mir - 466抑制严重的肝细胞癌的进展通过调节FMNL2-Mediated激活NF -κB和Wnt /β连环蛋白通路

文摘

肝细胞癌(HCC)威胁人类的健康,还有一些证据表明,mir - 466包括某些癌症的进展。本研究关注mir - 466的作用在肝细胞癌的形成和发展。mir - 466的表达水平测量病人的组织和肝癌细胞株中存在,和CCK-8 transwell分析,流式细胞术分析被用来观察mir - 466对肝癌细胞的功能。此外,microrna的数据库,dual-luciferase记者分析,免疫印迹被用于调查mir - 466对肝癌细胞的监管机制。结果表明,mir - 466在肝细胞癌组织和细胞系显著下调,并抑制增殖,入侵和高在肝癌细胞凋亡被发现mir - 466中。结果证实,FMNL2 mir - 466的目标,并增加FMNL2可以反向的影响mir - 466肝癌细胞的表型。除此之外,还发现mir - 466是参与调节NF -κB和Wnt /β通过针对FMNL2连环蛋白通路在肝细胞。总之,这项研究的结果表明,mir - 466规范的活动NF -κB和Wnt /β连环蛋白途径通过针对FMNL2抑制肝癌细胞的发展。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是一个恶性肿瘤,发病率和死亡率高,,全球每年有600000人死于这种疾病(1,2]。最近,一些重大改进取得了在临床诊断和治疗。然而,超过一半的患者的情况已经发展到中、晚期肝癌的感觉明显的不适,和药肿瘤入侵也可以阻碍治疗的患者(3,4]。因此,即使当前的治疗策略,肝细胞癌患者的预后和总体生存率仍不满意(5,6]。尽管取得了伟大的成就在肝癌的发病机制在过去的十年中,肝癌的进展的分子机制并不完全说明(7,8]。因此,有迫切的需求去寻找新颖的分子,为临床诊断和治疗提供更多的策略。

小分子核糖核酸(microrna),非编码RNA的单链核苷酸,年龄在18岁至25岁之间的特点是通过相互作用调节发展的基因翻译3′未翻译区(3′-UTRs)相关的信使RNA (mrna) [9]。microrna参与信号传输和调节细胞的生命活动,如增殖,分化,细胞凋亡10]。多个研究表明,microrna障碍的形成和发展中发挥着重要作用许多疾病包括心血管恶化肿瘤(11,12]。因此,调节一些特殊的microrna的表达被证明是一种很有前途的诊断和治疗系统在临床治疗癌症。的差别的研究表明,对这些mir - 466与卵巢癌上皮和结肠直肠癌的发展,而其作用在HCC尚不清楚13,14]。

在这项研究中,探索试图调查mir - 466的连接和肝癌,揭示了mir - 466对肝癌细胞的表型和监管机制的mir - 466肝癌的进展。

2。材料和方法

2.1。临床组织

伦理委员会批准的这项研究是中医医院的日照,日照,山东,中国,和病人的同意和授权从医院。肿瘤组织和匹配相邻卫生组织捐赠的病人被用于这项研究。所有的组织都是储存在−80°C。

2.2。细胞培养和转染

正常肝细胞株hl - 7702和人类肝癌细胞系包括Hep3B Huh7, HepG2被用于这项研究。所有细胞培养与杜尔贝科修改鹰介质(DMEM Procell生命科技有限公司有限公司,中国)含10%胎牛血清(美国ThermoFisher的边后卫)37°C和5%孵化器有限公司₂。亚文化的细胞进行细胞融合时为90%。

细胞种子6-well盘子,和细胞转染时执行的融合细胞为70%。mir - 466模拟,microrna -控制(miR-NC) pcDNA-FMNL2,和pcDNA-NC被Generay合成生物技术有限公司(上海,中国)。简而言之,4 g的DNA, 100 pmol RNA,或10μl lipofectamine 2000(北京贵族莱德科技有限公司,北京,中国),与250年分别稀释和孵化μ无血清培养系统L为5分钟。稀释DNA或RNA,分别与等距混合稀释lipofectamine 2000然后在孵化25°C为20分钟。500年之后,μL的混合物添加到每个好,然后,细胞培养24小时。

