文摘

背景。芍药苷已报道在人类癌症起到抗肿瘤作用。然而,芍药苷在胃癌中的作用和潜在的分子机制是unelucidated。因此,我们决定芍药苷是否能表现出在胃癌细胞抗癌活性。方法。麻省理工是用来衡量芍药苷治疗后细胞的可行性。流式细胞仪进行检测细胞凋亡。伤口愈合和transwell入侵进行了化验检查细胞迁移和侵袭性活动。西方墨点法用于探索的机制芍药苷对肿瘤的抑制作用。结果。我们发现芍药苷抑制细胞生长,增强细胞凋亡,减少细胞入侵。值得注意的是,我们表明,芍药苷抑制小胡子的表达在胃癌细胞。小胡子废除的过度表达在胃癌细胞中芍药苷的抗肿瘤活性。小胡子的差别相比之下,对这些促进了芍药苷治疗的肿瘤抑制作用。结论。因此,针对小胡子与芍药苷可能是一个人类胃癌的治疗的新途径。

1。介绍

胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一1]。在全球范围内,胃癌1033701例新病例的报告,和胃癌是第五个最常诊断癌症。估计已经有782685人死亡,由于这种疾病,这是第三个癌症相关死亡的主要原因(1]。估计有27510个新的胃癌病例和11140胃癌症相关的死亡在美国2]。胃癌的一个风险因素幽门螺杆菌感染,导致胃癌的大多数情况下。此外,咸和保存食物,水果摄入量低,饮酒,吸烟也有助于胃癌(2]。虽然多学科治疗,包括手术、化疗和免疫治疗,一直在使用,胃癌患者的五年生存率仍然是大约20% -40%3]。因此,必须发现新的药物来治疗这种致命的疾病。

芍药苷从芍药根获得和具有多个功能,如调节免疫反应,预防痉挛,和预防低血压的综合症(4]。芍药苷也被证明有抗癌活动范围广泛的人类恶性肿瘤(4]。例如,芍药苷发挥其抗增殖效果通过调节细胞周期阻滞和Fas / Fas ligand-dependent细胞凋亡在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞(5]。发现芍药苷抑制bcl - 2的表达,促进伯灵顿和caspase-3的表达,导致细胞凋亡的诱导宫颈癌细胞(6]。此外,芍药苷抑制结直肠癌细胞通过诱导细胞周期阻滞和激活p53, caspase-3, caspase-9 [7]。同样,芍药苷在肝细胞癌(HCC)刺激细胞凋亡细胞通过抑制前列腺素E受体EP2 Bax-to-Bcl-2比例的提升,激活caspase-3 [7]。与这些研究结果一致,芍药苷抑制基质金属蛋白酶的表达(MMP-9)和细胞外signal-regulated激酶(ERK)和促进肝癌细胞钙粘蛋白的表达,从而抑制细胞迁移和入侵6]。这些结果清楚地表明,芍药苷具有抗肿瘤活性在人类癌症。

芍药苷的抗癌活动在胃癌和底层机制尚未全面调查。因此,在这项研究中,我们旨在确定芍药苷可以调节细胞生存能力,在胃癌细胞凋亡和细胞周期进程。此外,我们研究芍药苷是否能控制在胃癌细胞迁移和入侵。河马途径是发挥了重要作用的差别,对这些基因的胃癌肿瘤发生和进展的(8- - - - - -10]。河马途径提供有助于胃肿瘤发生和转移(10]。Yes-associated蛋白1 (YAP1)和小胡子,河马通路中的两个关键因素,产生致癌作用通过影响肺癌与切口、TGF -β,Wnt /β连环蛋白在胃癌(11]。因此,我们定义芍药苷对肿瘤抑制作用的分子机制通过监管的河马在胃癌信号通路。我们的研究结果提供的证据表明,芍药苷可能是一个潜在的代理治疗胃癌患者。

2。材料和方法

2.1。试剂

5-dimethyl-2-thiazolyl MTT (3 - (4) 2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium溴化)是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。芍药甙经环宇生物技术开发公司(中国,北京)。transwell室从BD生物科学试验设备购买。膜联蛋白细胞凋亡测定工具包是购自Beyotime生物技术(上海,中国)。Anti-TAZ,反β连环蛋白,anti-tubulin抗体购自细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。

