果进一步表明upregulation SLC38A1表达较差的临床病理特征显著相关,表明HCC患者高水平的SLC38A1表达更有可能发展到高级阶段比低水平的SLC38A1表达式。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。SLC38A1代表肝细胞癌患者的独立预后因素
如数据所示5(一个)和5 (b),单变量cox回归分析显示,高水平的SLC38A1表达明显与贫穷相关操作系统(风险定量[HR]: 1.482, 95%可信区间[CI]: 1.232 - -1.784,P< 0.001;人力资源:2.305,95% CI: 1.466—-3.623,P< 0.001,从TCGA和CPTAC数据库,分别)。尽管其他临床病理的特点包括临床阶段,T阶段,米阶段、分化、肿瘤大小和肿瘤血栓,也与操作系统,基于单变量cox回归分析,只剩下SLC38A1的表达水平与操作系统有关,当我们进行多变量cox回归分析(人力资源:1.397,95% CI: 1.144—-1.705,P< 0.001;人力资源:1.766,95% ci: 1.061—-2.940,P分别为= 0.029),如图5 (c)和5 (d)。因此,我们的单变量和多变量Cox回归分析表明,SLC38A1的表达水平是HCC患者的独立预后因素。进一步评估预测的准确性SLC38A1表达式,我们执行中华民国。相对于其他预测因素(年龄、性别、肿瘤病理分级、临床阶段,T阶段,N阶段米阶段),AUC SLC38A1表达更大(AUC = 0.734,图6)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。潜在的分子机制可能由SLC38A1肝癌
3.5.1。GSEA
我们执行GSEA高-和low-SLC38A1表达表型探索潜在的信号通路TCGA基于数据集。根据NES和罗斯福的价值观,我们选择极大地丰富KEGG信号通路。我们确定了总共85信号通路中不同纯度高表达SLC38A1表型(补充表2)。最典型的丰富信号通路如图7;分析表明,多个通路相关的肿瘤和免疫不同纯度的高表达SLC38A1表型。
3.5.2。基因Coexpression / KEGG富集分析
进一步探索潜在的机制,可能是由在HCC SLC38A1蛋白质水平,我们进行了coexpression / KEGG富集分析,基于CPTAC数据库。根据R | |一个阈值集p值,共有158个基因被发现coexpressed SLC38A1和选择后续/ KEGG浓缩分析(补充表3)。注释显示142生物过程(BP), 48个分子功能(MF)和19个细胞组件(CC)条款大大丰富(调整p值< 0.05)。十大条件如图8(一个)。这些数据表明,基因与SLC38A1 coexpressed可能通过线粒体基质监管对肝癌的影响,pre-ribosome、氧化还原酶的活动,和小分子分解代谢的过程。此外,我们发现26 KEGG途径明显丰富(调整p值< 0.05),如图8 (b)。这些高纯度通路包括色氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸退化,PPAR信号通路。
(一)
(b)
3.6。SLC38A1的表达与肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)和免疫基因检查站
分析表达水平之间的相关性SLC38A1 TIICs,我们首先计算比例的22种TIICs CIBERSORT肝癌样本的分析(图9)。如数据所示10 ()和10 (b),我们获得的4和6种TIICs明显与SLC38A1表达式,分别是基于微分和相关分析。维恩图(图所示10 (c)),我们获得3种TIICs (CD8 + T细胞、巨噬细胞M0和中性粒细胞)与SLC38A1表达式,由微分和相关性分析。具体而言,高表达水平SLC38A1的CD8 + T细胞的数量成反比,直接与M0巨噬细胞和中性粒细胞的数量成正比。同样,我们使用了微分分析和相关分析来评估SLC38A1表达和免疫之间的关系检查点(PD-1、PD-L1和CTLA-4)。这些分析表明,高表达水平的SLC38A1 PD-1直接成正比,PD-L1, CTLA-4(图11)。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
4所示。讨论
主要谷氨酰胺转运体,SLC38A1选择性,在正常的人类大脑和胎盘组织中表达的生理8]。研究表明,SLC38A1在恶性肿瘤中,可以促进增殖、侵袭性和转移性肿瘤细胞的潜力(9- - - - - -12]。然而,在这项研究之前,SLC38A1对肝癌患者的预后意义尚不清楚。在目前的研究中,我们调查的临床意义,通过分析RNAseq SLC38A1和蛋白质组数据。这些公共数据库,包含IHC一起分析我们自己的组织样本,证实SLC38A1调节在肝细胞癌的表达。SLC38A1的mRNA和蛋白表达与肝细胞癌患者的临床病理的特点和结果。此外,我们探讨了SLC38A1表达之间的相关性和TIICs或免疫检查点;这些数据表明,调节SLC38A1的表达与肝细胞癌中有缺陷的免疫渗透。