2.3。实时定量逆转录PCR(存在)

mir - 466水平的组织和细胞系中存在测量。试剂盒试剂用于执行组织总rna的提取或肝癌细胞株。总rna浓度的分光光度法测定。之后,总rna转录为cDNA通过PrimeScript®RT试剂盒(美国马萨诸塞州热费希尔)。引物合成和纯化Synbio科技(苏州、中国)。反应系统(10μL)中存在的准备根据操作指令的KAPA存在工具包(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)。U6作为内生控制。使用下列条件:变性在95°C 3分钟,其次是放大40周期在95°C 12年代,40年代在53°C, 70°C 30年代。microrna的相对水平与2计算^−(ΔΔCt)方法。mir - 466和U6引物的合成和纯化由RiboBio有限公司有限公司(广州)。mir - 466的引物序列和U6表1。

2.4。免疫印迹

组织和细胞系中的总蛋白提取与冰盒子里帕缓冲区,和浓度的提取测定由BCA蛋白质分析工具包(ThermoFisher,麻萨诸塞州,美国)。提取的混合四sds - page示例加载缓冲区;然后,提取在100°C煮5分钟。被SDS-polyacrylamide分离的蛋白质凝胶电泳(sds - page),然后转移的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜的湿传递方法。之后,膜被封锁在4°C与5%脱脂牛奶1小时,然后,膜孵化添加了相关的主要抗体在一夜之间在4°C。细胞膜与三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗saline-Tween (TBST)三次(15分钟/次),然后与第二抗体在孵化25°C 1小时。最后,膜TBST清洗和添加了ECL试剂(美国ThermoFisher)三次(10分钟/时间)。之后,表达的蛋白质化学发光检测系统下观察。抗体在以下条件下使用:anti-FMNL2(1: 1000年,ab2540720 ThermoFisher,麻萨诸塞州,美国);反β连环蛋白(1:1000,ab2533039 ThermoFisher,麻萨诸塞州,美国);ab11154198 anti-Wnt(1: 1000年,ThermoFisher,麻萨诸塞州,美国);反P65(1:1000年,ab2533893 ThermoFisher,马萨诸塞州,美国);反p- - - - - -P65(1:1000年,ab10982265 ThermoFisher,马萨诸塞州,美国);和反β肌动蛋白(1:1000,ab2223496 ThermoFisher,麻萨诸塞州,美国)。

2.5。Transwell化验

入侵检测,与身为DMEM基底膜基质被稀释,稀释基底膜基质添加transwells的心房。干燥后,5×10⁴细胞和200μL无血清DMEM被添加进心房,和600年μL的DMEM含有10%的边后卫被添加到细胞室。细胞培养24小时。之后,细胞室的上表面被棉花花蕾,和迁移的细胞在参议院的下表面固定由甲醇为10分钟;细胞被干25°C。这些细胞被沾0.1% w / v结晶紫(Solarbio,北京)30分钟,然后用自来水清洗。入侵细胞计算和莱卡DMi8显微镜下拍照。

2.6。CCK-8化验

细胞(3×10³)被播种到96 -孔板和孵化24小时。转染后细胞进一步孵化24小时。随后,细胞的生存能力(0)24、48和72小时来衡量CCK-8工具包(Amyjet,武汉,中国)。简而言之,10μL CCK-8解决方案添加到每个好,然后,这些细胞被孵化25°C在黑暗中4小时。最后,细胞的吸光度值是衡量标(分子器件、中国上海)。

2.7。Dual-Luciferase报告基因分析

突变或野生3′utr FMNL2序列插入pmirGLO荧光素酶记者向量(沿江生物以北有限公司,中国)建立FMNL2-mutant类型(FMNL2-mut)和FMNL2-wild类型(FMNL2-wt),分别。分别FMNL2-mut或FMNL2-wt cotransfected mir - 466模拟或miR-NC hek - 293 t细胞。在那之后,这些细胞被孵化48小时。最后,mir - 466的约束力和FMNL2 dual-luciferase记者观察到试验系统。