2.2。细胞培养

人类胃癌MGC803 SGC7901细胞在DMEM培养(杜尔贝科修改鹰的介质)补充10%胎牛血清的边后卫,100μg / ml链霉素和100 U /毫升青霉素和孵化有限公司5%₂气氛在37°C。

2.3。MTT试验

MGC803和SGC7901胃癌细胞后孵化96 -孔板一夜之间,芍药苷细胞暴露于不同浓度的48 h和72 h。细胞生存能力以MTT试验来衡量,如前所述[12]。

2.4。细胞凋亡检测

MGC803 SGC7901胃癌细胞孵化在一夜之间6-well板块。然后,细胞暴露于不同浓度的芍药苷为72 h。凋亡细胞死亡测量使用膜联蛋白V-FITC /π的方法,如前所述[12]。

2.5。细胞周期分析

MGC803 SGC7901胃癌细胞培养和接受不同剂量的芍药苷72 h。细胞周期测定使用propidium碘染色方法,如前所述[13]。

2.6。伤口愈合实验

MGC803 SGC7901胃癌细胞培养在6-well盘子和增长到超过90%的融合。伤口成立于MGC803细胞使用无菌吸管小费。然后,细胞治疗与不同剂量的芍药苷20 h。照片被抓获使用显微镜显示病变部位的细胞迁移。

2.7。Transwell室入侵检测

细胞治疗是孵化前商会插入涂层与基底膜基质24-well盘子。完全培养基添加到室底部,而无血清培养基添加到前室。细胞培养20 h后,棉花花蕾被用来去除细胞室顶部。室底部的细胞是沾钙黄绿素是在37°C 1 h。使用荧光显微镜入侵细胞成像。

2.8。免疫印迹分析

治疗细胞细胞溶解在里帕缓冲区。蛋白质被加载在sds - page凝胶,随后转移到PVDF膜。蛋白表达被西方墨点法测量,如前所述[13]。

2.9。转染

MGC803 SGC7901细胞孵化6-well板块在一夜之间。小干扰rna或小胡子cDNA转染质粒含有小胡子MGC803和SGC7901细胞Lipofectamine 2000,(如前所述)(12]。

2.10。统计分析

GraphPad Prism 5.0(图垫软件,拉霍亚,CA)是用于统计分析。并给出了结果的平均值±标准差(SD)。使用方差分析之后,图基比较组间的因果检验。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。芍药苷抑制胃癌细胞的可行性

芍药苷可以发挥抗作用的人类癌症细胞(4]。研究芍药苷是否能抑制胃癌细胞的生存能力,胃癌MGC803细胞暴露于不同浓度的芍药苷为72 h。然后,MTT试验进行测量的可行性胃癌MGC803细胞芍药苷治疗后。我们MTT结果表明芍药苷抑制MGC803的可行性和SGC7901细胞剂量依赖性的方式(图1(一))。简单地说,接触到20μM和30μ芍药苷对72 h抑制了50%和70%,分别的可行性MGC803细胞(图1(一))。SGC7901细胞(图中也发现类似的结果1(一))。因此,我们选择了20μM和30μ芍药苷对我们的后续研究。我们的数据表明,芍药苷在胃癌细胞生存能力降低。

3.2。芍药苷诱导胃癌细胞的凋亡

已被接受,诱导细胞凋亡导致人类癌症细胞活力的抑制。众所周知,芍药苷诱导肿瘤细胞凋亡在许多癌症(4]。因此,我们决定芍药苷是否可以调节胃癌细胞的凋亡。一个膜联蛋白V-FITC /π试验是用来评估胃癌细胞的凋亡的死亡芍药苷治疗后。我们发现芍药苷增加胃癌MGC803细胞凋亡的程度从对照组的5.7%到15.93% 20μ在30 M芍药苷治疗组和32.51%μ芍药苷治疗组在72 h(图1 (b))。芍药苷也刺激了细胞凋亡在SGC7901细胞(图1 (b))。这些结果表明,芍药苷刺激胃癌细胞的凋亡。

3.3。芍药苷引起细胞周期阻滞在胃癌细胞

细胞周期阻滞芍药苷治疗后经常出现在各种各样的人类癌症4]。因此,细胞周期分析胃癌MGC803细胞治疗与芍药苷是由使用PI染色和流式细胞术。我们发现芍药苷引起细胞周期阻滞在G1 /GMGC803细胞(图1阶段1 (c))。在细节,20μM和30μM芍药苷治疗胃癌细胞的百分比增加逮捕的G0 /G第一阶段从对照组的38.53%到63.9% 20μ在30 M芍药苷组和78.4%μ芍药苷组(图1 (c))。也很明显,芍药苷诱导的细胞周期阻滞SGC7901胃癌细胞(图1 (c))。

