文摘
目的。Ephrin B1 (EFNB1) Eph-associated受体酪氨酸激酶配体,建议在神经发育有重要的作用。然而,它的贡献多形性胶质母细胞瘤(GBM)仍不确定。本研究旨在确定预后能力和免疫的影响在GBM EFNB1。方法。我们首次发现不同coexpressed GBM内基因相对于noncarcinoma WGCNA TCGA地理和样本数据库。字符串在线数据库集群和最大中心(MCC)算法在Cytoscape软件被用来设计预测蛋白质相互作用(PPI)和计算主节点,分别。中心的表达基因在癌症和癌组织是由一个在线工具验证基因表达谱(GEPIA)交互式分析。此后,TISIDB在线工具与考克斯相关回归法筛选免疫调制剂与EFNB1和模型与免疫调制剂相关的风险。结果。共201个差异表达基因(度)被发现。之后,10基因中心(CALB2、EFNB1 ENO2, EPHB4, NES, OBSCN, RAB9B, RPL23A, STMN2,和THY1)是整合构建PPI网络。生存分析显示,EFNB1 upregulation预测GBM例可怜的总生存期(OS)。此外,我们开发了一种预后风险签名根据EFNB1-associated免疫调制剂。采用kaplan - meier生存接受者操作特征分析和方法进行分析,这表明我们的签名显示良好的预后预测的准确性。最后,发现EFNB1抑制阻止在GBM细胞细胞增殖和迁移。结论。上述结果表明,EFNB1参与癌症免疫和发展,这是“绿带运动”的候选生物标志物。
1。介绍
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是一种中枢神经系统(CNS)癌症恶性肿瘤高品位和侵略。据世界卫生组织(世卫组织)分类在2016年发表的“绿带运动”是归类为第四级神经胶质瘤1]。如今,医学科学的进步,除了手术、化疗、分子靶向治疗,小说免疫疗法已被添加到多模治疗癌症。免疫治疗在抗肿瘤治疗中逐渐普及。众所周知,PD-1及其配体的发现和应用PD-L1和CTLA-4已经彻底改变了肿瘤的治疗2,3]。近年来,多种免疫疗法已被FDA批准各种肿瘤(4]。不幸的是,GBM患者从免疫疗法中获益(5,6]。这可能是由于其独特的解剖位置,中枢神经系统的淋巴引流,血脑屏障,而复杂的肿瘤免疫微环境,使“绿带运动”容易免疫逃避(7,8]。因此,它具有极其重大的意义,探索潜在的发病机理和发现免疫生物标志物来诊断,治疗和预后预测的“绿带运动”。
EFNB1 (Ephrin B1), Eph-associated受体酪氨酸激酶配体,主要起着核心部分在细胞粘附、血管生成和发展的神经系统9]。外汇基金的异常表达/弗信号在多个肿瘤报道(10]。矩阵metalloproteinase-8 EFNB1刺激分泌,促进癌细胞的入侵(11]。EFNB1与CNK1促进细胞迁移通过激活物,这可能有癌症转移的一个重要功能12]。慢性低氧诱导弹头提高前列腺癌(PC)细胞入侵和迁移通过上调EFNB1 [13]。此外,维米尔等人发现,EFNB1 PTPN13磷酸酶底物,其动员相关ERK1/2磷酸化及其复杂ERBB2介导信号转导和肿瘤细胞的耐药性14]。目前,EFNB1已经很少发表在“绿带运动”,其致癌作用的机制仍不清楚。
在我们的研究中,我们构建了一个基因coexpression网络通过分析mRNA TCGA概要文件获得与WGCNA分析和地理数据库。随后,结合差异表达基因(度)获得“绿带运动”和noncarcinoma样本,我们获得了不同coexpressed基因基因网络,进一步建立了一个中心。EFNB1,“绿带运动”组织中高度表达,从中心筛选基因构建一个免疫调制剂预后模型,可以作为一个新的预后标记和为GBM患者的免疫治疗提供一个新的视角。最后,本研究调查的角色EFNB1致癌作用的体外研究。
2。方法
2.1。数据收集和处理
最初的mRNA表达谱TCGA GBM收集的数据库。与此同时,相应的生存TCGA也获得数据的信息门户。另一个基因资料数据集得到GSE108474的地理数据库。28 GSE108474数据集包含的信息的正常组织和221年与GPL570肿瘤组织进行了研究。此外,我们获得了中国的“绿带运动”病例的临床数据神经胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库的预后模型验证。