2.8。流式细胞术分析

Huh7细胞收获了胰蛋白酶(0.25%,EDTA-free)。冰的收获细胞被洗了3毫升磷酸盐(PBS)一次,然后被酒精固定。在那之后,1×10⁶与100年的细胞被停职μl孵化的缓冲区。5μL的冰膜联蛋白V-FITC和5μ碘化propidium(π20 Lμg / ml)被添加到管子,然后,在暗细胞孵化了15分钟。最后,细胞的凋亡水平立刻流式细胞术观察到设备(美国新泽西州BD生物科学)。

2.9。统计分析

所有实验进行了至少3次,独立。SPSS 20.0进行分析的数据,数据被绘制GraphPad Prism 8.0。数据的差异与卡方测试或测试方差分析与图基posthoc测试。 意味着两组之间的差异是显著的。

3所示。结果

3.1。mir - 466在肿瘤组织和细胞株显著下调

观察mir - 466之间的联系和肝细胞癌,患者和正常的组织和肿瘤细胞系被用来衡量mir - 466的表达水平。的存在表明,mir - 466明显肿瘤组织中表达下调与paracancerous组织(图1(一), )。此外,mir - 466水平降低也观察到肿瘤细胞系包括Hep3B Huh7,较正常细胞HepG2线(图1 (b), )。

3.2。mir - 466抑制肝癌细胞的增殖和入侵

探索mir - 466肝癌细胞的功能,mir - 466模拟转染到Huh7, CCK-8化验,transwell化验,和流式细胞术分析被用来反映扩散的变化,入侵,凋亡细胞的水平。CCK-8试验表明,扩散Huh7转染和mir - 466模拟明显抑制与细胞转染miR-NC(图2(一个), )。Huh7细胞转染的transwell测定反映mir - 466模拟低侵入性的表达能力与细胞转染miR-NC(图2 (c), )。此外,增加细胞凋亡水平观察细胞转染mir - 466模拟(图2 (b), )。

3.3。mir - 466直接针对3′utr FMNL2

披露的监管机制mir - 466肝癌,TargetScan,一个在线数据库,用于搜索的下游目标mir - 466,和一个dual-luciferase记者分析被用来观察mir - 466的约束力和它的目标。结果表明,FMNL2是mir - 466的潜在目标。dual-luciferase记者试验表明,mir - 466的荧光素酶活性显著降低hek - 293 t细胞转染与FMNL2表示向量(图3(一个), )。除此之外,它也观察到在Hep3B FMNL2非常调节,Huh7, HepG2细胞与正常细胞相比(图3 (b), )。

3.4。FMNL2逆转mir - 466对肝癌细胞的影响

尽管mir - 466的连接和FMNL2证明以上,FMNL2是否参与mir - 466对肝癌细胞的规定仍不清楚。mir - 466模拟和FMNL2表示向量cotransfected入肝癌细胞增殖的变化,入侵,观察细胞凋亡的细胞。CCK-8试验表明,减弱mir - 466诱导增殖的细胞逆转由FMNL2 upregulation(图4(一), )。transwell试验表明,mir - 466的抑制作用细胞的入侵是由FMNL2返回(图4 (c), )。此外,观察到肝癌细胞凋亡水平的增加包括Hep3B Huh7, HepG2诱导由FMNL2 mir - 466获救(图4 (b), )。这些观察建议mir - 466可以通过针对FMNL2调节细胞的表型。

3.5。mir - 466灭活Wnt /β连环蛋白和NF -κ通过针对B FMNL2

FMNL2被证明是一个关键因素在HCC mir - 466的规定。进一步分析mir - 466对肝癌的监管机制,mir - 466模拟和FMNL2 cotransfected进入细胞,蛋白质在Wnt /β连环蛋白和NF -κB途径观察免疫印迹。结果表明,mir - 466显著抑制Wnt的表达式,β连环蛋白,p- - - - - -P65年。然而,这些蛋白质诱导的upregulations mir - 466可以逆转FMNL2(图5, )。