3.4。芍药苷抑制胃癌细胞的迁移和入侵

一条线的证据表明芍药苷抑制细胞迁移和入侵在人类癌症4,14,15]。芍药甙含量来确定调节胃癌细胞的细胞迁移和侵袭性活动,我们利用一个伤口愈合实验测量MGC803和SGC7901细胞的迁移。我们的数据表明,芍药苷治疗抑制胃癌细胞的伤口愈合,这表明芍药苷抑制细胞迁移(图2(一个))。此外,Transwell室试验是利用检测胃癌细胞侵袭性的芍药苷治疗后。我们发现芍药苷推迟胃癌细胞的入侵(图2 (b))。总之,这些结果表明,芍药苷抑制胃癌细胞的能动性。

3.5。芍药苷会使小胡子的表达

据报道,转录共激活剂与PDZ-binding主题(小胡子)是河马信号通路的一个重要因素,它起着至关重要的作用在胃癌发展和进展(16]。因此,我们测试了芍药苷是否可以调节小胡子在胃癌细胞的表达。免疫印迹分析结果表明,芍药苷的小胡子表达水平下调MGC803 SGC7901细胞(图2 (c))。此外,β连环蛋白,小胡子的下游目标,抑制了芍药苷治疗在胃癌细胞(图2 (c))。在一起,这些数据表明芍药苷抑制小胡子在胃癌细胞的表达。

3.6。小胡子过度废除Paeoniflorin-Mediated细胞生存能力抑制和细胞凋亡

接下来,我们进行了救助实验来验证是否参与小胡子芍药苷在胃癌细胞的抗肿瘤活性。胃癌细胞转染与小胡子cDNA上调表达的小胡子,然后用芍药苷治疗72 h。MTT试验的结果表明,过度的小胡子增强MGC803和SGC7901细胞(图的可行性3(一个))。重要的是,过度的小胡子废除了paeoniflorin-induced抑制胃癌细胞(图的可行性3(一个))。此外,我们发现upregulation小胡子抑制胃癌细胞的细胞凋亡(图3 (b))。小胡子获救的超表达paeoniflorin-induced胃癌细胞凋亡(图3 (b))。这些数据表明,小胡子是非常参与了胃癌的芍药苷的抗肿瘤活性。

3.7。小胡子过度降低芍药苷在迁移和入侵的影响

我们检查是否迁移和入侵的抑制芍药苷是由于抑制胃癌细胞的小胡子。我们transwell室试验数据显示,小胡子的超表达促进了胃癌的侵袭性细胞(图3 (c))。增加的小胡子cDNA表达转染废除了抑制胃癌细胞入侵的芍药苷(图3 (c))。MGC803细胞的迁徙活动后发现小胡子cDNA转染和芍药苷治疗72 h。我们的伤口愈合试验表明,小胡子的过度增加胃癌细胞的迁移(图4(一))。小胡子的upregulation废除了paeoniflorin-triggered抑制胃癌细胞迁移(图4(一))。此外,我们的免疫印迹结果表明,过度的小胡子的表达增加β连环蛋白,降低芍药苷治疗在胃癌细胞(图4 (b))。总之,小胡子中扮演着重要的角色在paeoniflorin-mediated抑制胃癌细胞的能动性。

3.8。提高了芍药苷的肿瘤抑制活性差别小胡子对这些

彻底证实小胡子的角色在芍药苷的抗癌活性,小胡子siRNA芍药苷治疗后转染成胃癌细胞。MTT方法是用来测量细胞生存能力,小胡子的差别,我们的数据表明,对这些基因的胃癌细胞的生存能力下降(图5(一个))。此外,小胡子的差别,对这些增强paeoniflorin-induced抑制胃癌细胞(图的可行性5 (b))。此外,小胡子核转染诱导细胞凋亡和促进paeoniflorin-induced胃癌细胞凋亡(图5 (b))。此外,小胡子弱智的差别,对这些基因的胃癌细胞的迁移和入侵(数字5 (c)和6(一))。小胡子的差别明显,对这些促进了抑制胃癌细胞的能动性芍药苷(数字5 (c)和6(一))。小胡子的差别我们西方墨点法的数据表明,对这些增强的抑制β芍药苷在胃癌(图连环蛋白表达6 (b))。综上所述,这些数据表明芍药苷发挥其抗癌作用部分是通过抑制胃癌的小胡子。