在目前的研究中,我们从公共数据库合并的结果与我们自己的数据从包含IHC获得的组织样本和证实SLC38A1调节在肝细胞癌的表达水平;这是与之前的研究结果一致(9,22]。然而,这些研究评估的临床和预后意义SLC38A1 HCC患者的表达式。在目前的研究中,我们发现upregulation SLC38A1表达的预测对肝癌病人预后差。同样的,其他的研究也表明,高水平的SLC38A1表达式代表一个不利人类骨肉瘤预后指标,胆管细胞型肝癌,胃癌,急性髓系白血病(9- - - - - -12,23]。此外,我们的研究表明SLC38A1的表达水平与临床分期呈正相关,T阶段,病理评分、肿瘤大小和肿瘤血栓,但没有显著相关米阶段或者N阶段。由于小数量的M1和N1病人TCGA的数据库,它是不可能定义的精确协会SLC38A1表达与淋巴和远处转移。因此,有必要进行进一步的研究与更大的样本量来证实这一发现。此外,我们的单变量和多变量Cox回归分析表明,SLC38A1表达肝细胞癌患者预后的独立预测指标。更重要的是,预测的准确性SLC38A1表情略优于临床阶段。总的来说,这些结果强烈建议SLC38A1表达式是一个很好的对肝癌预后的生物标志物。
为了进一步探索潜在的机制可能是由SLC38A1在肝细胞癌,我们执行GSEA, coexpression分析,去和KEGG富集分析。GSEA结果表明高表达水平的表型特征SLC38A1显示浓缩与肿瘤相关的几种途径,包括JAK-STAT Wnt MAPK mTOR, TGF -β信号通路。KEGG通路富集分析的基因与SLC38A1 coexpressed进一步表明SLC38A1参与多种代谢途径,其中最重要的是氨基酸代谢;这些发现是类似于以前的报告。5因此,我们得出结论,SLC38A1参与物质代谢通路相关,肿瘤和免疫。然而,具体的监管机制需要进一步研究。
本研究的另一个主要发现是,与TIICs SLC38A1相关的表达水平在肝细胞癌。之前的研究表明,肿瘤浸润淋巴细胞可以作为在癌症患者生存的独立预测指标(24,25]。出于这个原因,我们探讨了相关性SLC38A1表达与肝细胞癌的免疫渗透。完善,CD8 + T细胞是主要的效应细胞对肿瘤和通过Fas-Fas配体刺激细胞死亡途径或通过释放穿孔素颗粒,消除肿瘤(26]。最近的一项研究证实,CD8 + T细胞的数量与患者的预后密切相关的各种肿瘤(27]。此外,最近的研究表明,中性粒细胞可以刺激肿瘤血管生成以及调节免疫抑制机制,促进肿瘤的生长和转移,同时也代表了一个生物标记的肿瘤预后[28,29日]。在目前的研究中,我们发现高表达水平的SLC38A1成反比CD8 + T细胞和巨噬细胞成正比M0和中性粒细胞;这解释了为什么高水平的SLC38A1可以预测预后不良,至少在部分。一系列免疫检查点,包括CTLA-4 PD-1, PD-L1,和淋巴细胞激活基因3 (LAG-3),已确认参与免疫耐受的诱导和维护在肝细胞癌(30.- - - - - -32]。此外,免疫抑制剂检查站显示治疗晚期肝癌患者在临床试验的潜力33,34]。因此,我们调查SLC38A1表达和免疫检查点之间的关系,发现高表达水平的SLC38A1直接正比于PD-1 PD-L1, CTLA-4。这表明,穷人HCC患者高水平的SLC38A1表达式的结果可能是由于免疫抑制微环境。因此,我们认为对肿瘤免疫学SLC38A1可能有潜在的影响。
这项研究的主要优势是我们全面分析SLC38A1的预后意义表达的RNA和蛋白质含量;先前的预测生物标记基于生物信息学挖掘主要是集中在RNA水平。此外,我们的研究人群不仅包括欧洲和美国人口也是亚洲人。总的来说,这些因素增加的可靠性和适用性SLC38A1作为肝细胞癌患者预后的生物标志物。然而,本研究仍然有一定的局限性,需要考虑。首先,有明显差异,TCGA和CPTAC数据库之间的临床特点。其次,具体SLC38A1表达和肿瘤免疫渗透之间的关系需要进一步调查。
5。结论
总之,我们系统地分析了SLC38A1表达的临床病理意义在肝细胞RNA和蛋白质含量。我们的研究表明,高水平的SLC38A1表达式与疾病进展和预后差相关,以及受损肝细胞癌的免疫渗透。
数据可用性
公共数据库的数据集可以从以下网站:发现癌症基因组图谱(TCGA)数据库:https://portal.gdc.cancer.gov/;临床肿瘤蛋白质组学分析联盟(CPTAC)数据库:https://proteomics.cancer.gov/data-portal;Oncomine数据库:https://www.oncomine.org/;肝细胞癌的表达图谱(HCCDB)数据库:http://lifeome.net/database/hccdb/home.html);和kaplan meier绘图仪数据库:http://kmplot.com/analysis/。
信息披露
Yun刘和永阳应考虑co-first作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关这项研究的出版物。
确认
作者想表达自己的感激之情EditSprings (https://www.editsprings.com/为专家提供语言服务)。这项工作是支持的科技研究和开发项目的邯郸市(批准号19422083010 - 22)。
补充材料
补充表1:细节的地理数据集系列和ICGC HCCDB数据库。补充表2:基因集富集在表型高。补充表3:coexpression SLC38A1的基因。(补充材料)