4所示。讨论

肝细胞癌是一种恶性疾病威胁人类的健康,和microrna的障碍已经发现癌症形成的主要原因(15]。mir - 466位于3号染色体上,几项研究已经表明,mir - 466在一些肿瘤细胞明显下调,包括肿瘤的扩散和入侵的规定(16]。在这项研究中,mir - 466的表达水平在肝细胞癌组织和细胞系进行调查,和mir - 466对肝癌细胞的表型,如增殖,入侵,和细胞凋亡也探索。随后,本研究也研究了下游mir - 466的目标,进一步揭示FMNL2在HCC进展的作用。此外,mir - 466对NF -活动κB和Wnt /β连环蛋白通路也说明了本研究。

microrna障碍是一个通用的事件在多个肿瘤,其中一些已成为关键球员在癌症进展,在一些特殊的microrna的表达和干预被认为是一个有前途的癌症治疗策略(17,18]。因此,microrna癌症日益升值的规定(19]。本研究确定,mir - 466肝癌组织和细胞系中表达下调。microrna导致影响新陈代谢,电阻,和其他一些肿瘤细胞的行为20.]。的表达下调mir - 466被发现在一些癌症,它具有抑制作用,抑制某些肿瘤的扩散和入侵(21]。在这项研究中,也发现mir - 466 upregulation不利扩散,入侵,肝癌细胞的生存。

一直考虑的microrna在调节蛋白表达的特点通过相互作用相关的mrna在这项研究。发现formin-like蛋白2 (FMNL2)下游mir - 466倍,并增加FMNL2也观察到在肝细胞癌组织和细胞系。FMNL2密切相关,许多肿瘤的形成和发展,以及致癌性FMNL2已经被一些研究证实。研究指出,FMNL2显著调节在结直肠癌,和FMNL2沉默引起mir - 206 upregulation能明显抑制肿瘤细胞的增殖和入侵(22]。在这项研究中,这是证实增加FMNL2也可以反向的抑制性影响mir - 466增殖,入侵,肝癌细胞的生存。

分子机制的增长、入侵和化疗的抗肝癌已经深入研究。的异常激活细胞信号通路起着至关重要的作用在许多类型的癌症的恶化23]。一项研究表明,mir - 466由LINC01152擦掉,有关差别及其对这些通路的功能障碍,表明差别和mir - 466对这些胶质母细胞瘤患者不良预后和生存的各种形式的(24]。在这项研究中,这是表明,mir - 466 upregulation能有效灭活NF -κB和Wnt /β连环蛋白通路。异常的NF -κB和Wnt /β连环蛋白及其下游广泛涉及因素众多恶性肿瘤包括肝癌。先前的研究已经证实,激活NF -κ由酪蛋白激酶ⅱB诱导β亚基(CSNK2B) upregulation可以促进肝癌的无限增长和入侵(25]。本研究发现mir - 466 upregulation调解是一个独立的因素NF -的失活κB和Wnt /β连环蛋白通路。此外,研究结果也支持,mir - 466在NF -的影响κB和Wnt /β由FMNL2连环蛋白通路可以逆转。杨等人发现FMNL2显著调节在结直肠癌细胞,这可能会进一步规范NF -的激活κB和调解通过减少癌细胞的入侵COMMD10[的稳定性26]。此外,一项研究也表明,FMNL2可以激活Wnt /β连环蛋白驱动大肠癌的发展(27]。因此,这些观察表明,增加mir - 466能有效灭活NF -κB和Wnt /β通过针对FMNL2连环蛋白肝癌细胞的途径。

这项研究揭示了mir - 466的作用在肝癌的进展和证实的监管影响mir - 466 / FMNL2 NF -κB和Wnt /β连环蛋白通路。总之,它表明NF - mir - 466使其失去活性κB和Wnt /β连环蛋白通路通过针对FMNL2抑制肝癌的进展。然而,是否FMNL2水平的变化是一个独立的原因mir - 466对肝癌细胞的表型和信号通路调节仍然未知。因此,更多的证据是必要的从体内实验证实本研究的假设。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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