2.2。加权基因Coexpression网络分析(WGCNA)
的R应用软件“WGCNA”包生成基因coexpression网络。首先,pickSoftThreshold函数利用屏幕软阈值构造无标度网络的权力,TCGA与数据集3和GSE108474数据设置为4。第二,邻接矩阵和重叠拓扑矩阵(汤姆)生成基于相应的软实力。根据相关的差异(汤姆),我们画了一个层次聚类的分类基因系统树图绝对相关系数高的构造coexpression模块。确定coexpression模块与胶质母细胞瘤的临床资料、临床特征信息和module-trait关系进行了分析。最后,我们选择模块与高相关系数作为候选人coexpression模块进行后续分析。
2.3。筛选度与感兴趣的模块和交互
度搜索相比,“绿带运动”TCGA GSE108474 noncarcinoma样本和数据集,我们发现度的阈值。 采用和| logFC |≥1.0R软件“limma”包。火山情节和热图生成来度使用R包“pheatmap”和“ggplot2”。之后,我们交叉度与coexpression基因获得有趣的模块,和交叉基因被认为是候选预后基因被认为从文氏图。
2.4。PPI网络的识别
预测选择基因的相互作用中,我们使用字符串构建PPI网络的在线工具。在我们的研究中,我们选择的基因显示分数> 0.9网络建设和可视化通过Cytoscape (v3.7.2)。随后,最大小团体中心(MCC)算法在识别中心的Cytoscape软件采用基因。
2.5。基因本体论(去)富集分析
我们进行功能注释的筛选基因的“clusterProfiler”R包, 是选择的标准。
2.6。验证中心基因的表达模式和预后价值
在线工具GEPIA是用来验证中心之间的基因表达癌和TCGA noncarcinoma组织基于GTEx和数据库。为研究协会的操作系统与中心之间的基因“绿带运动”情况下,我们进行了生存率较kaplan meier(公里)分析。 代表统计学意义。
2.7。免疫调制剂分析
探索EFNB1之间的交互和肿瘤免疫系统,免疫调制剂与EFNB1得到从TISIDB数据库(http://cis.hku.hk/TISIDB/)。使用TISIDB在线工具,我们选择immunoinhibitors immunostimulators EFNB1水平显著相关( 在斯皮尔曼相关测试)。
2.8。识别预测模型基于EFNB1-Related免疫调制剂
首先,进行了单变量Cox回归分析评估EFNB1-associated免疫调制剂显著相关操作系统基于 - - - - - -在训练集的值< 0.05。然后,我们执行套索缩小风险过度拟合的回归。最后,我们进行了多变量Cox回归分析构建最优的签名与免疫调制剂有关。为“绿带运动”情况下,他们的风险分数由风险得分= (mRNA 1×水平系数)+ (mRNA 2×系数)+…+ (mRNAn级别×系数)。同时,所有病例分为低收入或高危人群基于平均分数。此外,CGGA数据集被用来验证签名。
2.9。基因集富集分析(GSEA)
GSEA进行探索EFNB1的下游通路。GBM TCGA样本与最高25%,最低25% EFNB1表达式被定义为高、低表达组,分别。根据分子特征数据库7.4版。C1(标志),GSEA被用来获得丰富通路与EFNB1表达式。
2.10。细胞培养和转染
我们培养GBM细胞系(U87 U251)和正常人类的星形胶质细胞(NHA)在地理RPMI 1640行中包含10%胎牛血清(的边后卫,双子座公司)37°C和5%的公司2条件。负控制(si公/ NC)和si EFNB1被RiboBio提供(广州)。补充表S1介绍了si-EFNB1序列。使用Lipofectamine 3000执行细胞转染试剂(表达载体)符合特定的协议。
2.11。RNA提取和定量实时PCR(存在)化验
本研究采用试剂盒试剂(Vazyme生物技术)中提取细胞总RNA的符合特定的协议。之后,我们利用PrimeScript试剂(豆类Bio)准备cDNA通过反转录RNA。结核病绿色试剂(豆类Bio)是用于制备中存在的反应系统StepOnePlus(热费希尔科学)。然后,我们测量mRNA表达基于GAPDH和决定通过水平2−ΔΔCt的方法。补充表S2显示所有基因的引物序列。