4所示。讨论

越来越多的证据表明芍药苷增加抗和减少细胞凋亡在人类癌症细胞4]。一项研究表明,芍药苷通过增强细胞生长抑制和凋亡引发STAT3退化的神经胶质瘤细胞(17]。芍药苷抑制细胞增殖的抑制notch 1在乳腺癌细胞信号通路(15]。此外,芍药苷增强通过抑制细胞凋亡在胰腺癌细胞MMP-9和ERK信号通路18]。杨等人发现芍药苷减少通过失活细胞生长的信号传感器和转录激活3 (STAT3)在膀胱癌(19]。此外,据报道,芍药苷抑制细胞活力和刺激MGC803细胞通过细胞凋亡upregulation mir - 124和失活的磷脂酰肌醇3-kinase PI3K / Akt和STAT3信号20.]。在目前的研究中,我们的研究结果表明,芍药苷抑制细胞在胃癌细胞生存能力,引发细胞凋亡。这一发现表明,芍药苷可能是一个有前途的代理在胃癌抑制肿瘤细胞生长。

一条线的证据表明芍药苷可以延缓细胞运动性在各种类型的人类癌症4,14,15]。一项研究报道,芍药苷抑制乳腺癌细胞的入侵目标notch 1通路(15]。此外,芍药苷阻止细胞迁移和入侵通过转化生长因子的抑制beta-mediated epithelial-mesenchymal过渡在胶质母细胞瘤细胞14]。此外,芍药苷抑制细胞迁移和入侵胃癌相关成纤维细胞通过upregulation mir - 149表达和失活的白介素6 (il - 6) -STAT3-matrix金属蛋白酶(mmp),表明芍药苷可能是一个新代理目标肿瘤微环境(14]。芍药苷的影响对胃癌细胞的迁移和侵袭性并没有被报道。,我们的研究表明芍药苷弱智胃癌细胞的迁徙和入侵活动,表明芍药苷可能是一个潜在的化合物在胃癌抑制肿瘤转移。

几项研究已经表明,芍药苷对肿瘤抑制效果通过不同的分子机制在胃癌(7,14,21,22]。例如,芍药苷抑制NF-kappaB活动的SGC7901胃癌细胞通过预防IkappaB-alpha磷酸化(7]。此外,芍药苷增强胃癌细胞的敏感性5-fluorouracil-mediated凋亡[7]。后续研究表明芍药苷抑制的表达多药耐药性(MDR)通过减少NF-kappaB随后激活和抑制其下游目标,如凋亡,Bcl-XL, SGC7901细胞和bcl - 2,21]。在目前的研究中,我们表明,芍药苷抑制小胡子在胃癌细胞的表达。接受,小胡子是河马的核心效应信号通路。小胡子超表达在胃癌组织和与淋巴转移与肿瘤TNM分期胃癌(8]。此外,小胡子超表达也被观察到在胃印戒细胞癌23]。此外,YAP /小胡子特征作为致癌剂和司机的胃致癌作用通过增加MYC表达式(24]。值得注意的是,小胡子过度参与顺铂耐药性通过诱导胃癌细胞中EMT (25]。这些报告表明,小胡子是胃肿瘤发生和发展的一个重要因素。有必要提到目前的研究有几个局限性。首先,限制是缺乏比较有批准有效的药物治疗胃癌为了研究芍药苷的抗肿瘤效应。第二,芍药甙含量引起的小胡子的差别,对这些评价只有在蛋白质水平的胃癌细胞的免疫印迹分析,应该进行基因表达分析。第三,其他河马信号通路的下游因素应该被评估,以更好地了解胃癌中芍药苷的抗肿瘤活性。4、一个体内研究评估不仅芍药苷的效果,而且其毒性和耐受性之前需要显示一个潜在的用于胃癌患者的治疗。因此,深入调查是必要的,以确定芍药苷的功能和其在胃癌的潜在机制。

5。结论

因为芍药苷抑制小胡子的表达在胃癌,芍药苷可能被视为一个潜在的小胡子抑制剂治疗胃癌病人在未来。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。