2.12。细胞计数Kit-8化验
2000细胞/在RPMI1640培养含有10%的边后卫在96孔板接种。后24、48、72和96 h,我们添加了10μl CCK-8解决方案(Beyotime、上海、中国)培养细胞为另一个2 h 37°C下按照特定的协议。分光光度计(热费希尔科学)是用于测量吸光度值(450海里)。
2.13。集落形成实验
250细胞/分别接种在6-well板块。10天后,细胞发展成可见的殖民地。后轻轻洗细胞用PBS三次,细胞受到30分钟4%多聚甲醛固定在环境温度下结晶紫染色紧随其后。殖民地的图像,并进行菌落计数过程。
2.14。迁移分析
Transwell化验进行钱伯斯(孔隙大小8μm;美国康宁合演集团)。细胞无血清培养系统覆盖在室顶部,而室底部添加10% FBS-containing rpmi - 1640 (500μl)。37°C下孵化24小时后,细胞受到30分钟4%多聚甲醛固定结晶紫染色的另一个30分钟紧随其后。后,细胞在膜表面被淘汰使用棉签。膜的底部表面的细胞被使用显微镜观察(奥林巴斯)放大10×。
2.15。免疫印迹(WB)分析
波形蛋白的蛋白表达,钙N-cadherin,β连环蛋白,GAPDH是由世行分析决定的。的β连环蛋白(8480,1:1000)、波形蛋白(5741,1:1000),N-cadherin(13116, 1: 1000),钙粘蛋白(3195,1:1000)和GAPDH(97166, 1: 1000)抗体提供了细胞信号技术(CST,丹弗斯、马、美国)。
2.16。统计分析
GraphPad (8.0)R用于统计分析软件(4.0)。不同的操作系统之间的生存率较和公里分析进行评估低收入和高危人群。进行了单变量和多变量Cox的分析识别独立预测预后的因素。时间接受者操作特征(t-ROC)曲线进行了分析评估我们的模型在预后预测的准确性。 代表统计学意义。
3所示。结果
3.1。测定WGCNA模块
探索潜在的高度相关的模块,我们首先建立了基因coexpression网络基于GBM-TCGA和GSE108474数据集(数字1(一)和1 (b))。通过执行WGCNA,我们完全获得7模块从GBM-TCGA GSE108474和9(灰色模块不是所有集群是集群除外)。接下来,我们分析了基因模块和临床特征之间的关系(肿瘤和正常)生成相关性的热图。如数据所示1 (c)和1 (d)、青绿色和蓝色模块代表模块正常和神经胶质瘤的临床特征显著相关。
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3.2。微分Coexpression基因的识别
我们发现总共有5289度和2098度筛选从TCGA-GBM GSE108474数据集,分别为(数字2(一个)和2 (b))。基于相关的最重要的是青绿色和蓝色模块观察从上面的热图,我们获得201后续实验(图分割的基因2 (c))。
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3.3。PPI网络的建设
PPI网络的交叉基因是建立基于数据库的字符串。删除无关的节点后,我们81边缘和201节点映射到PPI网络(图3(一个))。此外,我们发现中心通过Cytoscape MCC基因网络。这10中心基因识别包括CALB2、EFNB1 ENO2, EPHB4, NES, OBSCN, RAB9B, RPL23A STMN2, THY1(图3 (b))。
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3.4。重叠基因功能注释
探索重叠基因的生物功能,我们进行分析,包括英国石油(BP)、MF、CC。根据图3 (c),去分析表明BP显著富集的细胞钾离子运输,隐藏在胞质钙离子生产的调制,钾离子跨膜运输。CC分析显示浓缩在神经元胞体,presynapse,轴突部分。此外,度表现出MF浓缩substrate-specific渠道活动。
3.5。基因表达模式的中心
我们进一步验证10 GEPIA中心GBM内基因表达和正常组织的在线工具。与正常组织相比,RPL23A EFNB1, NES,“绿带运动”组织和EPHB4表达明显增加,而CALB2 ENO2, OBSCN, RAB9B, STMN2下调在GBM情况下(数字4(一)- - - - - -4 (j))。根据公里曲线分析,只有EFNB1显著相关的临床结果较差的“绿带运动”( )(数据5(一个)- - - - - -5 (j))。因此,我们选择EFNB1接下来的分析。
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3.6。EFNB1和免疫调制剂之间的联系
检测EFNB1肿瘤免疫活动的角色,我们使用了TISIDB在线工具获取EFNB1-associated免疫调制剂。使用TISIDB数据库后,6 immunoinhibitors (CD160、CD244 CD96、HAVCR2 IL10,和PVRL2)(图6(一))和11 immunostimulators (C10orf54小鼠,测定CD48, CD86, PVR, TMIGD2, TNFRSF14, TNFRSF8, TNFSF13, TNFSF13B,和TNFSF14)(图6 (b))确定在GBM EFNB1显著相关。
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3.7。识别的预后价值EFNB1-Associated免疫调制剂在“绿带运动”
我们进一步进行Cox回归基于套索回归构建预后预测模型,通过融合17 EFNB1-associated免疫调制剂TCGA队列(数字7(一)和77 (b))。共有两种风险基因(小鼠和TNFSF14)被确定为签名(图7 (c))。公式如下:风险得分=(0.3903×小鼠)+ (0.3976×TNFSF14)。km曲线所揭示,高危患者的临床结果较低风险的患者。来验证我们的模型的可信性,我们t-ROC曲线进行分析。此外,CGGA队列证明我们的风险模型构建基于训练集(图8)。单变量和多变量Cox分析调查的独立预后能力风险的签名。从单变量回归了结果,“绿带运动”的风险评分预测系统。此外,根据多元回归,我们构建的独立风险评分预测预后的“绿带运动”(数字9(一个)和9 (b))。类似的结果也验证了CGGA队列(数字9 (c)和9 (d))。
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3.8。抑制EFNB1 GBM减少细胞增殖和迁移
开始,我们验证了微分表达式之间的“绿带运动”(U87 U251)和NHA细胞中存在和WB化验。如数据所示10 ()和10 (b),EFNB1调节GBM细胞相对于NHA细胞,尤其是在U251细胞系。接下来,我们siRNAs申请沉默EFNB1 U251细胞内和qRT-qPCR执行和世行确认其有效性(数据10 (c)和10 (d))。EFNB1的差别我们发现对这些基因的表达显著抑制U251细胞生长和迁移,在CCK8扩散试验,证明集落形成试验和transwell分析(数据10 (e)- - - - - -10 (g))。检测潜在的EFNB1下游通路,GSEA建议Wnt /β连环蛋白通路后浓缩EFNB1超表达(图10 (h))。蛋白质的表达β连环蛋白、波形蛋白和N-cadherin si-EFNB1组明显减少,而相反的观察上皮表达(图10(我))。上述研究结果表明EFNB1的可能的致癌作用在GBM Wnt /β连环蛋白通路。
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4所示。讨论
目前,越来越多的文章表明,异常的信使rna剪切与癌症迁移,细胞增殖,凋亡,血管生成,新陈代谢15- - - - - -17]。因此,信使rna可以用作生物标记来预测预后癌症生物标记。在这个研究中,我们发现候选生物标记,结合生物信息学方法研究的预后价值度筛选等功能丰富,TCGA数据集验证,生存分析,PPI网络的建立。起初,我们进行了系统的微分mrna筛查。GSE108474 TCGA和基因数据集被用来生成由WGCNA coexpression网络。第二,度在癌症样本选自每一个上面提到的两个数据库。之后,我们建立了PPI网络基于分割的基因。功能注释分析显示一个潜在的DEmRNAs在胶质母细胞瘤的发病机制中的作用。去分析表明基因在这个网络主要是参与离子运输的监管机制。重构的钙表达式和活动控制肿瘤的生长和生存通过参与关键的细胞机制和途径,如扩散、迁移,入侵,转移和细胞死亡18]。随后,我们发现10个主要基因从PPI网络中心,其中包括EFNB1, EPHB4, NES, RPL23A, CALB2, ENO2, OBSCN, RAB9B STMN2, THY1。结合生存和微分组织表达分析,EFNB1 upregulation预测的原发性胶质母细胞瘤患者的生存。
癌症的免疫逃避通常创建一个由招聘抑制细胞免疫抑制肿瘤微环境,促进免疫细胞的损耗,从而促进肿瘤的生长(19,20.]。神经胶质瘤患者的免疫治疗仍不理想,迫切需要探索新的免疫检查点的治疗目标。在这项研究中,我们使用了TISIDB在线工具获得17 EFNB1-related免疫调制剂,包括6个免疫抑制剂(CD160、CD244 CD96、HAVCR2 IL10,和PVRL2)和11个免疫刺激性药物(C10orf54,小鼠,测定CD48, CD86, PVR, TMIGD2, TNFRSF14, TNFRSF8, TNFSF13, TNFSF13B,和TNFSF14),其功能分析表明他们EFNB1-mediated免疫相关事件,如淋巴细胞激活、leukocyte-cell附着力,t细胞激活和调节获得性免疫反应。淋巴细胞,人体的免疫反应的一个重要组成部分(21,22]。它包括自然杀伤细胞、T细胞和细胞毒性T淋巴细胞,和所有这些关键因素影响了细胞和肿瘤相关适应性免疫系统(23,24]。白细胞明确表达β2整合素,免疫细胞的细胞间通信的一个关键组成部分,在调节细胞间粘附和执行基本功能和抑制免疫激活25,26]。接下来,我们构建了一个基于EFNB1-related免疫调节剂对GBM二基因签名。我们构造的签名是高度准确的培训和验证数据集。临床特征的基础上,本研究还开发了一个个性化的预测预后列线图。本研究可以提供一个准确和简单的方法,供临床医生评估GBM生存。
此外,我们调查的致癌作用EFNB1 GBM细胞的体外实验。与正常人类星状细胞相比,EFNB1 GBM细胞中表达升高。抑制EFNB1表达能够显著抑制U251细胞的增殖和迁移。击倒的EFNB1导致的低表达β连环蛋白、波形蛋白和N-cadherin和较高的钙粘蛋白的表达,表明EFNB1可能有积极的监管对Wnt信号通路的影响。因此,EFNB1可能扮演一个在GBM pro-carcinogenic作用。
然而,我们的研究有几个缺点。我们的研究主要是基于生物信息学方法。的表达模式EFNB1需要在当地的群组研究中进行验证。此外,我们将进一步探索EFNB1的致癌作用在活的有机体内实验。
总之,我们证明了EFNB1可以作为小说在GBM预后标记。此外,一种新的预后签名是基于开发EFNB1-related免疫调制剂,它可以作为一个独立的预测预后和GBM患者的免疫治疗提供新的线索。
数据可用性
公开的数据集进行分析。这些数据可以发现,TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)、地理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),CGGA数据库(http://www.cgga.org.cn/),TISIDB数据库(http://cis.hku.hk/TISIDB/)。
的利益冲突
所有的作者宣称他们没有利益冲突。
作者的贡献
要哄史和渊源的太阳同样这项工作。陈王要哄Shi构想和设计的原始研究。要哄史和渊源太阳收集和分析数据。要哄史、渊源的太阳和红岩程导致数据的解释。要哄史和渊源起草了手稿。陈Wang和红岩程修订后的手稿。所有的作者进行审核和批准的最终版本的手稿。
确认
作者感谢的核心设施的南京医科大学第一附属医院帮助实验样品的检测。
补充材料
补充表1:目标si-NC序列和si-EFNB1。补充表2:引物用于存在。(补充材料)